Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

42 страницы

319.00 ₽

Купить МУК 4.2.3222-14 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические указания регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер. Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций, индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

  Скачать PDF

Заменяет МУК 3.2.987-00

Оглавление

1. Область применения

2. Общие положения

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.5. Окраска препаратов крови

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

5. Микроскопическая диагностика возбудителей малярии и бабезиозов

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов, возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием химиотерапевтических препаратов

5.5. Источники диагностических ошибок

5.6. Оценка интенсивности паразитемии

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля и направления результатов на подтверждение

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты).

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Приложение 1. Необходимые реактивы и оборудование

Приложение 2. Возбудители паразитозов под воздействием противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях

Приложение 3. Элементы крови, контаминанты и образования, симулирующие малярийных паразитов

Приложение 4. Приготовление толстой капли на плёнке для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981)

Показать даты введения Admin

С МУК 4.2.3222-14 покупают: МУК 4.2.3145-13, СП 1.3.2322-08

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов

Методические указания МУК 4.2.3222-14

ББК 51.9 Л12

Л12 Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов: Методические указания.—М.: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора,— 43 с.

1.    Разработаны Научно-исследовательским институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета (МГМУ) им. И. М. Сеченова (В. П. Сергиев. С. А. Рабинович. Е. Н. Морозов. Е. В. Максаковская. М. Н. Лебедева): кафедрой тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первого Московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова (И. В. Кукина. Л. Ф. Морозова): Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (Т. М. Гузеева): ГБОУ ДПО -Российская медицинская академия последипломного образования» Мин права России (М. С. Орлов); ФБУЗ -Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т. Г. Сыскова): ГБОУ ДПО РМАПО (А. Е. Беляев. Ю. П. Горбунова); Управлением Роспотребнадзора nor. Москве(Т. Н. Иванова); ФБУЗ-Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. И. Тимошенко): Инфекционной клинической больницей № 2 г. Москвы (В. Д. Сады ко ва).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 22 сентября 2014 г.

4.    Разработаны взамен МУК 3.2.987—00 «Паразитологическая диагностика малярии».

ЬЬК 51.9

© Роспотребнадзор, 2015

© Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2015

МУК 4.2.3222-14

4.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского—Гимзы

Оптимальную концентрацию рабочего раствора и время окрашивания нужно подобрать самостоятельно, так как они зависят от качества маточного раствора краски и от температуры окружающей среды.

1.    Маточный раствор краски Романовского—Гимзы (промышленного изготовления или приготовленный из сухой смеси) перемешать и обязательно профильтровать.

2.    Непосредственно перед употреблением приготовить 5% (10%) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски (соответствует 1—2 каплям краски на 1 мл раствора).

3.    Готовый рабочий раствор перемешать.

4.    При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20 % раствор, сократив время окраски до 15—20 мин.

Рабочий раствор краски Романовского-Гимзы для окрашивания препаратов крови использовать в течение 1 ч!

Для определения качества маточного раствора краски Романовского-Гимзы каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроско-пировании:

-    ядра лейкоцитов фиолетового цвета с различной структурой хроматина;

-    зернистость базофилов фиолетового цвета;

-    зернистость эозинофилов оранжево-красного цвета;

-    у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть вишневокрасная зернистость;

-    зрелые эритроциты - розового цвета с сероватым оттенком;

-    ретикулоциты - синевато-голубые;

-    тромбоциты - сиренево-розового цвета с ра зличимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского-

Гимзы недостаточно а зура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мэнсона, которую готовят заранее следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2.5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10—12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40—60 мин при 60—80 *С.

Раствор не кипятить!

Синька Мэнсона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мэнсона. добавляемое к рабочему раствору краски Романовского-Гимзы, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

4.5.2. Способы окрашивания и промывки тонкого мазка и толстой капли по Романовскому—Гимзе

Окрашивание препаратов крови, в зависимости от их количества, можно проводить двумя способами:

1. Препараты крови вертикально помешают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ окраски наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контей-

нере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску нельзя.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно наносят краску. Этот способ окраски чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход рабочего раствора краски составляет примерно 4 мл на I препарат. Вместе с тем. при таком способе есть риск выпадения осадка, что может затруднить микроскопию.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды и концентрации рабочего раствора краски. Так. например, при температуре 20—23 вС тонкий мазок окрашивают 40—50 мин, толстую каплю - 20—25 мин 10 %-м раствором краски. При менее высокой температуре время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30 °С) время окрашивания капель, но не мазков. может быть сокращено до 15 мин. Толстые капли, предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6—10 мин.

Препараты крови на малярию окрашивают и исследуют немедленно после взятия в режиме «ОТО!*

Промывку тонких мазков, фиксированных до окраски, проводят под струей проточной воды из пипетки или погружением в емкость.

При промывке толстых капель необходима осторожность, так как капли могут оторваться от стекла. Кроме того, на поверхности раствора образуется оксидная плёнка, которая при сливании краски неизбежно останется на препарате. По этой причине необходимо не выливать краску из контейнера, но вытеснять её. подставив контейнер под слабую струю воды. При окраске на рельсах препарат, не сливая краску, медленным движением погружают в емкость с чистой водой 1—2 раза и высушивают в вертикальном положении.

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив х90 или х100, окуляр х7, х8 или х10. с поднятым конденсором и полностью открытой диафрагмой.

С диагностической целью сначала ми крое копируют толстую каплю, затем, при необходимости, для уточнения вида возбудителя — тонкий мазок.

Правильно приготовленная и окрашенная толстая капля должна иметь светлый фон без нитей фибрина и осадка краски.

При нормальной толщине капли в каждом поле зрения должно быть 10—15 лейкоцитов. Обязательно нужно просмотреть краевую зону, более тонкую часть толстой капли, где эритроциты не полностью гемолизированы и может сохраниться неизмененная морфология паразита и пораженного эритроцита, что облегчит дифференциальный диагноз. Если вероятность малярии у пациента велика, а паразиты не выявляются, повысить эффективность выявления паразитов лучше просмотрев вторую каплю, а не увеличивая время просмотра той же самой капли. Унифицировать время просмотра толстой капли невозможно, так как оно зависит от опыта микроскоп иста, качества препарата и др.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра 100 полей зрения толстой капли. 0|рицагелы1ый диагноз не может считаться достоверным, если исследован только тонкий мазок.

При отрицательном первичном результате, но высокой вероятности (анамнестических, эпидемиологических, клинических показаниях) наличия малярии у пациента кровь исследуют повторно через 6—12—24 ч. При плохом качестве приготовления толстой капли исследование крови повторить немедленно.

После первого обнаружения паразитов исследование продолжают для того чтобы:

-    определить видовую принадлежность паразитов;

—    указать, какие стадии паразитов найдены (только в случае Р. falciparum);

МУК 4.2.3222-14

—    указать наличие или отсутствие гаметоцитов в случае тропической малярии;

—    указать количество паразитов, руководствуясь одним из предлагаемых ниже методов;

—    не пропустить смешанную инфекцию.

В тонком мазке для обнаружения малярийных паразитов исследуют участок, где эритроциты расположены в один слой — бахромчатую и прилегающую к ней зону - так называемый хвост препарата.

При просмотре тонкого мазка используется метод «зубчатая стена»: просмотр края мазка последовательными вертикально-горизонтальными передвижениями препарата.

5. Микроскопическая диагностика возбудителей малярии и бабезиозов

Определение вида основано на совокупности ряда признаков как самого паразита. так и пораженного эритроцита.

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

Последовательность установления диагноза при малярии следующая:

-    решается вопрос, есть ли паразиты;

-    решается вопрос, не Р. falciparum ли это;

-    находят характерные стадии, позволяющие дифференцировать три остальных вида;

-    определяют вид;

-    если установлено, что речь идёт о Р. falciparum. решают, присутствуют ли гаметоциты.

Plasmodium vivax

Кольцевидные и амебовидные трофозоиты


Кольцевидные трофозоиты.

Кольца обычно немногочисленны. крупнее, чем у Р.falciparum.

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. В периферической крови могут быть обнаружены все формы эритроцитарной шизогонии. Интенсивность паразитемии редко превышает 20 тыс. паразитов в 1 мкл крови. При нарастании паразитемии синхронность утрачивается, характерен полиморфизм — одновременное наличие разных возрастных стадий бесполых форм паразита и гаметоцитов. Встречается поражение одного эритроцита несколькими паразитами, но реже и в меньшей степени, чем в случае Р. falciparum. Пораженные эритроциты увеличиваются тем больше, чем старше паразит, иногда в 1.5 раза. По мере развития паразита эритроцит обесцвечивается, иногда приобретает неправильную форму, на поверхности эритроцита появляется мелкая, обильная, неравномерная азурофильная зернистость, так называемая зернистость Шюффнсра.

Мерозоиты. внедрившиеся в эритроциты. преимущественно в незрелые, превращаются в юные кольцевидные грофозоиты.

Более юные занимают !/б пораженного эритроцита, более взрослые — У4- Ядро округлое, реже несколько вытянутое, относительно плотное. Вакуоль хорошо выражена. В цитоплазме у растущих колец нередко появляются утолщения в одном из участков. Пигмент — отдельные нежные мелкие зерна, темно-коричневые.

У наиболее молодых ядро и цитоплазма резко уплотняются; цитоплазма в виде комочка, иногда несколько изогнутой формы, напоминает в сочетании с ядром «запятую». У несколько более крупных колец цитоплазма разрывается на удлиненные полоски, которые в сочетании с ядром могут напоминать «восклицательный знак», «ласточку». При обнаружении в препарате только единичных юных колец определение вида паразита затруднено.

Амебовидные трофозоиты. Цитоплазма разорвана на фрагменты разного размера, располагающиеся вблизи ядра. Редко сохраняется вакуоль.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола, иногда с различимой зернистостью Шюффнера, на периферии капли или на тонком мазке крови при приготовлении толстой капли на тонком мазке. Это так называемые тени, выраженность которых зависит от достаточного содержания азура в краске.

Амебовидные трофозоиты занимают 1/з— 1/2 эритроцита, более зрелые — его значительную часть. Ядро круглое или овальное, крупнее и менее плотное в сравнении с кольцевидными трофозоитами, расположено периферически. Цитоплазма разнообразной формы с псевдоподиями, отражающими присущую этим стадиям амебоидную активность - это определило название вида паразита (viva означает живой, подвижный). Наиболее молодые имеют несколько длинных тонких псевдоподий, количественно увеличивающихся по мере роста, придавая паразиту причудливую форму. Пигмент — отдельные нежные зерна темно-коричневого цвета, в разных участках цитоплазмы. Вакуоль относительно крупная, встречается так называемая добавочная вакуоль — артефакт, результат слияния концов двух псевдоподий при приготовлении и последующей фиксации мазка крови. Пигмент темно-коричневый. расположен чаще диффузно в цитоплазме, иногда концентрируется вокруг вакуоли или по периферии паразита. По мере роста паразита вакуоль постепенно уменьшается, псевдоподии сглаживаются.

Развивающиеся и зрелые трофозоиты

Тонкий мазок

Толстая капля

' ё ■

& Ь л * Ь л Ч *


Развивающиеся трофозоиты.

В толстой капле развивающиеся трофозоиты разнообразной фор-

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии юных колец эритроцит почти не увеличен, появляются мелкие, едва различимые единичные зерна Шюффнера. На стадии более молодых амебовидных трофозоитов размеры эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера нарастают.

Развивающиеся трофозоиты. Утрачивают псевдоподии, округляются, уменьшается размер вакуоли, увеличивается масса ядра и

МУК 4.2.3222-14


цитоплазмы. Пигмент становится более выраженным и обильным.

Зрелыетрофозоиты. Занимают значительную часть сильно увеличенного эритроцита, форма округлая или овальная без псевдоподий и вакуоли. Ядро относительно крупное, рыхлое, чаше несколько вытянутое, иногда дугообразное. Цитоплазма занимает основную часть эритроцита. Пигмент хорошо выражен, расположен диффузно или концентрируется по периферии паразита, может группироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии развивающихся и зрелого трофозои-та увеличение эритроцита достигает максимального размера с четко рахпичимой зернистостью Шюффнера.


мы и размера. Цитоплазма обычно разорвана, в зависимости от возраста паразита около ядра концентрируются 2 и более фрагментов цитоплазмы. Иногда сохраняется большая вакуоль. Зрелые трофозоиты сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но резко сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты. толстая капля).


Развивающиеся (незрелые) шизонты


Развивающиеся шизонты округлой или овальной формы, без вакуоли и псевдоподий занимают значительную часть эритроцита. В неразделившейся цитоплазме от 2 ядер, уменьшающихся в размере и увеличивающихся в количестве по мере их деления. Пигмент начинает концентрироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. Максимально выражено увеличение пораженного эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера.


Нашивающиеся шизонты. Сохраняют особенности морфологии «тонкого мазка», но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).


Зрелые шизонты


Тонкий мазок

г: ***', Ля

VY

ш4(У

л?. ».*



Зрелые шизонты. Занимают почти весь или весь эритроцит. Содержат 14—18 (в среднем 16) относительно мелких мерозои-тов, расположенных асимметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление. Мерозоит конической


Зрелые шизонты. Сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в


или овальной формы не свыше 2 мкм в диаметре, ядро мелкое и плотное, расположено апикально.

виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля)

Сегментоядерный лейкоцит и тромбоциты представлены для сопоставления масштаба.

Состояние пораженных эритроцитов. К моменту образования мерозоитов. пораженный эритроцит разрывается, в отдельных случаях может еше сохраняться с видимой зернистостью Шюффнера.

Толстая капля

d ? *

4

?

~4


Гонкий мазок

4


Женские гаметоциты округлые, компактные, не всегда отличимы от зрелых трофозоитов.

Мужские гаметоциты легко распознаются в результате особенности их деформации в толстой капле. Ядро уплотняется и превращается в относительно крупное округлое образование. Цитоплазма также уплотняется и как «венчик» окружает ядро. На фоне цитоплазмы четко выявляются многочисленные зерна пигмента.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).

Гаметоциты

Женские гаметоциты. Округлые или овальные занимают весь пораженный эритроцит. Ядро относительно плотное, округлое или вытянутое, расположено асимметрично, реже в центре клетки. Размер ядра варьирует. Периферия ядра иногда окрашена менее интенсивно, создавая «зону просветления».

Цитоплазма окрашена в более интенсивный сине-голубой цвет в сравнении с бесполыми формами, вакуоли нет. Пигмент — обильный, мелкие интенсивно окрашенные гранулы или грубые зерна, рассеянные по цитоплазме, имеющие более коричневый оттенок в сравнении со зрелыми трофозоитами. Женские гаметоциты иногда трудно дифференцировать со зрелыми трофозоитами.

Мужские гаметоциты. Несколько уступают в размерах женским гаметоцитам. Ядро крупное, рыхлое с просветлениями, без четких границ, диффузное, иногда различимо с трудом. Имеет более светлую или яркую окраску в сравнении с женским гаметоци-том. Иногда на фоне ядра обнаруживаются отдельные скопления хроматина, имеющие более интенсивную окраску. Цитоплазма с розовым оттенком. Пигмент - мелкие обильные гранулы или грубые зерна яркой коричневой окраски, рассеяны по цитоплазме с тенденцией к концентрации вокруг ядра.

Состояние пораженных эритроцитов.

Эритроцит увеличен, по периферии паразита видна зернистость Шюффнера.

Plasmodium falciparum

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. При неосложненном течении в периферической крови обнаруживаются

16

МУК 4.2.3222-14

Содержание

1.    Область применения.....................................4

2.    Общие положения......................................4

3.    Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов..............5

4.    Техника паразитологической (микроскопической) диагностики

малярии и бабезиозов ......................................5

4.1.    Подготовка предметных стекол ...........................5

4.2.    Приготовление и хранение реактивов........................6

4.3.    Взятие проб крови для исследования на малярию.................7

4.4.    Приготовление препаратов крови, их маркировка и    фиксация.........7

4.5.    Окраска препаратов крови..............................10

4.6.    Микроскопия окрашенных препаратов крови..................12

5.    Микроскопическая диагностика возбудителей мазярии и бабезиозов.......13

5.1.    Морфологические признаки возбудителей малярии..............13

5.2.    Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию...............24

5.3.    Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов,

возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови.......25

5.4.    Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием

химиотерапевтических препаратов............................25

5.5.    Источники диагностических ошибок.......................26

5.6.    Оценка интенсивности паразитемии........................26

5.7.    Учет результатов исследования и оформление ответа..............28

5.8.    Порядок исследования препаратов крови, контроля

и направления результатов на подтверждение......................29

5.9.    Паразитологический контроль за эффективностью лечения.........31

5.10.    Морфологические признаки возбудителей бабезиозов............32

6.    Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты)......34

7.    Полимеразная цепная реакция (ПЦР).........................35

npiuoxcemie I. Необходимые реактивы и оборудование.............37

Прнюжение 2. Возбудители паразитозов под воздействием

противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях.......38

Прнюжение 3. Элементы крови, контаминанты и образования.

симулирующие малярийных паразитов........................41

Пртожение 4. Приготовление толстой капли на плёнке

для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981).............42

3

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федератьной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

22 сентября 2014 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов

Методические у казания МУК 4.2.3222-14

1. Область применения

1.    Методические указания (далее - МУК) регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер.

2.    Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций. индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

2. Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных, а также местных случаев заболевания требует своевременной лабораторной диагностики, необходимой для лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера (географический анамнез - пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера (лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки) обязывают врачей лечебно-профилактических организаций заподозрить малярию. Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Диагностика возбудителей бабезиозов вводится в целях дифференциальной диагностики с возбудителями малярии, в частности, с Р. falciparum. Поскольку, несмотря на различия в жизненном цикле возбудителей малярии и бабезиозов. они имеют ряд близких особенностей по морфологии некоторых стадий развития возбудителей в эритроцитах и по клиническим проявлениям инфекции. Ошибочная диагностика может привести к летальному исходу.

МУК 4.2.3222-14

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

Диагностика малярии основана на обнаружении кровяных форм паразитов (трофозоиты, шизонты и гаметоциты) при микроскопическом исследовании крови. В настоящее время не предложено способов обнаружения гипнозоитов: ни иммунологических, ни паразитологических. Для обнаружения эритроцитарных форм плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом тонкого мазка и толстой капли, окрашенные по методу Романовского-Гимзы. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод — толстая капля. В толстой капле форменные элементы располагаются многослойно. В результате за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30—40 раз большее, чем в тонком мазке, что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой пара-зитемии. Чувствительность метода толстой капли такова, что при просмотре 100 полей зрения можно обнаружить паразитов при их численности около 8 в 1 мкл крови. Начинать надо всегда с просмотра толстой капли.

Толстую каплю окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, в результате чего паразиты становятся доступными для выявления. Однако при этом паразиты подвергаются деформации.

Толстая капля может позволить выявить и других паразитов крови: бабезий. трипаносом, микрофилярий. спирохет. В тонком мазке, фиксированном до окраски. сохраняются морфологические особенности, присущие данному виду паразита, и характерные изменения пораженного эритроцита. Тонкий мазок крови делают в дополнение к толстой капле.

Дифференциальное определение вида малярийного паразита проводят по совокупности признаков: морфологии паразита, состоянию пораженных эритроцитов, соотношению стадий паразита, обнаруженных в периферической крови.

Кроме того, в настоящее время широко используются для лабораторной диагностики малярии иммунологические (экспресс-тесты) и молекулярно-биологические методы. Данные методы являются взаимодополняющими, но «золотым» стандартом остается метод микроскопии толстой капли.

Основным методом диагностики бабезиозов является микроскопическое исследование препаратов крови — толстой капли и тонкого мазка. Однако при диагностике инфекции В. microti, характеризующейся низкой или субмикроскопической паразитемией, одна микроскопия при отрицательном результате может создать ложное представление, поэтому применяют и другие методы. Проводится иммунологическое исследование для обнаружения специфических антител с применением иммунофлюоресцентной методики (РИФ), а также молекулярнобиологическим методом - полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяющей выявить единичные особи паразита. Для выявления низкой и субмикроскопической паразитемии проводится заражение хомяков кровью больного - изодиагностика; заболевание хомяков наступает спустя 1—4 недели.

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать запрещается, так как имеющиеся на них царапины могут затруднить диагностику и даже привести к диагностическим ошибкам.

Следует пользоваться только новыми стёклами и. предпочтительно, очищенными при изготовлении (precleaned) и готовыми к употреблению.

5

Использование новых стекол рентабельнее, так как устраняется трудоёмкий ручной процесс и гарантируется качество.

Если новые стёкла поставлены неочищенными, то их очищают следующим образом:

1.    Новые предметные стекла замачивают в мыльном растворе, нагретом до 60 вС, не кипятят.

2.    Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3.    Промывают в проточной воде в течение 2—Зч, периодически перемешивая.

4.    Погружают в дистиллированную воду на 30 мин; при отсутствии возможности протереть стекла в тот же день, их оставляют в холодильнике в дистиллированной воде до следующего дня.

5.    Качество отмывки предметных стекол от щелочи проверяют нанесением на предметное стекло 1 капли фенолфталеина — появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6.    Стекла вытирают чистой хлопчато-бумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло) или спирт 70% где они могут храниться в течение длительного времени.

7.    Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую бумагу небольшими партиями, оптимально по 6 штук — на одного больного.

Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.2.1. Раствор краски Романовского-Гимзы

Маточный раствор краски Романовского-Гимзы представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить в течение срока годности в сухом, защищенном от света, прохладном месте (но не в холодильнике). Для определения качества маточного раствора краски Романовского каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Рабочий раствор краски Романовского готовят непосредственно перед употреблением из маточного раствора. Рабочий раствор должен быть использован в течение 1 ч, хранить его нельзя. Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимзы необходимое количество маточного раствора краски отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя через бумажные фильтры, так как при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Этот раствор безводный и портится от попадания воды, поэтому не следует отбирать его пипеткой из-за риска контаминации водой, а следует отливать через горлышко.

4.2.2. Буферный раствор

Необходимые реактивы:

1.    Дистиллированная вода - 1 л.

2.    Фосфат калия однозамещенный безводный - КН2Р04 - 0,27 г.

3.    Фосфат натрия двузамещенный безводный - Na2HP04 - 0,67 г.

Техника приготовления:

1.    Соли растворить в дистиллированной воде (*/з объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1,0 л.

2.    Приготовленный раствор должен иметь pH (7.0 ± 0.2). Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если pH < 6.8. то следует добавить Na2HP04. если pH > 7.2. то добавляется КН2Р04. Количество реактивов. необходимых для доведения pH. подбирают опытным путем.

МУК 4.2.3222-14

Лучше использовать готовые таблетки фосфатного буфера (диапазон pH 7.0— 7,2).

Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Нельзя использовать старый буферный раствор с осадком или зазеленевший от развития водорослей. При искажении цвета окрашенных элементов крови следует проверить pH буферного раствора.

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1.    Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых - обычно безымянного, у детей - из большого), у новорождённых детей - из большого пальца ноги (но не мочки уха!). Использовать венозную кровь можно только в случаях, если известно, что в качестве антикоагулянта применяли ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), другие антикоагулянты, такие как гепарин, цитрат, не должны быть использованы, так как они могут влиять на морфологию паразитов.

2.    Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений. Распространено неверное мнение, что для обнаружения малярийных паразитов кровь у больного следует брать на высоте приступа.

3.    Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4.    Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70 %-м спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

5.    Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы и збежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

6.    Последующие капли (выступающие самостоятельно или при легком надавливании на палеи массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. Кровь набирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла.

7.    От одного пациента готовят не менее 3 стекол с толстыми каплями и 3 тонких мазка крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.4.1. Препарат толстая катя

Препарат толстая капля готовится следующим образом:

—    на предметное стекло наносят 2 капли крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерные диски диаметром 1,0—1,5 см с помощью угла чистого стекла или в прямоугольники с помощью скарификатора, которым прокалывали кожу;

—    между каплями делается мазок в виде полоски дзя маркировки препарата отдельного пациента, при массовых обследованиях делаются две полоски: на одной полоске указывается Ф.. И.. О. и дата взятия крови, на другой — название лечебно-профилактического учреждения (код), где проводилось обследование;

—    на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;

—    сразу после приготоатения мазка, пока он не высох, наносят кровь из капилляра или апажной поверхностью мазка прикасаются к выступившей капле крови;

—    приготовленный препарат кладут на горизонтальную поверхность, капля крови распределяется по влажному мазку, величина капель зависит от количества крови и ее реологических свойств (вязкость).

7

• I •!


Рис. I. Толстые капли на предметном стекле без мазка

Рис. 2. Толстые капли на мазке


Толщина толстой капли должна быть такой, чтобы через нее после высыхания просматривался газетный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат не пригоден для исследования. Маркировка препарата производится на мазке крови между каплями.

Толстая капля на мазке имеет преимущества, так как на мазке чаще сохраняются нс полностью гемолизированные эритроциты, что может помогать дифференциальному диагнозу, поскольку в мазке, несмотря на гемолиз, могут сохраняться азурофильные элементы в эритроцитах (зернистость Шюффнера, Джеймса и пятнистость Маурера). Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло.

Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в толстой капле является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10—20 лейкоцитов (увеличение: объектив х90—хЮО. окуляр х7; х8; хЮ).

Комбинированные препараты.

В особых условиях при дефиците стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят тонкий мазок и толстую каплю.

Рис. 3. Комбинированное приготовление препаратов крови


Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходимо начинать с окраски толстой капли погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют тонкий мазок и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации тонкого мазка, так как даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен тонкий

8

МУК 4.2.3222-14

мазок, в толстой капле эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.

Высушивание толстых капель на солнце, огне или любом другом источнике тепла неконтролируемой температуры исключается, так как вследствие фиксации необходимый при окраске гемолиз не происходит и препарат становится непригодным для исследования.

Толстые капли (особенно в процессе высыхания) и фиксированные тонкие мазки следует беречь от тараканов, мух и муравьев.

4.4.2. Препарат тонкий липок

Препарат тонкий мазок делают так же, как для подсчета формулы крови.

1.    На край предметного стекла, отступив 0.5—1.0 см. наносят небольшую каплю крови.

2.    Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа1.

3.    Двумя пальцами левой1 руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4.    Край шлифованного стекла (фиксированного в правой1 руке) ставится под углом 45е к предметному стеклу, прикасаясь к левому1 краю капли крови.

5.    После того как капля растекается по линии касания в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево1 к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить тонкий мазок бахромчатой частью, где эритроциты располагаются в один слой свободно, не налегая друг на друга, где четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить приблизительно на l/з стекла до конца и краев предметного стекла (рис. 4).

Рис. 4. Тонкий мазок крови

Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это может маскировать некоторых паразитов, а также приводить к их деформации), если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка.

Качество тонкого мазка зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.

На плохо вымытом, жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла тонкий мазок получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис. 5.

Рис. 5. Дефекты приготовления тонких мазков

4.4.3. Маркировка препаратов крови

1.    Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания) или маркером, устойчивым к спирту.

2.    Маркировка включает фамилию и инициалы, номер истории болезни или порядковый номер по списку обследуемого, дату и время взятия крови.

3.    Препарат толстая капля, приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4.4.4. Фиксация тонких мазков

1.    Фиксацию мазков проводят путем погружения: этиловым спиртом 96е — 10 мин либо смесью Никифорова — 20 мин, фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду — 2—3 мин.

2.    Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

3.    Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

4.    Препарат толстая капля на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5.    Тонкий мазок маркируют в толстой части, не захватывая тонкую часть и края препарата (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

Препарат толстая капля не фиксируют!

При длительном хранении неокрашенных толстых капель при массовых эпид-обслсдованиях в очагах (особенно в жарком климате) может произойти их фиксация. При необходимости хранения толстых капель для предотвращения фиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na2HP04 + I г КН2Р04 + 300 мл дистиллированной воды). Толстую каплю после высыхания погружают в этот раствор на 1 с, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием такую толстую каплю окрашивают по Романовскому-Гимзс меньшее время, чем обычно - в течение 6—10 мин.

4.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови. Окраску препаратов крови на малярию рекомендуется проводить в вытяжном шкафу, так как в состав краски и фиксаторов входят летучие токсические вещества.

1

Для лаборанта-лсвши вместо левого положения - читать правое, вместо правого - левое.

9