Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

37 страниц

Купить МР 02.036-08 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации устанавливают метод идентификации бактерий, выделенных из пищевых продуктов и продовольственного сырья и подозрительных на принадлежность к роду Salmonella, роду Campylobacter, роду Listeria, серотипу E.coli O157:Н7, на основе полимеразмерной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

  Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Сущность метода

3 Общие положения

4 Аппаратура, материалы и реактивы

5 Подготовка к анализу

5.1 Приготовление растворов и реактивов

5.2 Приготовление питательных средств

6 Выделение и накопление биомассы бактериальных культур, подвергаемых идентификации

7 Подготовка образцов чистых культур к анализу

8 Проведение лизиса и выделение ДНК

9 Подготовка к проведению ПЦР

10 Амплификация и детекция

11 Оценка результатов

12 Особенности проведения работ в ПЦР-лаборатории, контроль за контаминацией

13 Библиографические ссылки

Показать даты введения Admin

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

Лабораторный совет Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благ ополучия человека

Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы ВАХ® System Q7

Методические рекомендации № 02.036-08

Издание официальное

Москва

2008

Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы ВАХ^ System Q7: Методические рекомендации. -vT: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Федеральный гентр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защи-ы прав потребителей и благополучия человека, 2008. - 37 с.

Разработаны:

~У НИИ питания РАМН (Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Булахов А.В.); при частии ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной био-ехнологии» (Титов Е.И., Нефедова Н.Е., Ананьева Н.В.)

Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Роспотребнадзора протокол № 2 от 25.06.08 ).

Утверждены и введены в действие Председателем лабораторного совета, лавным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И.Верещагиным 8.08.2008 г.

Введены впервые.

2

Используют готовую основу среды промышленного изготовления указанн го состава. Приготовление осуществляют согласно прописи на этикетке. Раств ритъ порошок сухой основы в дистиллированной воде. При необходимости п догреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавир вагшем при температуре 121 °С в течение 15 минут. Разлить по пробиркам из ра чета 10 мд на 1 пробирку. pH среды после автотлавирования (при 25°С) 7,0 ± 0,2 5.2.5 Колумбийский кровяной агар (неселективный).

Состав основы среды.

Ингредиенты

Количество,

г/л

Пептон (специальный)

23,0

Крахмал кукурузный

1.0

Натрия хлорид

5,0

Агар-агар

15.0 “1

Используют готовую основу среды промышленного изготовления указанн го состава. Приготовление осуществляют согласно прописи на этикетке. Раств рить порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Подогреть р кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием nj температуре 121°С в течение 15 минут. Остудить до 40-50°С и асептически вн ста 70 мл стерильной дефибринированной крови барана, тщательно перемешать разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мл. pH среды после автоклавирован (при 25°С) 7,3 ± 0,2.

5.2.6. Трехсахарный железосодержащий агар.

Допускается использование двух модификаций среды: ТСА и среды №13.

Состав сред:

Ингредиенты

Количество, г/л

Среда №13

Среда ТСА

Пептический перевар животной ткани

10,0

20,0

Гидролизат казеина

Го.о

-

(Дрожжевой экстракт

3,0

3,0

jМясной экстракт

3,0

3,0

|Лактоза

10,0

10,0

(.Сахароза

10,0

10,0

j Глюкоза

1,0

1,0

;Натрия хлорид j

5.0

5,0

iЖелеза сульфат j

! 0.2

-

■Железа (Ш) цитрат

г

_6S3 __ ”■

п

jНатрия тиосульфат

0,3

;Натрия тиосульфат (х 5HiO)

L__

|Феноловый красный

0,024

0.024

j.Arap-arap

12,0

12,0

Используют готовые основы сред промышленного изготовления с указанным составом.

Приготовление осуществляют согласно прописям на этикетках. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Тщательно перемешать и разлить в пробирки для тестирования Стерилизовать автоклавированием при температуре 12РС в течение 15 минут. Остудить среду в наклонном положении при комнатной температуре для формирования скоса и столбика высотой 2.5 см. pH среды после автоклавирования (при 25СС) 7,4 ± 0,2.

6. Выделение и накопление биомассы бактериальных культур, подвергаемых

идентификации

6.1. Первичный посев для выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах проводят согласно утвержденным в установленном порядке методам исследования пищевых продуктов [1-9]. Для определения принадлежности полученных характерных колоний к бактериям рода Salmonella отбирают отдельные колонии, выращенные на агаризованных селективно-диагностических средах, которые отвечают следующим требованиям: на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментацией среды под колониями; на среде Плоскирева - колонии бесцветные, прозрачные, более плотные, чем на среде Эндо; на среде Эндо колонии круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные; на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые. При микроскопиро-вании мазков бактерии рода Salmonella представляют собой мелкие, прямые бес-споровые папочки с закругленными концами, грамотрицательные.

Для получения чистых культур отбирают не менее 3-х типичных или подозрительных на принадлежность к роду Salmonella изолированных колоний, производят посев штрихом на поверхность плотных питательных сред МПА. или

триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом в отдельных чашках Петри, т пробирки с жидкими средами (триптон-соевый бульон с дрожжевым экстракт' инкубируют в течение 24 часов при 37±i °С.

6.2.    Первичный посев для выявления бактерий рода Listeria, в том Listeria monocytogenes, в пищевых продуктах проводят согласно утверждень установленном порядке методам исследования [10,11].

Для определения принадлежности полученных характерных колоний i teria monocytogenes отбирают отдельные колонии, выращенные на агаризова селективно-диагностических средах, которые отвечают следующим требова! на ПАЛКАМ-агаре через 24 часа инкубирования листерии формируют мелки ровато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром мм, иногда с черным центром. Через 48 часов колонии имеют диаметр 1,0-2,0 приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными че ореолом. На селективном Оксфорд-агаре листерии, выращенные в течение образуют мелкие (1 мм), сероватые, с черным ореолом колонии, через 48 ч ф< руют более темные, около 2 мм в диаметре колонии с черным ореолом и угл нием в центре. При микроскопированни мазков бактерии рода Listeria и Li monocytogenes представляют собой грамположительные неспорообразующи роткие палочки с закругленными концами, иногда почти кокки, одиночные i коротких цепочках, реже в длинных нитях.

Для получения чистых культур отбирают не менее 3-х характерных для терий колоний и производят посев штрихом на поверхность плотных питател сред МПА, или тригггон-соевый агар с дрожжевым экстрактом в отдельных чш Петри или в пробирки с жидкими средами (триптон-соевый бульон с дрожж экстрактом) и инкубируют в течение 24 часов при 37±1 °С.

6.3.    Первичный посев для выявления бактерий рода Campylobacter в п

вых продуктах проводят согласно утвержденным в установленном порядке г

дам исследования [12]. Для определения принадлежности полученных хара

нь!Х колоний к бактериям рода Campylobacter отбирают отдельные колонии

ращенные на агаризеванных селективно--диаг:чос'гических средах, которые

13

чают следующим требованиям, при росте в микроазрофильных условиях на поверхности агара Престон, селективного угольного агара, кампилобак-агара образуют мелкие округлые колонии или колонии средних размеров, неправильной формы., как бы растекающиеся по ходу штриха, серые или полупрозрачные с се* роватым оттенком, гладкие, влажные, блестящие. При микроскопировании мазков бактерии рода Campylobacter - грамотрицательные мелкие, тонкие палочки с одним или более завитками; имеют вид запятой, буквы S, либо галочки при соединении двух клеток. В стареющих культурах (через 48-72 часов инкубации на твердой среде) могут обнаруживаться кокковидные клетки.

Для получения чистых культур отбирают не менее 3-х типичных или подозрительных на принадлежность к роду Campylobacter изолированных колоний, производят посев на поверхность кровяного Колумбийского агара или в бульон для бруцелл и инкубируют при 42±1 °С в течение 24-48 часов в микроаэрофиль-ной атмосфере.

6.4. Первичный посев для выявления бактерий E.coli, в том числе серотипа 0157:Н7 в пишевых продуктах проводят согласно [3, 13-15]. Для определения принадлежности характерных колоний, выращенных на агаризованных селективно-диагностических средах, к бактериям E.coli 0157:Н7 отбирают отдельные колонии, которые отвечают следующим требованиям: при росте на поверхности Сорбитол-агара, E.coli 0157:Н7-агара - колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, прозрачные, бесцветные (не ферментирующие сорбит). Могут быть бледно-розовыми со светлым ореолом, мутноватыми. На среде Эндо - колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, темно-красные, лактозоположительные, При микроскопировании мазков бактерии E.coli, в том числе серотипа 0!57:Н7 представляют собой грамотрицательные различной величины бес-споровые палочки.

Для получения чистых культур отбирают не менее 3-х сорбитол-отрицательных колоний, типичных или подозрительных на принадлежность к серотипу 0157:Н7 E.coli, изолированных колоний (или дактозоположительных колоний со среды Эндо) и пересевают на поверхность агаров Клиглера, Олькениц-

14

кого, Ресселя в пробирках или в триптон-соевый бульон с дрожжевым экстракт Посевы инкубируют в термостате при 37°С 18-24 часа_

7. Подготовка образцов чистых культур к анализу

Чистые культуры, полученные по п.п. 6.1 -6 4. на плотных питательных с дах, смывают с поверхности агара стерильным физиологическим раствором н реносят взвесь в стандартную пробирку. Концентрация клеток в суспензии доя на быть не менее 5* 10й клеток/мл, при расчете с использованием оптичсскс стандарта мутности на 5 или 10 единиц.

Приготовленные указанным образом взвеси микроорганизмов или бульо ные культуры, полученные по п.п.6.1-6.4. и содержащие не менее 51Q6 кл ток/мл, подвергают дальнейшим манипуляциям для выделения ДНК. Подготс ленные образцы используют для анализа в тот же день.

8. Проведение лизиса и выделение ДНК

Выделение ДНК из образцов исследуемых бактериальных культур пров дят с использованием комплекта реагентов, входящих в тест-наборы систем ВАХ® Q7 для обнаружения патогенов путем ГЩР в реальном времени. Процеду включает следующие этапы:

8.1.    Приготовление лизирующего реагента: добавляют 150 мкл протеазы i флакон с 12 мл лизирующего буфера, наносят на флакон маркировку с датой пр готовления (лизирующий реагент хранится в плотно закрытом флаконе не больп двух недель при температуре 2-8°С), Допускается готовить меньший объем лиз! рующего реагента из расчета 12,5 мкл протеазы на 1 мл лизирующего буфера зависимости от потребности.

8.2.    Внесение лизирующего реагента в каждую из пробирок всей группы: заранее промаркированные пробирки для одной идентифицируемой группы мш роорганизмов (в том числе для отрицательного и положительного контролен) д< бавляют по 200 мкл лизирующего реагента.

8.3.    Смешивание реагента и суспензий исследуемых культур: вносят по

мкл образцов в каждую из подготовленных пробирок всей группы, при этом ис

пользуют чистые наконечники для каждого образна, включая отрицательный кон

15

■фоль, В качестве отрицательного контроля используют жидкие питательные среды для наращивания биомассы культуры, подвергаемой идентификации, или физиологический раствор

8 4. Нагревание смеси: помещают штатив с группой пробирок в предварительно нагретый термостат и выдерживают пробирки при следующих режимах:

-    20 мин при 37+2 °С, затем 10 мин при 95+3 °С - для бактерий родов Campylobacter, Salmonella и серотипа E.coli 0157:Н7;

-    60 мин при 55+2 °С, затем 10 мин при 95±3 °С - для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.

8    5. Охлаждение лизата: вынимают штативы с пробирками из термостата, устанавливают нх в охлаждающий блок и выдерживают в течение 5 мин до достижения температуры 2-8°С. Продолжительность всей операции по охлаждению не должна превышать 30 минут, включая подготовку охлаждающего блока (извлечение блока из холодильника и установку в него пробирок).

9. Подготовка к проведению ПЦР

ПЦР-идснтификация исследуемых бактериальных культур проводится с использованием таблетированных реагентов, входящих в комплект тест-набора системы BAX®Q7. Процедура подготовки включает следующие этапы:

9    1. Перед началом работы устанавливают охлажденную до 2-8°С вставку для ПЦР-пробирок в охлаждающий блок. Помещают панель для ПЦР-пробирок поверх вставки. Размещают необходимое количество стрипованных ПЦР-пробирок с таблетированными смесями ПЦР-реагентов, предназначенных для идентификации соответствующего вида микроорганизмов, в держателе из расчета по одной пробирке на каждый образец.

9.2. Растворение ЛЦР-таблеток в лизате: с помощью инструмента для надеван ия/снятия крышек приоткрывают крышки на пробирках, удаляют их и вносят лизаты культур и контроли в количестве 50 мкп при идентификации бактерий рода Salmonella, рода Listeria, Listeria monocytogenes, E.coli 0157:H7 или 30 мкл при идентификации бактерий рода Campylobacter.

9.3, Тщательно закрывают пробирки новыми оптически прозрач. крышками, не допуская неплотностей: плохо закрытые крышки могут приве нарушению реакции или получению неправильных результатов. Содерж пробирок осторожно перемешивают встряхиванием охлаждающего блока хил творения ПЦР- таблеток в лизате.

10. А модификация и детекция

Амплификацию в системе ВАХ® Q7 проводят по программе, объединяй стадии отжига и элонгации в один этап

Реакцию проводят в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей бя реакционный буфер, адаптированный к используемому типу полимер смесь ну кл еоз и дтр и фосфатов; флуоресцентно-меченые зонды-праймеры; полимеразу.

Амплификацию проводят по программе:

1) 1 цикл- 10мин-95°С;

2)    50 циклов: 20 с - 95°С; I мин - 65°С.

Постановка ПЦР в реальном времени сопровождается созданием в исл зуемом приборе для амплификации специального протокола Используемое ройство системы ВАХ0 Q7 позволяет создавать и выполнять различные прот лы термоииклирования с одновременным сбором и анализом данных флус ценции от оптического блока (для разных культур).

ЮЛ. Создание протокола (файла) исследования

10.1.1) Запускают приложение к системе ВАХ® иконкой на рабочем с персонального компьютера. На экране появится окно с изображением пустой зорной панели, разделенной на две части; сетка с 96 пустыми ячейками и поле ввода данных (рис. 1).

17

Рис. 1. Обзорная панель

10.1.2) Для создания файла, содержащего всю информацию об идентифицируемых образцах, выбирают ФАЙЛ (FILE) > МАСТЕР ЗАПУСКА (RACK WIZARD) в строке меню. Для следования запросам мастера ПЦР, нажимают ДАЛЕЕ (NEXT) или переходят к вводу информации вручную, нажимая ОТМЕНА (CANCEL).

10 1.2.1 Создание файла с помощью мастера ПЦР

1)    1 ступень - выбирают необходимый тип файла: новый («New») или основанный на предыдущем запуске («Based on a previous rack»). Нажимают ДАЛЕЕ (NEXT) для продолжения.

2)    2 ступень - вводят ИМЯ ФАЙЛА («File Name»), МЕТКУ («Label»), ДАННЫЕ ОБ ОПЕРАТОРЕ («Operator Ю») и ОПИСАНИЕ («Description») (имя файла по дате анализа вводится автоматически, при необходимости его можно изменить). Нажимают ДАЛЕЕ (NEXT) для продолжения.

3)    3 ступень - выбирают вариант переопределения уже имеющейся информации:

-    НЕ МЕНЯТЬ ТЕКУЩУЮ ИНФОРМАЦИЮ («DON’T CHANGE ANY

INFORMATION»)

-    ПЕРЕОПРЕДЕЛИТЬ ВЫБРАННЫЕ ЯЧЕЙКИ («REDEFINE SELECTED

WELLS»)

-- ПЕРЕОПРЕДЕЛИТЬ ВСЕ 96 ЯЧЕЕК («REDEFINE ALL 96 WELLS»)

Ячейки можно выбрать, кликнув по строке, колонке или отдельной ячейке.

4)    Под надписью «ИНФОРМАЦИЯ О ЯЧЕЙКАХ» («WE INFORMATION») выбирают МИШЕНЬ («TARGET») из выпадающего ме; Другие поля служат для ввода НОМЕРА ПАРТИИ (СЕРИИ) («KIT L NUMBER»), СВЕДЕНИЙ ОБ ОБРАЗЦЕ («SAMPLE Ю») и ОПИСАН («DESCRIPTION»), которые указываются при необходимости. После окончш ввода необходимых данных нажимают APPLY. Когда информация обо всех разцах будет введена, нажимают ДАЛЕЕ (NEXT) для продолжения.

5)    Если создан новый файл панели, в итоговом окне информация бу, представлена подробно. Если импортирован предыдущий файл панели, инфор! ция будет представлена в сокращенном виде (рис.2).

Рис.2. Вид итогового окна

6) После просмотра информации в итоговом окне нажимают ДАЛ (NEXT) для продолжения, при этом завершающее окно сообщит, что ввод инфс мации о панели закончен. Нажимают «Завершение» (FINISH) для создания фая панели. После того как файл панели создан, содержащуюся в нем информац! можно менять, редактируя определения отдельных ячеек.

10.1.2.2. Создание файла панели вручную

1)    На пустой обзорной панели, выбирают команду FILE > SAVE AS строке меню для создания нового файла панели с расширением «.Ьах».

2)    Вводят информацию о панели в нижнюю часть окна;

-    Вводят метку для панели («Label») (необязательно). Для перехода на cj дующее поле нажимают клавишу TAB.

-    Вводят сведения об операторе («Operator ID») (необязательно).

19

- Вводят описание панели («Description») (необязательно)

3)    Нажимают APPLY,

После того, как файл панели будет создан, можно редактировать содержащуюся в нем информацию. Однако сам файл не будет изменен, пока не выбрана команда FILE >SAVE в строке меню.

4)    Включают обзор ячейки, кликнув по этой ячейке в верхней части окна

т S> ,Т* *    ,    Л'    >    J-    м^с    Г    ,

Рис. 3. Обзор данных ячейки

Обзор ячейки можно включить командой VIEW > EDIT WELL INFO в строке меню или кликнув по соответствующему значку на панели инструментов. Можно вернуться к обзору панели командой VIEW > EDIT RACK INFO в строке меню или кликнув по соответствующему значку на панели инструментов.

5) Вводят информацию об образце:

-    Если автоматическая нумерация ячеек не используется, кликнув по первой ячейке, вводят сведения об образце («Sample ID»). Нажимают клавишу ENTER для перемещения в следующую ячейку и вводят сведения об образце.

-    Выбирают все ячейки с одним и тем же целевым организмом.

Допускается вводить данные о группе ячеек, кликнув по строке или столбцу ячеек, Любые данные, которые будут введены в обзор ячейки, относятся ко всем выделенным ячейкам.

-    Выбирают требуемую мишень целевой организм («Target») из выпадающего

меню

Содержание

1.    Область применения    4

2.    Сущность метода    4

3.    Общие положения    6

4.    Аппаратура, материалы и    реактивы    7

5 Подготовка к анализу    9

5.    i. Приготовление растворов и реактивов    9

5.2. Приготовление питательных сред    10

6.    Выделение и накопление биомассы бактериальных культур,

подвергаемых идентификации    12

7.    Подготовка образцов чистых культур к анализу    15

8.    Проведение лизиса и выделение ДНК    15

9 Подготовка к проведению ПЦР    16

Ш. Амплификация и детекция    17

11.    Оценка результатов    27

12.    Особенности проведения работ в ПЦР-лаборатории,

контроль за контаминацией    34

13.    Библиографические ссылки    36

з

Empty

. -VSv

Е со! 0157: И?

Е ?пЛ 0157Н7 МР

Е. счй 0157Н7 МР Express

Germs Listeria

Liberia morocytogenes

0 alnronello

Erterobacter нкагакЗ

Campylobacter jejoni/cdt

R7 Campylcbactef

Yeast and Wold Direct

Yeast and Mold Enriched

Рис.4 Выбор группы микроорганизмов - мишени Способ управления ячейками {'«Control») будет введен автоматически. Определение бактерий рода Campylobacter (С.jejuni, C.coli and С.1ал проводится одновременно с другими мишенями. Если сделать такой выбор, светится соответствующее сообщение об ошибке.

Рис.5. Сообщение об ошибке

-    Вводят номер серии набора («Kit Lot Number»).

-    В поле описание («Description») может быть введена какая-либо дополнит ная информация (при необходимости).

Клавишей TAB можно перейти к следующей ячейке, если на любом из гов нажать клавишу ENTER, можно перейти в следующее поле обзора ячейки

6) Нажать APPLY для продолжения. В верхней части окна отображения нели синими кружками обозначаются занятые образцами ячейки. Выбирают I > SAVE («Файл» < «Сохранить») в строке меню для сохранения созданного с ла.

10.2. Подготовка прибора к работе

10.2.1, Для нагрева прибора до требуемой температуры необходимо пр водить его включение заранее до запуска непосредственно процесса амплиф ции, а именно перед началом процедуры лизиса образцов. Это позволяет прог ети запуск анализа немедленно после загрузки охлажденных образцов, как то: в ник растворятся ПЦР-таблетки

УТВЕРЖДАЮ

Главный врач ФГУЗ «Федеральный центр гигие

ны и эпидемиологии».

Председатель Лабораторного совета

МР№

(Л- £56'

2008 г.

Федеральной службы по надзору в сфере зашиты [Фав потребителей и благополучия человека 4^1_А.И.Верещагин

Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы ВАХ® System Q7

Методические рекомендации

L Область применения

1.1.    Настоящие методические рекомендации устанавливают метод идентификации бактерий, выделенных из пищевых продуктов и продовольственного сырья, и подозрительных на принадлежность к роду Salmonella, роду Campylobacter (в т.ч. видам C.jejuni, C.coli, C.lari), роду Listeria (в т.ч. виду Listeria monocytogenes), серотипу E.coli 0157:Н7. на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

1.2.    Методические рекомендации предназначены для применения в испытательных лабораториях, аккредитованных в установленном порядке на право проведения исследований пищевых продуктов и продовольственного сырья.

2. Сущность метода

2.1. Метод основан на обнаружении специфических целевых нуклеотидных последовательностей ДНК, присутствующих в микроорганизмах-мишенях, с помощью комплементарных данным последовательностям зондов, меченых флуо-

4

ресцентным красителем, посредством полимеразной цепной реакции в реалы времени

В качестве зондов используются олигонуклеотиды, содержащие на 5-ко флуорофор-донор флуоресцентного излучения (репортер)., а на З'-конце - его цептор (гаситель). При гибридизации с амплифииируемой последовательность) ходе ПНР зонд разрушается за счет 5-экзонуклеазной активности Т полимеразы, за счет чего происходит разобщение флуорофора и гасителя. Фл ресцентный сигнал репортера вследствие этого усиливается пропорционал1 числу накапливаемых ампликонов.

По завершении амплификации, температура реакционной смеси повыша ся до значения, при котором амплифицированные цепи ДНК денатурируют краситель высвобождается, и интенсивность флуоресценции снижается. Эти менения флуоресценции в рамках созданного пользователем протокола регист] руются (фиксируются) на графике зависимости от температуры в виде криг (кривая накопления продуктов ПЦР или кривая плавления), которая автомата ски интерпретируется программным обеспечением системы прибора. Сравнен интенсивности регистрируемого флуоресцентного сигнала в температурных д» пазонах расположения пиков на кривой контрольных препаратов и исследуемс образца бактериальной культуры позволяет в реальном времени качественно с ределить присутствие в нем матричной ДНК микроорганизмов-мишеней. Окон* тельные результаты отражаются в виде символов разного цвета на специальн панели.

2.2. В качестве положительных контролен используется стандартные прег раты ДНК микроорганизмов-мишеней родов Salmonella, Campylobacter (в т.ч. в дов C.jejuni, С.coir С.lari). Listeria (в т.ч. вида Listeria monocytogenes), Eschericl coli серотипа 0157:H7.

2 3. Измерение флуоресценции производится используемым прибором д. амплификации автоматически с помощью специфичных к красителям свет фильтров в оптической системе прибора. Регистрация результатов методом ПЦР реальном времени исключает необходимость открывания пробирки после оконч

5

ния амплификации, что значительно снижает вероятность возникновения контаминации.

3. Общие положения

3.1. Представленный в Методических рекомендациях метод может применяться:

а)    для целей ускоренного подтверждения принадлежности выделенных микробиологическими методами культур к бактериям родов Salmonella, Campylobacter (в т.ч. видов Cjejuni, C.coli, Clan), Listeria (в т.ч. вида Listeria monocytogenes), Escherichia coli серотипа Oi57:H7 в качестве дополнительных к биохимическим и серологическим методам идентификации, в том числе:

-    при затруднениях идентификации бактерий рода Salmonella - взамен расширенного набора биохимических тестов в случаях отсутствия агглютинации культуры с поливалентной диагностической садьмонеляезной 0-агглютинирующей сывороткой (А, В, С, D, Е) и со смесью 0-сывороток редких групп при положительном результате стандартного набора биохимических тестов, при предположительном результате в случае наличия агглютинации с сыворотками редких групп, при положительных результатах серологического исследования и нетипичных результатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам);

-    при идентификации Escherichia coli серотипа 0157:Н7 - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с подтверждением серологической принадлежности к серогруппе 0157;

-    при идентификации Listeria monocytogenes - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с определением наличия лецитиназной и (3-гемолитической активности.

б)    для одновременного определения принадлежности микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов и продовольственного сырья, к родам Salmonella, Campylobacter (в т.ч. видам C jejuni, С coh, C.lari), Listeria (в т.ч. виду Listeria monocytogenes), Escherichia coli серотипа 015?:H7.

6

3.2. Метол рекомендуется к применению при осуществлении

качества и безопасности пищевых продуктов и продовольствен^ сырья, в том числе    Методы не могут применя

ся при проведении противоэпидемических мероприятий и эпидемиологичесь расследований

4. Аппаратура, материалы, реактивы

4 1 Для идентификации бактериальных культур, выделенных из пищев продуктов и продовольственного сырья, методом ПЦР в реальном времени j пользуют следующие инструменты и аппаратуру:

Г) амшшфикатор с оптической приставкой (типа циклера/детектора Q7 систе? ВАХ®) или другие приборы аналогичного назначения с равноценными техни* сними характеристиками, допущенные к применению в Российской Федерации;

2)    компьютер, совместимый с программным обеспечением амшшфикатора с с тической приставкой, в комплекте с монитором, клавиатурой, мышью, кабеле компакт-дисками с информацией по эксплуатации и инструкциями по настрой прибора;

3)    подогреватель;

4)    вставки в подогреватели для пробирок;

5)    термометр;

6)    таймер;

7)    блоки охлаждающие для ПЦР-пробирих - 2 шт.,

8)    охлаждающий штатив для пробирок;

9)    инструменты для надевания/снятия крышек с ПЦР-лробирок, поставляемые комплекте (открыватель пробирок);

10)    держатель для Г1ЦР-пробирок,

11)    держатель для охлаждающего блока;

12)    термостат типа «ТЕРМО 24-15» под пробирки типа Эппендорф вместим стью 1,5 мл, диапазон температур от 15°С до 120°С - 2 шт.;

13)    холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678;

14)    облучатель бактерицидный настенный ОБИ-150 TV i6-535;

/

15) дозаторы автоматические одноканальные переменного объема:

-    5-50 мкл с шагом 0,5 мкл, с точностью 3,0±0,6%;

-    20-200 мкл с шагом 1,0 мкл, с точностью 3,0±0,6%;

■ 100-1000 мкл с шагом 5,0 мкл, с точностью 1,5+0,5%;

16} пробирки адикроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

17)    пробирки для ПЦР со съемными крышками;

18)    плоские крышки для ПЦР-пробирок;

19)    штативы «рабочее место» для пробирок м икроцентрифужных типа Эппен-дорф вместимостью 1,5 мл;

20)    наконечники с фильтром (насадки) для дозаторов с переменным объемом дозирования до 50; 100, 200; 1000 мкл в штативе,

21)    контейнер для сброса наконечников;

22)    анаэробный инкубатор;

23 ) настольная система для анаэробного инкубирования;

24) пакеты газогенераторные для микроаэрофильного инкубирования.

Допускается использование другой аппаратуры и инструментария аналогичного назначения, разрешенных к применению в установленном порядке, с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с настоящими Методическими рекомендациями.

4 2. Для идентификации бактериальных культур, выделенных из пищевых продуктов и продовольственного сырья, методом ПЦР в реальном времени используют следующие материалы и реактивы;

1} питательные среды для наращивания биомассы идентифицируемых культур и приготовления бактериальных взвесей и их компоненты;

-    мясопептонный агар.

-    триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом,

-    триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом,

-    кровяной Колумбийский агар,

-    бульон для бруцелл, агар Кл и гаера.

-    агар Олькеницкого,

-    агар Ресселя,

-    кровь баранья дефибринированная стерильная;

-    основа колумбийского кровяного агара.

2) комплект реагентов (набор на 96 тестов/ для выделения ДНК из б и ома идентифицируемых культур, содержащий:

-    лизирующий буфер.

-    фермент протеазу.

3} комплект реагентов (набор на 96 тестов) для проведения амплификации, держащий:

-    таблетированную смесь олигонуклеотидны.х праймеров и нуклеозидтрифос тов; полимеразу в ГЩР-пробирках;

-    положительный контроль с клонированным специфическим фрагментом Д соответствующих микроорганизмов-мишеней;

4)    оптически прозрачные крышки для ПЦР-пробирок;

5)    спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00;

6)    вода дистиллированная ГОСТ 6709-72;

7)    перчатки резиновые или латексные неопудренные.

Упаковки с реагентами должны храниться в холодильнике при темпераг (4±2)°€, Замораживание не допускается. Реагенты должны быть использованы истечения срока их хранения, указанною на отдельных для каждого реагента У кетках. После того, как протеаза добавлена к лизирующему буферу, полученн готовый раствор должен храниться при температуре (4±2)°С, не более двух i делъ.

5» Подготовка к анализу 5Л„ Прнгш10влснис растворов и реавш-шой

5.1.1,    Изотонический (0,85 %-ный водный) раствор хлорида натрия готовят в ■ ответствии с ГОСТ 26669-85.

5.1.2.    Растворы и реактивы для окраски микроскопических препаратов по Гра

готовят по ГОСТ 10444 ! или в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя

9

5.1.2. Стерильный фосфатный буфер (pH 7.2 ± 0J) готовят в соответствии с ни

жеследующей прописью:

Г " '

г

Ингредиенты

Количество

| ЮНЬРО,

0.45 г

j Na2HP04

5,34 г

i Дистиллированная вода

1000 см'

Стерилизовать при температуре 121 °С в течение 30 мин.

5.2, Приготовление питательных сред

5-2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 4.2., готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

5.2.2.    Питательный агар с 1 % глюкозы и питательный бульон с ! % глюкозы (МПА с I % глюкозы, МПБ с 1 % глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ 30444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

5.2.3.    Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, трнптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.

Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый -3,0, натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещениый - 2,5; глюкоза -2,5. дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 cmj дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7.3 ± 0,2 и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8~С.

5.2.4. Бульон для бруцеля (неселективный): Состав основы среды:

I Ингредиенты

Количество, г/л

[Гидролизат казеина

10,0

[Пептический перевар животной ткани

10,0

!Дрожжевой экстракт

2,0

[Глюкоза

1,0

f ----- ■ ■————«“■—————— ~ *■■■- — ■ —--------—■—’

[Натрия хлорид

5,0

г ■■■*■------— ——--- - ..... “ "

[Натрия бисульфит

ОТ

10