Купить ГОСТ 34104-2017 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Распространяется на корма: фуражное зерно, продукты его переработки; растительные корма; комбикорма для продуктивных и непродуктивных животных и сырье для их производства; кормовые добавки и устанавливает метод идентификации генно-модифицированной сои, генно-модифицирован-ной кукурузы и генно-модифицированного рапса методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).
1 Область применения
2 Нормативные ссылки
3 Термины и определения
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности
5 Оборудование, материалы, реагенты
6 Сущность метода
7 Отбор проб
8 Экстракция ДНК
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)
Приложение А (справочное) Требования к ПЦР-лаборатории
Дата введения | 01.07.2018 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.01.2018 |
Актуализация | 01.01.2021 |
01.06.2017 | Утвержден | Межгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации | 51 |
---|---|---|---|
28.06.2017 | Утвержден | Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии | 593-ст |
Разработан | ФГБУ ВГНКИ | ||
Издан | Стандартинформ | 2017 г. |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(МГС)
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(ISC)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
Метод идентификации генетически модифицированных линий сои, кукурузы и рапса с использованием ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
Издание официальное
ГОСТ
34104—
2017
Москва Стандартинформ 2017 |
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 июня 2017 г№ 51)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004—97 |
Кор страны по МК (ИСО 3166)004—97 |
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения |
AM |
Минэкономики Республики Армения |
Беларусь |
BY |
Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан |
КZ |
Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия |
KG |
Кыргызстандарт |
Россия |
RU |
Росстандарт |
Таджикистан |
TJ |
Таджикстаидарт |
Узбекистан |
uz |
Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2017 г. №593-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34104-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
© Стандартинформ. 2017
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Линия ГМ кукурузы |
Последователь ность |
Наименование |
5'-3' последовательность |
Bill |
Целевая |
Bill F |
GCG GAA CCC СТА TTT GTT ТА |
Btll R |
ТСС AAG AAT CCC TCC ATG AG | ||
Bill P |
F AM- AAA TAC ATT CAA ATA TGT АТС CGC TCA -BHQ1 | ||
Растительная |
Adh Bill F |
CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC | |
Adh Btll R |
CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC | ||
Adh Btll P |
R6G- AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA -BHQ1 | ||
Т25 |
Целевая |
T25F |
АСА AGC GTG TCG TGC TCC AC |
T25R |
GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG | ||
T25P |
FAM- TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G -BHQ1 | ||
Растительная |
Adh T25 F |
CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT | |
Adh T25 R |
CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC | ||
Adh T25 P |
R6G- AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1 | ||
MIR604 |
Целевая |
MIR604 F |
GCG CAC GCA ATT CAA CAG |
MIR604 R |
GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT | ||
MIR604 P |
FAM- AGGCGGGAAACGAC AAT CT GAT CAT G-BHQ1 | ||
Растительная |
Adh MIR604 F |
CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC | |
Adh MIR604 R |
CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC | ||
Adh MIR604 P |
R6G- AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1 | ||
MON 88017 |
Целевая |
MON 88017 F |
GAG CAG GAC CTG CAG AAG CT |
MON 88017 R |
TCC GGA GTT GAC CAT CCA | ||
MON 88017 P |
FAM- TCC CGC CTT CAG TTT AAA CAG AGT CGG GT -BHQ1 | ||
Растительная |
Hmg MON 88017 F |
TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA | |
Hmg MON 88017 R |
GCT АСА TAG GGA GCC TTG TCC T | ||
Hmg MON 88017 P |
R6G- CAA TCC АСА CAA ACG CAC GCG ТА -BHQ1 | ||
3272 |
Целевая |
3272 F |
TCA TCA GAC CAG ATT CTC TTT TAT GG |
3272 R |
CGT TTC CCG CCT TCA GTT ТА | ||
3272 P |
FAM- ACT GCT GAC GCG GCC AAA CAC TG -BHQ1 | ||
Растительная |
Adh 3272 F |
CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC | |
Adh 3272 R |
CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC | ||
Adh 3272 P |
R6G- AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA -BHQ1 | ||
MIR162 |
Целевая |
MIR162F |
GCG CGG TGT CAT СТА TGT TAC TAG |
MIR162R |
TGC CTT АТС TGT TGC CTT CAG A | ||
MIR162P |
FAM- TCT AGA CAA TTC AGT АСА TTA AAA ACG TCC GCC A -BHQ1 | ||
Растительная |
Adh MIR162 F |
CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC | |
Adh MIR162 R |
CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC | ||
Adh MIR162 P |
R6G- AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-BHQ1 |
Продолжение таблицы 2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
9 |
Линия ГМ кукурузы |
Последователь ность |
Наименование |
5'-3' последовательность | |
59122 |
Целевая |
59122F |
GGGAT AAGC AAGT AAAAGCGCTC | |
59122 R |
CCTT AATT CT CCGCT CAT GAT C AG | |||
59122 Р |
FAM-TTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAA-BHQ1 | |||
Растительная |
Hmg 59122 F |
GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T | ||
Hmg 59122 R |
TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA | |||
Hmg 59122 P |
R6G-CAA ТСС АСА CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1 | |||
LY038 |
Целевая |
LY038F |
TGG GTT CAG TCT GCG AAT GTT | |
LY038R |
AGG AAT TCG АТА TCA AGC TTA TCG A | |||
LY038P |
FAM-CGA GCG GAG TTT ATG GGT CGA CGG-BHQ1 | |||
Растительная |
Hmg LY038 F |
TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA | ||
Hmg LY038 R |
GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T | |||
Hmg LY038 P |
R6G-CAA ТСС АСА CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1 | |||
DAS-40278-9 |
Целевая |
DAS40278 F |
CAC GAA CCA TTG AGT TAC AAT C | |
DAS40278 R |
TGG TTC ATT GTA TTC TGG CTT TG | |||
DAS40278P |
FAM-CGT AGC TAA CCT TCA TTG TAT TCC G-BHQ1 | |||
Растительная |
Hmg 40278 F |
TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA | ||
Hmg 40278 R |
GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T | |||
Hmg 40278 P |
R6G-CAA ТСС АСА CAA ACG CAC GCG TA-BHQ1 | |||
Таблица 3— рапса |
- Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий | |||
Линия ГМ рапса |
Последователь ность |
Наименование |
5 -3 последовательность | |
GT73 |
Целевая |
RT73-F |
CC AT ATT GACC AT CATACT C ATT GCT | |
RF3-R |
GCTT AT ACGAAGGC AAGAAAAGGA | |||
RT73-Z |
FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ1 | |||
GT73 |
Растительная |
Rape-CTuA-F |
GGCC AGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
CCGT CGTT GTAGAACCATT GG | |||
Rape-cruA-Z |
R6G- AGT CCTT AT GT GCT CC ACTTT CT GGT GC A- BHQ1 | |||
MON88302 |
Целевая |
MON88302-F |
T CCTT GAACCTT ATTTTAT AGT GCACA | |
MON88302-R |
T CAGATT GT CGTTT CCCGCCTT C A | |||
MON88302-Z |
F AM - T AGTC АТС ATGTTGT ACC ACTTС AAAC AC T - В H Q1 | |||
Растительная |
Rape-cruA-F |
GGCC AGGGTTT CCGT GAT | ||
Rape-caiA-R |
CCGT CGTTGTAG AACC ATT GG | |||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTT AT GT GCT CCACTTTCT GGT GCA- BHQ 1 | |||
MSI |
Целевая |
Msl-F |
ACGCT GCGGACAT CTAC ATT | |
MS1-R |
CT AG AT CGG AAGCT GAAGAT GG | |||
MS1-Z |
F AM-CT CATT GCT GAT CCACCTAGCCG ACTT-BHQ 1 |
Линия ГМ рапса |
Последователь ность |
Наименование |
5'-3‘ последовательность |
MSI |
Растительная |
Rape-cruAF |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT |
Rape-cruA-R |
T C AGATT GT CGTTT CCCGC CTT CA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTT AT GT GCT CCACTTT CT GGT GCA-BHQ1 | ||
MS8 |
Целевая |
MS8-F |
GTT AGAAAAAGT AAACAATT AAT AT AGCCGG |
MS8-R |
GGAGGGTGTTTTTGGTTATC | ||
MS8-Z |
FAM-AAT ATAAT CGACGGAT CCCCGGGAATT C-BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruA-F |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
T C AGATT GT CGTTT CCCGC CTTCA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTT AT GT GCT CCACTTT CT GGT GCA-BHQ 1 | ||
Т45 |
Целевая |
T45-F |
C AAT GG ACAC AT G AATT ATGC |
T45-R |
GACT CTGTAT GAACT GTT CGC | ||
T45-Z |
FAM-TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT-BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruA-F |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
T C AGATT GT CGTTT CCCGCCTT CA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTTAT GT GCT CCACTTTCT GGT GCA-BHQ 1 | ||
RF1 |
Целевая |
RF1-F |
CT AAGGG AGGT C AAG AT GT AGC |
RF1-R |
CGGGCCT AACTTTT GGTGTG | ||
RF1-Z |
F AM-CT CAT CAT CCT C ACCCAGT CAGCAT CA- BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruAF |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
T CAGATT GT CGTTT CCCGCCTT CA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTT AT GT GCT CCACTTT CT GGT GCA-BHQ 1 | ||
RF2 |
Целевая |
RF2-F |
GGGT G AG AC AATAT AT CG ACG |
RF2-R |
GGGCATCGCACCGGT GAG | ||
RF2-Z |
F AM-CACCGGCCAAATTCGCTCTT AGCCGT-BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruA-F |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruAR |
T CAGATT GT CGTTT CCCGC CTTCA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTT AT GT GCT CCACTTTCT GGT GCA-BHQ 1 | ||
RF3 |
Целевая |
RF3-F |
CAT AAAGG AAG AT GGAGACTT GAG |
RF3-R |
AGC ATTTAGCAT GT ACC AT C AG AC A | ||
RF3-Z |
F AM-CGCACGCTT AT CGACCAT AAGCCCA-BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruAF |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
T CAGATT GT CGTTT CCCGCCTT CA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGTCCTT AT GT GCT CCACTTT CT GGT GC A-8HQ1 | ||
Topas 19/2 |
Целевая |
TOPAS 19/2-F |
GTT GCGGTT CT GTC AGTT CC |
TOPAS 19/2-R |
CGACCGGCGCT GAT AT AT G A | ||
TOPAS 19/2-Z |
FAM-TCCCGCGTCATCGGCGG-BHQ1 | ||
Растительная |
Rape-cruAF |
GGCCAGGGTTT CCGT GAT | |
Rape-cruA-R |
T CAGATT GTCGTTT CCCGCCTT CA | ||
Rape-cruA-Z |
R6G-AGT CCTTAT GT GCT CCACTTTCT GGT GCA-BHQ 1 |
6.1 Сущность метода идентификации ГМ линий сои. кукурузы и рапса методом ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка видоспецифичной ДНК растений (сои. кукурузы или рапса) и части генно-инженерной конструкции, специфичной для генома тестируемой генетически модифицированной линии.
6.2 Метод состоит из следующих этапов:
- экстракция и очистка ДНК: на данном этапе осуществляется лизис клеток с последующей очисткой ДНК от балластных веществ (белков, полисахаридов и других соединений):
- ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов, меченных флуоресцентным красителем. На данном этапе осуществляется накопление копий целевого участка ДНК и детекция ПЦР-про-дуктов в режиме «реального времени»;
- анализ и интерпретация результатов происходит на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флюоресценции от количества циклов, что соответствует значениям порогового цикла Ct.
Общие правила отбора проб для испытаний должны соблюдаться в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 6497.
8.1 Экстракцию ДНК из анализируемой пробы осуществляют с использованием набора реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом по 5.3 или иным методом, позволяющим получить достаточный объем ДНК для последующих исследований. Объем ДНК. необходимый для проведения исследований. вычисляют по формулам:
где Vи — объем ДНК. необходимый для проведения идентификации линий;
N — количество идентифицируемых линий;
VK=10 2 N. (2)
где VK — объем ДНК, необходимый для проведения количественного анализа.
8.2 Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки № 1 (если они хранились при температуре от 2 °С до 8 “С) прогревают на поверхности твердотельного термостата при температуре от 60 °С до 64 вС до полного растворения кристаллов.
8.3 Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1.5 см3 (включая отрицательный контроль выделения). В пробирки вносят анализируемые пробы. В пробирку отрицательного контроля выделения ДНК вносят 100 мм3 ОКО.
8.4 Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 мм3 буфера для лизирующего реагента и по 17 мм3 лизирующего реагента. Тщательно перемешивают содержимое пробирок на встряхивателе в течение 10 с.
8.5 Пробирки инкубируют в термостате при температуре 64 °С в течение 1 ч. периодически встряхивая на встряхивателе (пять раз через каждые 10—12 мин).
8.6 Нерастворенные частицы анализируемой пробы осаждают центрифугированием при 12—14 тыс. об/мин в течение 5 мин.
8.7 Надосадочную жидкость в объеме 200—350 мм3 очень аккуратно (так. чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и переносят в новые пробирки.
8.8 Пробирки с надосадочной жидкостью прогревают в течение 5 мин в термостате при температуре 64 °С, перемешивают содержимое пробирок и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об/мин для сброса капель с крышки пробирки.
12
8.9 В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм3 сорбента, предварительно помещенного во встряхиватель для получения однородной суспензии. Содержимое пробирок перемешивают на встряхивателе и инкубируют при комнатной температуре в течение 10—15 мин, перемешивая через каждые 2 мин. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
8.10 ВпробиркидобавляютпоЗООмм3растворадляотмывки№1.Перемешиваютнавстряхивате-ле до полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
8.11 Процедуру отмывки повторяют дважды, используя по 500 мм3 раствора для отмывки № 2. и центрифугируют в течение 30 с при 7 тыс. об/мин. удаляют надосадочную жидкость полностью.
8.12 Пробирки с отмытым сорбентом помещают в термостат при температуре 64 *С на 10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны бытьоткрыты.
8.13 В пробирки добавляют по 50 мм3 буфера для элюции ДНК и перемешивают на встряхивателе. Помещают в термостат при температуре 64 *С на 5 мин и периодически (один раз в минуту) встряхивают на встряхивателе. Пробирки центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин.
8.14 Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. которую затем используют для постановки ПЦР и проведения амплификации. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 °С до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 вС. Для этого рекомендуется перенести надосадочную жидкость в чистую микропробирку.
9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси
Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения генетически модифицированной линии сои. кукурузы или рапса берут 1 мм3деионизированнойводы.по1 мм3 каждого соответствующего праймера с маркировкой «F» по 5.3.2 концентрацией 5 1 (Н5моль/дм3. no 1 мм3 каждого праймера с маркировкой «R» по 5.3.2 концентрацией 5 • 10-6 моль/дм3. no 1 мм3 каждого зонда с маркировкой «Р» по
5.3.2 концентрацией 3 10-6 моль/дм3, 3 мм3 раствора дНТФ и смешивают в пробирке вместимостью
1.5 см3. Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 °С — не более 12мес.
9.2 Постановка ПЦР
9.2.1 ДНК. экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее чем в двух повторностях.
9.2.2 Для проведения ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм3 ПЦР-смеси по 9.1, к которой добавляют 5 мм3 ПЦР-буфера и 0.5 мм3 термостабильной Taq полимеразы. Смесь перемешивают на встряхивателе. осаждая кратковременным центрифугированием.
9.2.3 Вносят по 15 мм3 смеси, полученной по 9.2.2, в микропробирку вместимостью 0,2 см3, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм3 ДНК. полученной из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакционной смеси — 25 мм3.
Примечание — Необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
9.3 Контрольные реакции амплификации:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) — вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм3смеси по9.2.2 вносят 10 мм3ТЕ-буфера;
- положительный контроль ПЦР (К+) — вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм3 смеси по 9.2.2 вносят 10 мм31 %-ного стандартного образца состава ГМ сои, ГМ кукурузы или ГМ рапса.
9.4 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Программируют прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Программы амплификации для идентификации линий ГМ сои. кукурузы и рапса различаются для разных ГМ линий и приведены в таблицах 4—11.
Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий 40-3-2, А5547-127, А2704-12 приведена в таблице 4.
13
1 Область применения...................................................1
2 Нормативные ссылки..................................................1
3 Термины и определения................................................2
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности.......................2
5 Оборудование, материалы, реагенты........................................3
6 Сущность метода....................................................12
7 Отбор проб........................................................12
8 Экстракция ДНК.....................................................12
9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
в режиме реального времени (Real Time PCR)..................................13
Приложение А (справочное) Требования к ПЦР-лаборатории.........................19
III
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
КОРМА И КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ
Метод идентификации генетически модифицированных линий сои, кукурузы и рапса с использованием ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального
времени
Feed and feed additives. Method of identification of genetically modified events of soybean, maize and rapeseed using PCR with hybridization-fluorescence detection in real time
Дата введения —2018—07—01
Настоящий стандарт распространяется на корма: фуражное зерно, продукты его переработки; растительные корма; комбикорма для продуктивных и непродуктивных животных и сырье для их производства; кормовые добавки и устанавливает метод идентификации генно-модифицированной сои (далее — ГМ сои), генно-модифицированной кукурузы (далее — ГМ кукурузы) и генно-модифицированного рапса (далее — ГМ рапса) методом полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды, размещение и обслуживание ГОСТ ISO 6497-2014 Корма. Отбор проб
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ ИСО/МЭК17025—2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 24760-81 Халаты медицинские женские. Технические условия ГОСТ 25194-82 Халаты медицинские мужские. Технические условия
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 31719-2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
Издание официальное
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому ретулированию и метролотии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 амплификация: Процесс, многократно увеличивающий число копий фрагмента генома какого-либо организма.
3.2 генно-модифицированные (генно-инженерные, трансгенные) организмы; ГМО: Организм или несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное или многоклеточное образование, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и/или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов.
3.3 линия генно-модифицированного растения (генетически модифицированная линия, ГМ линия): Потомство от одного определенного генно-инженерно-модифицированного организма.
3.4 нуклеиновые кислоты; НК: Макромолекулы, являющиеся носителями генетической информации или выступающие в качестве посредника при синтезе полипептидной цепи.
3.5 нуклеотидная последовательность: Порядок чередования нуклеотидных остатков в НК.
3.6 отрицательный контроль ПЦР; К-: Реакционная смесь для проведения ПЦР. заведомо не содержащая целевой нуклеиновый материал.
3.7 отрицательный контроль выделения (контроль чистоты выделения); КВ: Контроль, прошедший все этапы выделения ДНК. но в отсутствие анализируемой пробы.
3.8 отрицательный контрольный образец: ОКО: Реакционная смесь, используемая вместо анализируемой пробы для контроля чистоты выделения ДНК.
3.9 полимеразная цепная реакция; ПЦР: Циклический ферментативный процесс, результатом которого является получение многочисленных копий определенного участка молекулы ДНК.
3.10 положительный контроль ПЦР; К+: Реакционная смесь для проведения ПЦР. заведомо содержащая целевой нуклеиновый материал.
3.11 полимеразная цепная реакция в режиме реального времени: Полимеразная цепная реакция, проводимая по специальной технологии, которая позволяет регистрировать накопление ПЦР-продуктов в процессе амплификации.
3.12 ПЦР-продукт: Фрагмент ДНК. амплифицированный в ПЦР.
3.13 праймер: Искусственно синтезируемая короткая последовательность нуклеотидов, комплементарная определенному участку целевой ДНК, используемая в полимеразной цепной реакции.
3.14 промотор: Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за начало транскрипции.
3.15 пороговый цикл Ct: Цикл амплификации, в котором кривая флуоресценции исследуемого образца пересекает линию порога (Threshold).
3.16 терминатор: Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. ответственная за прекращение транскрипции.
3.17 целевая ДНК: Выбранная для амплификации последовательность ДНК.
3.18 экстракция ДНК: Обработка анализируемой пробы, высвобождающая ДНК.
3.19 элюция: Извлечение вещества из твердого носителя вымыванием подходящим растворителем.
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК17025, ГОСТ 31719 (приложение А).
4.1.2 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218 и ГОСТ ИСО/МЭК 17025. 1
4.2 Требования безопасности
4.2.1 В лаборатории должно быть организовано обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.2 При работе с химическими реактивами необходимо соблюдать общие требования безопасности обращения с вредными веществами, установленные ГОСТ 12.1.007.
4 .2.3 Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 При работе с электроустановками следует соблюдать требования электробезопасности, установленные в ГОСТ 12.1.019.
4.2.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, должно быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
5.1 Общие требования к оборудованию — поИСО/МЭК 17025.
5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719. с дополнением:
- бокс ламинарный, класс биологической безопасности II тип А2:
- термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 100 вС;
- отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
-центрифуга для микропробирок вместимостью 1.5 см2, со скоростью вращения не менее 12000 об/мин;
- миницентрифуги-встряхиватели с роторами для микропробирок вместимостью 0.2; 0.6 и 1.5 см2, со скоростью вращения не менее 2400 об/мин;
- микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1.5 см2;
- микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0.2 см2;
- одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером объемом 10 мм2,100 мм2.200 мм2,1000 мм2;
- ПЦР-бокс;
- прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени*;
- халаты медицинские по ГОСТ 24760 и ГОСТ 25194;
- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678. обеспечивающий поддержание температуры от 2 °С до 8 вС. с морозильной камерой, обеспечивающей поддержание температуры не выше минус 16 °С.
Допускается использование другого оборудования, материалов стехническими характеристиками не ниже указанных.
Допускается использование роботизированных станций для проболодготовки. выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и раскапывания готовой многокомпонентной смеси для ПЦР.
5.3 При проведении испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК. реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации. Для экстракции ДНК допускается использовать готовые наборы**.
5.3.1 Реагенты:
а) набор реагентов для экстракции ДНК. включающий:
1) буфер для лизирующего реагента, содержащий хаотропный агент гуанидин хлорид;
2) лизирующий реагент, содержащий протеиназу К;
3) раствор для отмывки № 1 для очистки от клеточных белков, содержащий хаотропный агент гуанидин тиоцианат;
* Прибор для проведения ПЦР «Rotor-Gene» 2000/3000/6000 («Corbett Research». Австралия). «Rotor Gene Q» («Qiagen», Германия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
** Примером могут служить наборы «ДНК-СОРБ-С» (ФГБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, форма 1 ref К1-6-50/ver. 05/08/16). «Сорб-ГМО-А» и «Сорб-ГМО-Б* (ЗАО «Синтол». каталожный номер GM-503). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
4) раствор для отмывки № 2 для очистки от солей, содержащий водный раствор изопропилового спирта;
5) сорбент (25 %-ная взвесь частиц силикагеля Si02 размером от 20 до 50 мкм в растворе Трис-НС1 молярной концентрации 5 ммоль/дм3);
6) буфер для элюции ДНК (ТЕ-буфер) — Трис-HCI молярной концентрации 10 ммоль/дм3; натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты молярной концентрации 1 ммоль/дм3;
б) вода деионизированная, класса чистоты I. свободная от рибонуклеаз. дезоксирибонуклеаз, неорганических и органических примесей с удельным сопротивлением не менее 18 Мом см;
в) ПЦР-буферсМдС12;
г) смесь олигонуклеотидов (праймеры) по 5.3.2 или 5.3.3;
д) смесь олигонуклеотидов (зонды, меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G) по
5.3.2 или 5.3.3;
е) раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), содержащий натриевые соли дНТФ со степенью очистки более 98 % и концентрацией каждой 2 моль/дм3;
ж) термостабильная Taq-полимераза;
и) сертифицированные стандартные образцы ГМ линий сои. ГМ линий кукурузы или ГМ линий рапса*.
Допускается использование других реагентов с техническими характеристиками не хуже указанных.
5.3.2 Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК растений допускается использование наборов реагентов (готовых тест-систем), содержащих праймеры, специфичные к ДНК определенного вида растений.
5.3.3 Допускается использование синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий сои. кукурузы и рапса. Список последовательностей всех используемых олигонуклеотидов приведен в таблицах 1—3, где указаны последовательности;
1) для прямых и обратных праймеров и зондов**, специфичных конкретной ГМ линии;
2) прямых и обратных праймеров и зондов, специфичных фрагменту генома растения (ген лектина для сои. ген зеина для кукурузы, ген круциферина А для рапса).
Таблица 1 — Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий сои | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
* Сертифицированные стандартные образцы производства IRMM. Бельгия. AOCS. США (материалы, состоящие из высушенной гомогенизированной муки соевых бобов, рапса или кукурузы, включающих смеси ГМ и не ГМ растений соответствующих видов, содержащие от 0.1 % до 100 % генетически модифицированных материалов). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта. Маркировки в наименовании. «F» — прямой праймер. «R» — обратный праймер. «Р* — зонд. |
Продолжение таблицы 1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 |
Линия ГМ сои |
Поелоловательное тъ |
Наименование |
5 -3 последовательность |
DP-305423 |
Растительная |
Lec305423F |
CCAGCTT CGCCGCTT CCTT C |
Lec305423R |
GAAGGC AAGCCCAT CT GC AAGCC | ||
Lec305423P |
R6G-CTT CACCTT CT AT GCCCCT GAC AC- BHQ1 | ||
DP-356043 |
Целевая |
356043F |
GT CGAAT AGGCTAGGTTT ACGAAAAA |
356043R |
TTT GAT ATT CTT GGAGT AGACG AGAGT GT | ||
356043Р |
F AM-CT CT AG AGAT CCGT С AAC AT GGT GGAGC AC- BH Q1 | ||
Растительная |
Lec356043F |
CCAGCTT CGCCGCTT CCTT C | |
Lec356043R |
GAAGG C AAGCCCAT CT GC AAGCC | ||
Lec356043P |
R6G-CTT CACCTT CT AT GCCCCT GAC AC- BHQ 1 | ||
MON87705 |
Целевая |
Mon87705F |
TT CCCGG AC AT G AAGCC ATTT AC |
Mon87705R |
ACAACGGT GCCTT GGCCC AAAG | ||
Moo87705P |
F AM-AAGAGACT CAGGGT GTTGTTAT CACT GCGG-BH Q1 | ||
Растительная |
LecMon87705F |
CCAGCTT CGCCGCTT CCTT C | |
LecMon87705R |
GAAGGC AAGCCCAT CT GCAAGCC | ||
LecMon87705P |
R6G-CTT CACCTT CT AT GCCCCT GACAC- BHQ 1 | ||
MON87708 |
Целевая |
Moo87708F |
T CAT ACT C ATT GCT GAT CC AT GT AG |
Mon87708R |
AG AAC AAATT AACGAAAAGAC AGAACG | ||
Mon87708P |
F AM- T CCCGGACTTT AGCT С AAAAT GC AT GT A- BH Q1 | ||
Растительная |
LecMon87708F |
CCAGCTT CGCCGCTT CCTT C | |
LecMon87708R |
GAAGGC AAGCCCAT CT GCAAGCC | ||
LecMon87708P |
R6G- CTTC ACCTTCTAT GCCCCT GACAC- BHQ 1 | ||
MON87769 |
Целевая |
Mon87769F |
CAT ACT CATT GCT GAT CCAT GT AG ATT |
Moo87769R |
GC AAGTT GCT CGT GAAGTTTT G | ||
Mon87769P |
FAM-CCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGAC-BHQ1 | ||
Растительная |
LecMon87769F |
CCAGCTT CGCCGCTT CCTT C | |
LecMon87769R |
GAAGGC AAGCCCAT CT GCAAGCC | ||
LecMon87769P |
R6G-CTT CACCTT CT AT GCCCCT GAC AC- BHQ 1 | ||
DAS-44406 |
Целевая |
DAS-44406F |
TTA TTG TTC TTG TTG TTT CCT CTT TAG G |
DAS-44406R |
CCT CAA TTG CGA GCT TTC TAA TTT | ||
DAS-44406P |
FAM- ATT CGG ACC TCC ATG ATG ACC TTA CCG TT -BHQ1 | ||
Растительная |
LecDAS-44406F |
CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC | |
LecDAS-44406R |
GAA GGC AAG CCC АТС TGC AAG CC | ||
LecDAS-44406P |
FAM- CTT CAC CTT СТА TGC CCC TGA CAC- BHQ1 | ||
DAS-81419 |
Целевая |
DAS 81419F |
TCT AGC СТА TAT TTA GCA CTT GAT ATT CAT |
DAS81419R |
GCT TCA AGA TCC CAA CTT GCG | ||
DAS 81419P |
FAM-ATC AAC AGG CAC CGA TGC GCA CCG- BHQ1 |
Окончание таблицы 1 | |||||||||||||||||||||||||||
|
Таблица 2 — Последовательности олиюнуклеотидных праймеров и зондов для идентификации ГМ линий куку-рузы | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
1
2