МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ МОЛОЧНЫЕ

Подсчет презумптивных бифидобактерий

Метод определения количества колоний при температуре 37 °С

(ISO 29981:2010, ЮТ)

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 5 ноября 2013 г. № 61-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Азербайджан AZ Азсстандарт Армения AM Минэкономики Республики Армения Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Киргизии KG Кыртызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт Узбекистан uz Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1708-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 29981-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 29981:2010 Milk products. Enumeration of presumptive bifidobacteria — Colony count technique at 37 °C (Продукты молочные. Подсчет презумптивных бифидобактерий. Метод определения количества колоний при температуре 37 °С).

Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ИСО/ТК 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (еп).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.

Степень соответствия — идентичная ЮТ

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ ISO 29981-2013

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Термины и определения..........................................2

4    Сущность метода..............................................2

5    Питательные среды, разбавители и реактивы..............................3

6    Оборудование................................................4

7    Отбор проб.................................................5

8    Проведение анализа............................................5

9    Расчет и обработка результатов......................................7

10    Прецизионность..............................................8

11    Квалификация при применении данного метода............................11

12    Протокол испытаний...........................................11

Приложение А (справочное) Межлабораторное испытание.......................12

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным

международным стандартам...............................13

Библиография................................................14

III

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ МОЛОЧНЫЕ

Подсчет презумптивных бифидобактерий.

Метод определения количества колоний при температуре 37 °С

Milk products. Enumeration of presumptive bifidobacteria. Colony count technique at 37 *C

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод селективного подсчета презумптивных бифидобактерий в молочных продуктах, используя технику подсчета колоний при температуре 37 °С в анаэробных условиях.

Данный метод применим к молочным продуктам, к ферментированным и неферментированным продуктам, сухому молоку, детским молочным смесям и закваскам, к тем продуктам, где рассматриваемые микроорганизмы жизнеспособны и присутствуют наряду с другими молочнокислыми бактериями. (Критерии качества молочных продуктов (6J.)

Бифидобактерии, используемые в молочных продуктах, относятся к следующим видам ((7]. (8).

Ц6]):

a)    Bifidobacterium adolescentis;

b)    В. animalis subsp. animalis;

c)    B. animalis subsp. lactis:

d)    B. bifidum:

e)    B. breve;

f)    B. infantis;

g)    B. longum.

2    Нормативные ссылки

Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая любые изменения.

ISO 6887-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений)

ISO 6887-5 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the preparation of milk and milk products (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 5. Специальные правила для приготовления молока и молочных продуктов)

Изданио официальное

ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

ISO 7889|IDF 117 Yogurt. Enumeration of charactenstic microorganisms. Colony-count technique at 37 °C (Йогурт. Подсчет характеристических микроорганизмов. Метод определения количества колоний при 37 °С)

ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории)

ISO 14461-1 |IDF 169-1 Milk and milk products — Quality control in microbiological laboratories — Part 1: Analyst performance assessment for colony counts (Молоко и молочные продукты. Контроль качества в микробиологических лабораториях. Часть 1. Оценка работы аналитика при подсчете числа колоний)

ISO 14461-2|IDF 169-2 Milk and milk products — Quality control in microbiological laboratories — Part 2: Determination of the reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps (Молоко и молочные продукты. Контроль качества в микробиологических лабораториях. Часть 2. Определение достоверности подсчета числа колоний при посеве на параллельных чашках Петри с последующими стадиями разведений)

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1    бифидобактерии (bifidobacterium): анаэробные микроорганизмы, которые образуют колонии двояковыпуклой или круглой формы белесого цвета, частично в форме звездочки или трехлопастной формы диаметром от 1 мм до 4 мм на питательной среде, приготовленной на основе олигосахаридов, обработанных трансгалактозой с добавлением литиевой соли мупироцина (TOS-MUP). в условиях, установленных в настоящем стандарте.

4    Сущность метода

4.1    Антибиотик, литиевая соль мупироцина (MUP). подавляет рост большинства молочнокислых бактерий, обычно используемых в ферментированных и неферментированных молочных продуктах.

Благодаря доказанной избирательности антибиотика MUP при добавлении его в питательную среду обычно не происходит роста типичных йогуртовых бактерий (Streptococcus thermophilus. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), мезофильных культур (например. Lactococcus lactis), Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus на установленной среде.

Это свойство протестировано на репрезентативном количестве контрольных штаммов и выделенных культур.

Среда TOS-на агаре способствует росту бифидобактерий, используемых в молочных продуктах! 17).

Примечания

1    Фазово-контрастная микроскопия с применением 100-кратного увеличения и масляной иммерсии показывает палочки очень разнообразных форм, обычно искривленные и с утолщениями, зачастую ветвистые, растущие по отдельности, парами, группами, располагающиеся клином (V-образнан форма расположения колоний), цепочками. столбиками из параллельно расположенных клеток или розетками, порою демонстрирующими форму набухшей сферы (кокка).

2    Бифидобактерии не являются кислотоустойчивыми, спорообразующими микроорганизмами, они — грамм-положительные, немобильные и каталаза-отрицательные хемоортанотрофы. которые выделяют уксусную кислоту и молочную кислоту. Глюкоза разлагается полностью и характерным образом посредством фруктозз-6-фосфатого шунта, в котором фруктоза-6-фосфат-фосфокетолаза (F6PPK. ЕС 4.1.2.22) расщепляет фруктоза-6-фосфат на ацетилфосфат и зрит роза-4-фосфат.

3    Температура оптимального роста находится в интервале от 37 *С до 41 *С. Дополни тельная информация приведена в (9].

4.2    Посев десятичных разведений однородной пробы в TOS-arap с добавлением MUP. с использованием чашечного метода, с последующей анаэробной инкубацией при температуре 37 °С в течение 72 ч. ¹

ГОСТ ISO 29981-2013

4.3    Подсчет колоний

Примечание — Выбранные культуры из чашек можно подтвердить соответствующими тестами по

(14]. [15].

4.4    Количество бифидобактерий в грамме пробы рассчитывают по числу колоний, полученных в чашках с разведениями такой концентрации, чтобы получить значимый результат.

5 Питательные среды, разбавители и реактивы

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду, или воду равноценной чистоты.

5.1    Основные материалы

Основные материалы — по ISO 6887-5 и ISO/TS 11133-1.

5.2    Разбавители

Приготовление разбавителей — no ISO 6887-5.

Чтобы обеспечить сопоставимость результатов в установленных колониеобразующих единицах (КОЕ), соблюдают следующие правила.

Используют раствор Рингера (Ringer s) с 1/4 концентрации или любой другой подходящий разбавитель, установленный в ISO 6887-5 и подтвержденный как эквивалентный.

Стерилизуют и используют подходящий стерильный дозатор.

Доводят разбавитель до температуры (22 ± 2) ^вС. Переносят разбавитель стеканием каплями, не захватывая воздух.

Неопределенность измерения используемых объемов должна соответствовать требованиям ISO 6887-1.

5.3    Питательная среда (среда TOS-MUP)

Используют свежеприготовленную среду на основе обработанных трансгалактозой олигосахаридов с добавлением литиевой соли мупироцина (TOS-MUP), защищенную от прямого солнечного света.

5.3.1    Основная среда (среда TOS-пропионат на агаре [10])

5.3.1.1    Состав:

пептон триптиказа — 10,0 г; дрожжевой экстракт — 1.0 п КН₂Р0₄ — 3,0 г;

К₂НР0₄ — 4.8 г;

(NH₄)₂S0₄ — 3,0 г;

MgS0₄ 7Н₂0 — 0,2 г;

(Р)-Цистеин • HCI • Н₂0 — 0,5 г; пропионат натрия — 15.0 г;

TOS (см. 5.3.1.2)— 10,0 г; агар-агар —15,0 г; вода — 950 см².

5.3.1.2    Смесь олигосахаридов — трансгалактозы

Смесь TOS получают ферментативным гидролизом лактозы. ислользуя0-галактозидазу Aspergillus огусеае. Смесь TOS содержит галактозу (Gal) и глюкозу (Glc). вычисляемых по формуле

[Gal — (GaO_n — Glc],    (1)

где л = 1 ... 4;

х=0- 1.6>р-1.4 и 0-1,3;

у = 6- 1.4 >>0-1,3 и 0-1.6.

Смесь TOS очищают с помощью хроматографии в определенных условиях по [18]. [19]. Общее содержание сахара (> 97 % по массе) включает определенную часть три-, тетра-, пента- и гексасахаридов. (Изменение соотношения олигосахаридов не оказывает заметного влияния на потенциал среды.)

5.3.1.3 Приготовление

Суспендируют ингредиенты в 950 см² воды при осторожном нагревании (например, на нагревательной плитке или водяной бане) при частом помешивании до полного растворения.

Распределяют по склянкам вместимостью 250 см³ по 190 см³ в каждую. Регулируют pH (6.6). при необходимости, так чтобы после обработки в автоклаве установился pH на уровне 6.3 г 0.2 единиц при температуре 25 °С.

Обрабатывают в автоклаве основную среду при температуре 115 °С в течение 15 мин.

Если среду не используют сразу, то ее охлаждают. Хранят среду при температуре от 2 ^вС до 4 °С не более одной недели в условиях, не вызывающих изменения состава среды.

Среда TOS чувствительна к теплу, поэтому избыточная тепловая обработка может отрицательно сказаться на свойствах среды. Полные среды TOS-пропионат имеются в продаже и имеют состав, соответствующий настоящему стандарту. Если среду готовят в лаборатории, то результаты могут существенно отличаться для сред, приготовленных в разное время. Поэтому среды рекомендуется подтверждать, чтобы убедиться, что рост бифидобактерий, указанный в единицах КОЕ, остается на сопоставимом уровне (см. также ISO/TS 11133-1).

5.3.2    Вспомогательный раствор MUP [11]

Непосредственно перед применением, растворяют, например. 50 мг MUP в 50 см³ воды или другие количества в тех же пропорциях. Стерилизуют полученный раствор фильтрацией через мембрану (размер пор 0.22 мкм) в соответствии с 5.3.3.

5.3.3    Полная среда

Непосредственно перед применением расплавляют порции по 190 см³ приготовленной основной среды (5.3.1) с помощью пара или аналогичным способом. Охлаждают на водяной бане (6.5) до температуры (48 г 1) “С. Добавляют 10 см³ вспомогательного раствора MUP (5.3.2) в каждую склянку шприцем, оснащенным стерильным фильтром с размером пор 0.22 мкм (6.11) незадолго до разливки. Тщательно перемешивают, без образования пузырьков воздуха.

Снова помещают полную среду на водяную баню (6.5) при температуре 48 °С и держат, пока она не будет готова к разливке.

Полная среда TOS-MUP должна иметь конечную концентрацию MUP, равную 50 мг/дм³.

6 Оборудование

Стерилизация оборудования, которое контактирует с анализируемой пробой, разбавителем, разведениями или питательной средой, должна осуществляться в соответствии с требованиями ISO 6887-5, а также ISO/TS 11133-1. Стеклянная посуда должна выдерживать многократную стерилизацию.

Используют оборудование микробиологических лабораторий (ISO 7218), для приготовления проб для анализа и разведений, в соответствии с требованиями ISO 6887-5.

6.1    Оборудование для инкубирования (термостатирования), обычно применяемые

сосуды, или анаэробный инкубатор

6.1.1    Инкубатор (термостат), обеспечивающий поддержание температуры (37 г 1) ^вС.

6.1.2    Анаэробные культуральные склянки, обеспечивающие поддержание анаэробной атмосферы. содержащей от 10 % до 20 % диоксида углерода по массе; приблизительно от 70 % до 90 % азота по объему и приблизительно 10 % водорода по объему (необязательно). Газовая смесь не должна содержать более 1 % кислорода по объему.

Допускается применять другие безопасные низкотемпературные каталитические системы.

6.1.3    Анаэробный инкубатор, поддерживающий температуру на уровне (37 г 1) *С, обеспечивая анаэробную атмосферу (см. 6.1.2).

6.2    Механическая мешалка, обеспечивающая перемешивание содержимого пробирок, например вихревой смеситель.

6.3    Оборудование для подсчета колоний, в соответствии с ISO 7218.

6.4    Лупа, от 8-до 10-кратного увеличения.

6.5    Водяные бани, обеспечивающие поддержание температур (20 г 1) °С. (45 ; 1) ^вС, (48 = 1) °С.

6.6    pH-метр, с температурной компенсацией, точностью до t0,1 pH при температуре 25 °С.

6.7    Колбы и склянки, вместимостью 250 см³ с плотными пробками или крышками (для помещения питательной среды и приготовления начального разведения анализируемой пробы).

6.8    Пробирки, высотой порядка 150 см³ и диаметром примерно 15 мм с подходящими крышками.

4

ГОСТ ISO 29981-2013

6.9    Мерные пипетки, для бактериологических исследований, стерилизованные и калиброванные до кончика, обеспечивающие подачу (1 ± 0,02) см³ и (10 = 0.2) см³ (ISO 6887-1). соответственно, по (20). класс А.

6.10    Чашки Петри, из прозрачного неокрашенного стекла или пластика, диаметром 90 мм и минимальной внутренней глубины 10 мм. На дне не должно быть неровностей, которые могли бы помешать подсчету колоний.

6.11    Стерилизационная аппаратура, для стерилизации фильтрованием, шприц вместимостью 10 см³, оснащенный стерильным фильтром с размером пор 0.22 мкм.

6.12    Автоклав, обеспечивающий поддержание температуры на уровне (115 = 3) °С с короткими циклами нагревания-охлаждения.

7    Отбор проб

Необходимо, чтобы проба, поступающая в лабораторию, была представительной и не была испорчена при транспортировании или хранении.

Отбор проб не входит в метод, установленный в настоящем стандарте. Рекомендованный метод отбора проб — по (1).

8    Проведение анализа

8.1    Общие положения

Следующие процедуры основаны на соответствующих стандартах с учетом рекомендаций (8]. (12).

Выполняют процедуры, описанные в 8.2—8.5. при осторожном помешивании, избегая образования или захвата воздушных пузырьков и защищая от прямого солнечного света.

Прежде чем открыть контейнер с пробой, необходимо очистить поверхность вокруг зоны, в которой будут извлекать пробу, чтобы удалить материал, который может загрязнить пробу. Например, протирают стол 70 %-ным (по объему) этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Контейнер открывают, соблюдая правила асептики.

8.2    Подготовка пробы для анализа и первичное разведение

8.2.1    Сухие молочные продукты, сухие молочные смеси для детского питания

Выполняют процедуры а>—i) (ISO 6887-5).

a)    Тщательно перемешивают содержимое закрытой упаковки, встряхивая и переворачивая ее несколько раз.

b)    Открывают упаковку, извлекают требуемую порцию стерильным шпателем и переходят к следующему. Сразу же закрывают пакет. Рекомендуется использовать воздухонепроницаемый зажим и помещать пакет внутрь герметично закрывающегося стеклянного сосуда для хранения при 4 °С.

c)    Берут навеску (90 = 0,1) г разбавителя и помещают в каждую из предварительно стерилизованных склянок вместимостью 250 см³ (6.7). Склянки закрывают.

d)    Нагревают склянки вместимостью 250 см³, содержащие 90 г разбавителя на водяной бане (6.5) при температуре 45 °С.

e)    Берут навеску пробы с точностью 0.05 г массой (10 ± 0.1) г. Добавляют навеску в разбавитель в каждую склянку при температуре 45 °С. В другом варианте берут навеску пробы массой 10 г непосредственно в склянку с разбавителем при температуре 45 °С.

f)    Чтобы растворить пробу для анализа, медленно помешивают склянку круговыми движениями, чтобы смочить порошок. Затем встряхивают склянку 10 раз движением с амплитудой 300 мм за 7 с.

д) Помещают склянки на водяную баню (6.5) при температуре 45 °С в течение 5 мин. периодически их встряхивая.

h)    Сразу же охлаждают склянки в струе водопроводной воды, встряхивая в течение 2 мин. Быстро доводят до комнатной температуры. Например, на водяной бане (6.5) при температуре 20 °С.

i)    Исследование начинают незамедлительно (8.5).

ВНИМАНИЕ — Чтобы получить приемлемую повторяемость метода, необходимо строго следовать процедурам, установленным в а)—i).

8.2.2    Пробиотический йогурт или аналогичные йогуртам продукты

Переходят к процедурам a)—g) (ISO 7889|IDF 117).

а) Доводят разбавитель до комнатной температуры. ³

b)    Берут навеску разбавителя массой (90 = 0.1) г в каждую из предварительно стерилизованных склянок (6.7) вместимостью 250 см³. Склянки закрывают.

c)    Тщательно перемешивают содержимое закрытой упаковки пробы многократным встряхиванием и переворачиванием (предпочтительно 10 раз. движением амплитудой 300 мм в течение 7 с), или тщательно перемешивают содержимое стерильным шпателем или чем-либо подобным, после того как упаковка открыта, чтобы получить гомогенную пробу.

d)    Открывают упаковку, извлекают требуемое количество пробы стерильным шпателем или пипеткой и переходят к следующему.

e)    Берут навеску пробы с точностью 0.05 г массой (10 = 0.1) г. Добавляют навеску к разбавителю в каждую склянку.

f)    Встряхивают склянку 10 раз. движением с амплитудой 300 мм в течение приблизительно 7 с.

д) Исследование начинают незамедлительно (8.5).

После приготовления первичного разведения (суспензия пробы — 1-е десятичное разведение. D1; 100 см³) немедленно готовят следующие разведения.

8.3    Исследование под микроскопом

Выполняют предварительное исследование под микроскопом в нескольких полях мазка жидкости первичного разведения (8.2) высушенных и твердых проб, чтобы выбрать нужный диапазон разведений для использования, особенно в тех случаях, когда изготовитель не дает информации о продукте.

В качестве альтернативы можно использовать фазово-контрастную микроскопию без выполнения мазков.

8.4    Приготовление десятичных разведений

Общие требования приведены в ISO 6887-1. Специальные требования к выращиванию бифидобактерий учитывают следующее.

Описанную операцию требуется выполнять путем осторожного перемешивания в стандартизованных условиях, установленных ниже

Разведения готовят следующим образом:

a)    Встряхивают первичное разведение (8.2) предпочтительно 10 раз. движением руки с амплитудой примерно 300 мм. приблизительно в течение 7 с для достижения гомогенности.

b)    Пипеткой (6.9) переносят 1 см³ первичного разведения (исходная бактериальная суспензия) в пробирку (6.8), содержащую 9 см³ стерильного разбавителя при соответствующей температуре (5.2).

c)    Тщательно перемешивают разведение в течение 3 с с помощью вихревого смесителя (6.2). Для последующих разведений поступают аналогичным образом, пока не будет получена требуемая рабочая плотность от 200 КОЕ/см³ до 500 КОЕУсм³. Перемешивают всегда одинаковым образом, например. в течение периода в 3 с. Для каждого этапа разбавления используют свежую стерильную пипетку (6.9).

Необходимо избегать попадания в пипетку воздушных пузырьков. Необходимо позаботиться о том, чтобы из пипетки было полностью слито содержимое, особенно при переносе пор с более высокой концентрацией.

8.5    Посев

Переносят стеканием по капле 1 см³ каждого из соответствующих этапов разведения (рекомендуется четыре десятичных разведения в рамках каждой области подсчета) в каждую пустую чашку Петри, используя по две параллельных чашки на разведение. Наливают в чашки Петри питательную среду в объеме от 12 см³ до 15 см³ (5.3.3). Осторожно перемешивают разбавитель в чашках Петри круговыми движениями, не захватывая воздух.

Примечание — Чтобы ограничить диапазон подсчета до заданного интервала, особенно если предполагается большое количество микроорганизмов [6]. можно высеивать только те десятичные разведения (как минимум. два последовательных разведения), которые необходимы для облегчения правильного подсчета (ISO 7218).

В качестве альтернативы применяют технику автоматического распределения препарата, подтвержденную со ссылкой на настоящий стандарт.

8.6    Продолжительность опыта

Время с момента приготовления первичного разведения (при готовом исходном разведении) до момента добавления питательной среды не должно превышать 15 мин по (8). ⁴

ГОСТ ISO 29981-2013

8.7    Инкубирование

Сразу после застывания среды переворачивают все чашки Петри и ставят в анаэробный сосуд для инкубации или в анаэробный инкубатор (6.1) и выдерживают при температуре 37 °С в течение (72 г 3) ч.

8.8    Подсчет колоний

Подсчитывают колонии после инкубации, учитывая только этапы разведения в рамках обсчитываемой области (т. е. разведения, для которых ожидаемое среднее количество на чашку xs 300 КОЕ по ISO 7218).

Выполняют подсчет на чашках выбранных разведений, учитывая все колонии на чашке непосредственно после инкубации.

Чашки обследуют в затененном освещении. Для облегчения счета используют подходящее оборудование подсчета колоний (6.3). При подсчете точечных колоний следует не путать их с нерастворенны-ми частицами пробы или осажденным материалом. Тщательно обследуют не вызывающие сомнений объекты с помощью лупы большего увеличения, если требуется, чтобы отличить колонии от постороннего материала.

После инкубации сразу же обследуют чашки. Чашки держат в холодильнике в течение максимум 48 ч (ISO 7218).

8.9    Считывание чашек Петри — подтверждение

Идентифицируют колонии бифидобактерий по белесому цвету. Выбирают типичные колонии (3.1) из чашек, используемых для подсчета колоний, и исследуют под микроскопом.

Дополнительно можно провести анализ с помощью F6PPK. чтобы подтвердить результаты [14).

Ц5).

Примечание — Некоторые штаммы бифидобактерий могут давать колонии разных размеров и внешнего вида на одной и той же чашке. Большинство колоний бифидобактерий выделяют запах уксусной кислоты.

9 Расчет и обработка результатов

9.1    Расчет

Используют все подсчеты на чашках разведений в рамках обсчитываемой обпасти. полученные в 8.7. Обсчитываемая область включает все разведения, для которых ожидаемое среднее количество колоний на чашку хй 300 КОЕ.

Рассчитывают число КОЕ презумптивных бифидобактерий на грамм продукта N по формуле

N=--.    (2)

(л, » Д1л₂ * Д01л₃)<У

где £х, — сумма колоний, подсчитанных на всех оставшихся чашках (8.8); л, — число оставшихся чашек в первом обсчитываемом разведении; п₂ — число оставшихся чашек во втором обсчитываемом разведении; п₃ — число оставшихся чашек в третьем обсчитываемом разведении;

d — коэффициент разбавления, соответствующий первому обсчитываемому оставшемуся разведению.

Если осталось только два обсчитываемых разведения, формула принимает вид:

N =-^-.    (3)

(л, « 01 n₂)d

Определяют надежность подсчета колоний, полученных на параллельных чашках, и последующие разведения в соответствии с ISO 14461-2|IDF 169-2. Для вычисления результата используют только достоверный подсчет (ISO 7218).

9.2    Обработка результатов

Результаты выражают до двух значащих цифр как число КОЕ бифидобактерий на грамм продукта, представляют число от 1.0 до 9.9. умноженное на 10 в соответствующей степени. Достоверность результата по 10.4. ⁵

1

2

3

4

5