Устанавливает метод определения содержания натамицина свыше 0,5 мг/кг в сырах, сырных корках и плавленых сырах и массы натамицина на единицу площади поверхности в сырных корках свыше 0,03 мг/дм2.
1 Область применения
2 Термины и определения
3 Сущность метода
4 Реактивы
5 Оборудование
6 Отбор проб
7 Подготовка проб
8 Процедура
9 Расчет и выражение результатов
10 Прецизионность
11 Протокол испытаний
Приложение (справочное) Примеры
Приложение В (справочное) Результаты межлабораторного испытания
Библиография
14 страниц
Дата введения | 20.04.2017 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.01.2019 |
Актуализация | 01.01.2021 |
20.04.2017 | Утвержден | Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации | 98-П |
---|---|---|---|
Разработан | БелГИСС |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ЕВРАЗИЙСКИЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(ЕАСС)
EURO-ASIAN COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(EASC)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
ГОСТ
ISO 9233-2— 2017
Определение содержания натамицина Часть 2
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров
(ISO 9233-2:2007, IDT)
Издание официальное
Минск
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации
Предисловие
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протоколом № 98-П от 20 апреля 2017 г.)
За принятие стандарта проголосовали: | ||||||||||||||||||
|
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 9233-2:2007 «Сыры, сырные корки и плавленые сыры. Определение содержания натамицина. Часть 2. Метод высокоэффективной жидкостной хромотографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров» («Cheese, cheese rind and processed cheese — Determination of natamycin content — Part 2. High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese», IDT).
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 «Молоко и молочная продукция» технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевая продукция» Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) в сотрудничестве с Ассоциацией аналитических сообществ (АОАС International)
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных (государственных) органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Исключительное право официального опубликования настоящего стандарта на территории указанных выше государств принадлежит национальным (государственным) органам по стандартизации этих государств.
1
Результаты были получены в соответствии с ISO 5725:1986 при совместном исследовании, проведенном в 1984 году в 36 лабораториях, которые использовали восемь проб.
Значения в миллиграммах на квадратный дециметр были рассчитаны из значений в миллиграммах на килограмм для сырных корок толщиной 5 мм и плотностью 1,3 г/см3.
Таблица В.1 — Параметры прецизионности | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
a) Прямое определение. b) Определение после 10-кратного концентрирования. |
10
|
[3] DE RUIG, W.G., VAN OOSTROM, J.J., LEENHEER, K. Spectrometric and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 944-8
(Спектрометрическая и жидкостная хроматография, определение натамицина в сыре и сырной корке)
[4] DE RUIG, W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54
(Определение натамицина в сыре и сырной корке. Межлабораторное совместное исследование)
11
УДК 637.354.074:543.544.5.068.7(083.74)(476) МКС 67.100.30 ЮТ
Ключевые слова: сыры, сырные корки, плавленые сыры, массовая доля натамицина, высокоэффективная жидкостная хроматография
12
_МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ_
СЫРЫ, СЫРНЫЕ КОРКИ И ПЛАВЛЕНЫЕ СЫРЫ Определение содержания натамицина Часть 2
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров
Cheese, cheese rind and processed cheese Determination of natamycin content Part 2
High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания натамицина свыше 0,5 мг/кг в сырах, сырных корках и плавленых сырах и массы натамицина на единицу площади поверхности в сырных корках свыше 0,03 мг/дм2.
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
2.1 содержание натамицина (natamycin content): Массовая доля веществ, определенных в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание — Содержание натамицина выражают в миллиграммах на килограмм.
2.2 масса натамицина на единицу площади поверхности в сырной корке (surface-area-related natamycin mass in cheese rind): Масса на единицу площади поверхности веществ, определенных в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание — Массу натамицина на единицу площади поверхности выражают в миллиграммах натамицина на квадратный дециметр сырной корки.
2.3 сырная корка (cheese rind): Наружный слой сыра, за исключением слоя покрытия при его наличии.
3 Сущность метода
Экстрагируют метанолом известное количество пробы. Разбавляют экстракт водой с последующим охлаждением до температуры от минус 15 °С до минус 20 °С для осаждения большей части жира, а затем фильтруют. Определяют в фильтрате (при необходимости после концентрирования) содержание натамицина или массу натамицина на единицу площади поверхности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
4 Реактивы
Используют реактивы только требуемой аналитической чистоты, если не установлено иное, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.
4.1 Метанол (СН3ОН).
Издание официальное
4.2 Метанол, водный раствор.
Смешивают 2 объема метанола (см. 4.1) и 1 объем воды.
4.3.1 Стандартный основной раствор натамицина концентрацией 500 мг/л.
Непосредственно перед использованием в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 мл
(см. 5.1) растворяют в метаноле (см. 4.1) определенное количество натамицина с известным содержанием натамицина, соответствующим 50 мг чистого натамицина (C33H47NO13). Доводят до метки водой и перемешивают.
Отбирают пипеткой 5,0 мл стандартного основного раствора натамицина (см. 4.3.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 мл (см. 5.1). Доводят до метки водным раствором метанола (см. 4.2) и перемешивают.
Отбирают пипеткой 5,0 мл разбавленного таким образом раствора в другую мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 мл (см. 5.1). Доводят до метки водным раствором метанола (см. 4.2) и перемешивают. Концентрация этого стандартного рабочего раствора натамицина составляет 5 мкг/мл.
Концентрация должна быть близкой к концентрации исследуемого раствора, измеренной в 8.3.3. При необходимости регулируют концентрацию этого стандартного рабочего раствора с помощью пипетки и разбавления другого количества.
4.4 Уксусная кислота (СН3С02Н) ледяная.
5 Оборудование
Используют стандартное лабораторное оборудование, и в частности следующее.
5.2 Нож или аналогичное устройство способные нарезать ломтики сыра толщиной 5 мм и шириной примерно 30 мм (пример см. на рисунке А.1).
5.3 Нож для тонкой нарезки, способный нарезать тонкие ломтики сыра максимальной толщиной 1 мм (пример см. на рисунке А.2).
5.5 Острый нож, способный разрезать ломтики сыра на небольшие кусочки.
5.7 Конические колбы вместимостью 100 и 200 мл, изготовленные из цветного стекла и снабженные притертыми пробками.
5.8 Шприцы одноразовые, вместимостью 10 мл.
5.9 Мембранные микрофильтры с размером пор от 0,20 до 0,45 мкм, стойкие к воздействию спиртовых растворов.
5.10 Складчатые бумажные фильтры быстрофильтрующие, диаметром 150 мм (например, S и S, No. 595 1/2 1)).
5.11 Воронка диаметром приблизительно 70 мм.
5.12 Морозильная камера, способная замораживать при температуре от минус 15 °С до минус 20 °С.
5.13 Экстракционные гильзы для концентрирования, при необходимости, отфильтрованного экстракта (например, Sep-pack С18 или Waters No. 51910 1J).
5.14 Жидкостной хроматограф с УФ-детектором, способный проводить измерения при длине волны 303 нм и оборудованный регистрирующим устройством и/или интегратором.
5.15 Аналитическая колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, типа С8, с размером частиц 5 мкм (например, Lichrosorb RP8 1J).
5.16 Защитная колонка длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, типа С8, с размером частиц от 30 до 40 мкм (например, Perisorb RP8 1().
5.17 Банка для хранения пробы подходящей вместимости.
11 Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Данная информация представлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекомендацией применения упомянутого продукта со стороны ISO или IDF.
3
6 Отбор проб
В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Не допускается во время транспортирования и хранения какое-либо ее изменение или порча.
Отбор проб не является частью метода, описанного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 707|IDF 50.
Лабораторная проба должна составлять целую головку сыра или сегмент из целой головки.
7 Подготовка проб
При необходимости разрезают пробу для испытания на сектора или более мелкие части так, чтобы ширина сырной корки была не более 30 мм. С помощью ножа (см. 5.2) отделяют всю корку от всех полученных секторов или частей, нарезая ломтиками максимальной толщиной 5 мм, за исключением слоя покрытия при его наличии.
Примечание — Настоящий стандарт также может использоваться для анализа сырной корки и слоя покрытия.
Из полученной корки вырезают с помощью острого ножа (см. 5.5) прямоугольный кусок площадью от 2 до 4 дм2. Определяют площадь его поверхности в квадратных дециметрах и массу в килограммах.
Тщательно измельчают (см. 5.4) всю корку, включая взвешенный и измеренный кусок, и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в банку для хранения пробы (см. 5.17).
После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой, горячей водой, а затем метанолом (см. 4.1). Тщательно сушат весь инструмент, например, струей сжатого воздуха.
После удаления корки (см. 7.1) используют нож для тонкой нарезки (см. 5.3) для получения ломтика максимальной толщиной 1 мм со всего наружного среза пробы для испытания.
Нарезают все ломтики пробы на мелкие куски площадью приблизительно 50 мм2 и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в банку для хранения пробы (см. 5.17).
После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой для испытания, горячей водой, а затем метанолом (см. 4.1). Тщательно сушат весь инструмент, например, струей сжатого воздуха.
8 Процедура
Взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 10,00 г пробы для испытания (см. 7.1) в конической колбе вместимостью 200 мл (см. 5.7).
Взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 5,00 г пробы для испытания (см. 7.2) в конической колбе вместимостью 100 мл (см. 5.7).
Добавляют 100 мл метанола (см. 4.1) к рабочей части пробы в конической колбе (см. 8.1.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (см. 5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (см. 5.6).
Добавляют 50 мл воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (см. 5.12) приблизительно на 60 мин.
4
Фильтруют холодный экстракт через складчатый бумажный фильтр (см. 5.10), отбрасывая первые 5 мл фильтрата. Фильтрование следует проводить до тех пор, пока суспензия остается еще холодной, чтобы избежать растворения жира и, следовательно, образования мутных фильтратов.
Доводят фильтрат до комнатной температуры. С помощью шприца (см. 5.8) отбирают порцию фильтрата. Фильтруют через мембранный микрофильтр с размером пор 0,45 мкм (см. 5.9), а затем через мембранный микрофильтр с размером пор 0,20 мкм (см. 5.9).
Минимальное требуемое количество исследуемого раствора (фильтрата) составляет 20 мкп на ввод для прямого хроматографического измерения (см. 8.3.4) и 25 или 50 мл для измерения при 5- или 10-кратной концентрации (см. 8.3.5) соответственно.
С помощью измерительного цилиндра добавляют 50 мл метанола (см. 4.1) к рабочей части пробы в конической колбе (см. 8.1.2). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (см. 5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (см. 5.6).
С помощью измерительного цилиндра добавляют 25 мл воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (см. 5.12) приблизительно на 60 мин.
Фильтруют раствор, как описано в 8.2.1.2.
Лаборатория, которая применяет данный метод, должна установить пределы обнаружения и провести определение в собственных инструментальных условиях, используя признанные методы расчета, для верификации того, что натамицин может быть определен при концентрациях вплоть до 0,5 мг/кг и 0,03 мг/дм2.
Рекомендуется следующий хроматографический режим:
- подвижная фаза — метанол (см. 4.1): вода : уксусная кислота (см. 4.4) — 12:8:1 (объемных частей);
- поток — 1 мл/мин;
- установка детектора — 303 нм, 0,005 оптических единиц, вся шкала;
- регистрирующее устройство — 10 мВ;
- число теоретических (типичных) тарелок — 1500 минимум.
При использовании другой колонки, отличной от приведенной в качестве примера (см. 5.15), регулируют соотношение метанол:вода. Однако заданное относительное количество уксусной кислоты (см. 4.4) к метанолу является существенным для сохранения максимальной оптической плотности при 303 нм.
Для определения времени удерживания и проверки калибровочного графика (см. 8.3.3) перед испытанием каждой серии проб в хроматограф должен вводиться стандарт с известным содержанием натамицина.
Поскольку натамицин не устойчив в водном метаноле, выполняют измерение как можно быстрее.
Отбирают пипеткой 1,2, 4, 6 и 8 мл стандартного рабочего раствора натамицина (см. 4.3.2) соответственно в серию мерных колб с одной меткой вместимостью 50 мл (см. 5.1). Доводят до метки водным метанолом (см. 4.2) и перемешивают.
Полученные таким образом калибровочные растворы содержат 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 мкг/мл натамицина соответственно. Поочередно вводят в колонку по 20 мкп каждого стандартного раствора. Определяют площадь или высоту полученного пика.
Наносят на график полученные площадь или высоту пика для каждого раствора по оси ординат относительно концентрации натамицина в микрограммах на миллилитр по оси абсцисс. HPL-хрома-тограмма образца стандартного раствора представлена на рисунке А.З.
5
Вводят 20 мкл исследуемого раствора (см. 8.2.1.2 или 8.2.2.2). Измеряют площадь или высоту пика с таким же временем удерживания, что и калибровочные растворы натамицина.
Выполняют измерение по возможности быстрее.
Если площадь или высота пика исследуемого раствора настолько мала, что интерполяция по калибровочному графику невозможна или почти невозможна, а определение тем не менее необходимо, то следуют методике, указанной в 8.3.5.
Примеры Н PL-хромато грамм исследуемых растворов представлены на рисунке А.4.
Примечание — Присутствие в сыре специй, особенно перца, может мешать определению, поскольку на хроматограмме может образовываться пик с тем же временем удерживания, что и у пика, соответствующего натамицину. Разделение этих двух пиков может быть достигнуто путем градиентного элюирования или изократи-ческого использования альтернативной подвижной фазы метанол (см. 4.1): фосфатный буфер, pH 4,5, с соотношением объемных частей 11:9. Раствор фосфата для буферного раствора можно приготовить при растворении 3,026 г дигидроортофосфата калия в 1 л воды.
Решают вопрос о необходимости использования приблизительно 5- или 10-кратной концентрации. Основывают это решение на результате, полученном в 8.3.4, и на требуемом пределе определения.
Затем отбирают пипеткой 25 или 50 мл (для 5- или 10-кратной концентрации соответственно) исследуемого раствора (см. 8.2.1.2) в химический стакан. В зависимости от требуемой концентрации добавляют 50 или 100 мл воды соответственно и перемешивают.
Активируют экстракционную гильзу (см. 5.13), используя от 3 до 5 мл метанола (см. 4.1). Затем промывают 10 мл воды.
Пропускают разбавленный исследуемый раствор через гильзу со скоростью от 3 до 5 мл/мин с помощью шприца (см. 5.8). Промывают гильзу 10 мл воды с помощью шприца (см. 5.8). Элюируют ната-мицин 3 мл метанола (см. 4.1) с помощью шприца (см. 5.8).
Разбавляют элюат (см. 8.3.5.1) до 5 мл метанолом (см. 4.1).
Продолжают, как указано в 8.3.4.
9 Расчет и выражение результатов
Массу натамицина в введенной определенной части исследуемого раствора можно определить путем интерполяции по калибровочному графику (см. 8.3.3).
Рассчитывают содержание натамицина в виде массовой доли w, мг/кг, в пробе для испытания по формуле (1):
где сп — концентрация натамицина в исследуемом растворе (см. 8.2.1.2 или 8.2.2.2), мкг/мл; т — масса рабочей части пробы (см. 8.1.1 или 8.1.2), г;
V — общий объем исследуемого раствора (см. 8.2.1.1 или 8.2.2.1), мл.
Примечание — В том случае, если исследуемый раствор приготовлен из сыра, отобранного из-под корки, w представляет собой содержание натамицина в результате миграции в сыр.
Массу натамицина на единицу площади поверхности тАп, мг/дм2, рассчитывают по формуле (2):
mAn=wrx—, (2)
где А — площадь взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (см. 7.1), дм2;
М — масса взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (см. 7.1), кг; wr — массовая доля натамицина в пробе для испытания, взятой из сырной корки (см. 7.1), мг/кг.
6
В том случае, если отфильтрованный экстракт подвергался концентрированию, как указано в 8.3.5, вносят поправку в результаты испытания для w(cm. 9.1) и тА п (см. 9.2) следующим образом:
a) для приблизительно 5-кратной концентрации делят полученный результат на 5; и
b) для приблизительно 10-кратной концентрации делят полученный результат на 10.
Если требуется параллельное определение и соблюдаются требования к повторяемости, за конечный результат содержания натамицина в пробе для испытания принимают среднееарифметическое результатов двух определений, полученных в соответствии с разделом 10, округленное с точностью до первого десятичного знака.
Выражают результаты испытания с точностью до первого десятичного знака.
10 Прецизионность
Значения повторяемости и воспроизводимости были получены по результатам межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с ISO 5725:1986 [2] (относительно результатов см. ссылку [4]).
Абсолютная разность между результатами двух независимых испытаний, полученными с использованием одного и того же метода на идентичных пробах в одной лаборатории одним оператором на одном оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должна превышать значения, указанные в таблице В.1, более чем в 5 % случаев.
Абсолютная разность между результатами двух независимых испытаний, полученными с использованием одного и того же метода на идентичных пробах в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании, не должна превышать значения, указанные в таблице В.1, более чем в 5 % случаев.
11 Протокол испытаний
Протокол испытаний должен содержать:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) метод отбора проб, если он известен;
c) используемый метод испытания вместе со ссылкой на настоящий стандарт;
d) все подробности проведения испытания, не указанные в настоящем стандарте или указанные как необязательные, вместе со сведениями обо всех случаях, которые могли повлиять на результат (ы) испытания;
e) полученный (ые) результат (ы) испытания или, если была проверена повторяемость, полученный окончательный результат.
7
Размеры в миллиметрах
1 — сыр; 2 — нож; 3 — корка; 4 — ролик Рисунок А. 1 — Пример ножа для нарезания кусков сырной корки толщиной 5 мм (см. 5.2)
Рисунок А.2 — Пример ножа для тонкой нарезки ломтиков сыра максимальной толщиной 1 мм (см. 5.3)
А — оптическая плотность; t— время; AU — оптическая единица Рисунок А.З — HPL-хроматограмма образца стандартного раствора, содержащего 0,5 мкг/мл натамицина
8
А
i
А — оптическая плотность; t - время; AU — оптическая единица
1 — сырная корка, массовая доля натамицина 61 мг/кг; 2 — сырная корка, массовая доля натамицина 15 мг/кг; 3 — сыр, массовая доля натамицина 1,7 мг/кг; 4 — сыр, массовая доля натамицина 0,3 мг/кг;
5 — как 3, после 5-кратного концентрирования; 6 — как 4, после 10-кратного концентрирования
Рисунок А.4 — Примеры HPL-хроматограмм различных исследуемых растворов
9