Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

38 страниц

487.00 ₽

Купить ГОСТ 32429-2013 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Описывает in vivo пробит тест на группе рыб (состоящей из половозрелых самцов и самок в репродуктивном возрасте), подвергающихся воздействию химиката в период ограниченный их биологическим циклом (21 день). По завершении 21-дневного периода воздействия, в зависимости от подопытного вида измеряют один или два биомаркера у самцов и самок в качестве индикаторов эстрогенной, андрогенной активности или ингибирования ароматазы. Этими биомаркерами являются вителлогенин (VTG) и характеристики вторичных половых признаков. Вителлогенин измеряют у гольяна, японской медаки и данио, тогда как вторичные половые признаки определяются только у гольяна и японской медаке. Стандарт не позволяет обнаружить антагонисты андрогенов. Этот тест не предназначен для идентификации конкретных механизмов гормональных разрушений, поскольку подопытные животные обладают здоровой «гипоталамо-гипофизно-гонадной» (ГГГ) осью гормональной регуляции и способны реагировать на вещества, воздействующие на ось ГГГ на различных уровнях.

 Скачать PDF

Стандарт опубликован ТОЛЬКО в электронном виде, имеет неточности, о которых сообщено разработчикам стандарта и в Росстандарт.

Оглавление

1 Область применения

2 Термины и определения

3 Основные положения

4 Принцип теста

5 Критерии достоверности теста

6 Описание метода

7 Процедура

8 Результат и отчет

Приложение А (справочное) Условия эксперимента для определения воздействия на эндокринную систему рыб

Приложение В (рекомендуемое) Некоторые параметры разбавляющей воды

Приложение С (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для данио рерио

Приложение D (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для тупоголового гольяна

Приложение Е (справочное) Оценка вторичных половых признаков у тупоголового гольяна для обнаружения некоторых веществ активных по отношению к эндокринной системе

Приложение F (справочное) Матрица картографирования бугорков

Приложение G (справочное) Оценка вторичных половых признаков у медаки для обнаружения определенных веществ, воздействующих на эндокринную систему

Приложение Н (справочное) Рекомендуемые процедуры для типового определения содержания вителлогенина

Приложение I (справочное) Усиленные образцы вителлогенина, используемые как эталоны при проведении межяабораторного теста

Приложение J (рекомендуемые) Ординограмма статистического анализа

Библиография

 
Дата введения01.08.2014
Добавлен в базу21.05.2015
Актуализация01.02.2020

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

05.11.2013УтвержденМежгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации61-П
22.11.2013УтвержденФедеральное агентство по техническому регулированию и метрологии790-ст
ИзданСтандартинформ2014 г.
РазработанФГУП ВНИЦ СМВ

Testing of chemicals of environmental hazard. 21-day fish assay: a short-term screening for oestrogenic and androgenic activity, and aromatase inhibition

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

32429—

СТАНДАРТ

2013

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Краткосрочное определение ингибирования ароматазы и эстрогенной и андрогенной активности:

21-дневный тест

(OECD, Test No230:2009, IDT)

Издание официальное


Предисловие

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ» (ФГУП «ВНИЦСМВ»)

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 5 ноября 2013 г. № 61-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИС0 3166) 004-97

Код страны по МК

(ИС0 3166) 004 -97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Азербайджан

AZ

Азстандарт

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Россия

RU

Росстандарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

Украина

UA

Минэкономразвития Украины

4    Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD Test No 230 «21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition» (ОЭСР Тест № 230 «Краткосрочное определение ингибирования ароматазы и эстрогенной андрогенной активности: 21-дневный тест»).

Перевод с английского языка (ел).

Степень соответствия - идентичная (IDT)

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г.№ 790-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32429-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2014 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ГОСТ 32429-2013

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 32429-2013

Содержание

1    Область применения........................................................................ 1

2    Термины и определения................................................................. 1

3    Основные положения....................................................................... 1

4    Принцип теста................................................................................... 2

5    Критерии достоверности теста.............................................................. 2

6    Описание метода.............................................................................. 3

7    Процедура.................................................................................. 4

8    Результат и отчет    6

Приложение А (справочное) Условия эксперимента для определения

воздействия на эндокринную систему рыб    9

Приложение В (рекомендуемое) Некоторые параметры разбавляющей

воды    11

Приложение С (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для данио рерио    12

Приложение D (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для тупоголового

гольяна    13

Приложение Е (справочное) Оценка вторичных половых признаков у тупоголового гольяна для обнаружения некоторых веществ активных по

отношению к эндокринной системе    14

Приложение F (справочное) Матрица картографирования бугорков    16

Приложение F (справочное) Матрица картографирования бугорков    17

Приложение Н (справочное) Рекомендуемые процедуры для типового

определения содержания вителлогенина    19

Приложение I (справочное) Усиленные образцы вителлогенина.

используемые как эталоны при проведении межлабораторного теста    27

Приложение J (рекомендуемые) Ординограмма статистического

анализа    28

Библиография    30

IV

ГОСТ 32429-2013

Введение

Разработка и валидация теста на рыбах, позволяющего обнаружить вещества, воздействующие на эндокринную систему, вызвано присутствием в окружающей среде химикатов, которые могут вызвать неблагоприятные эффекты у человека и в дикой природе из-за их взаимодействия с эндокринной системой организма.

21-дневный тест на рыбах для скрининга эндокринных расстройств подвергся обширной программе проверки достоверности, состоящей из межлабораторных исследований с рядом химикатов, для демонстрации актуальности и надежности теста для обнаружения эстрогенов и ароматаз ингибирующих веществ на трех видах рыб (тупоголовый гальян (Pimephales promelas), медака японская (Oryzias latipes) и данио (Danio rerio)); обнаружение андрогенной активности возможно у гольяна и медаки, но не у данио.

Пробит тест на воспроизводство рыбы в соответствии с OECD [229] включает подсчет плодовитости и в сжатой форме гистопатологию гольяна, так же как все наблюдаемые параметры, включенные в настоящий стандарт.

OECD (229] позволяет обнаруживать вещества, которые влияют на размножение с помощью различных механизмов, в том числе и эндокринных. Эти различия между двумя методиками должны быть приняты во внимание, чтобы выбрать тот, который наилучшим образом соответствует задачам эксперимента.

V

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ

ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Краткосрочное определение ингибирования ароматазы и эстрогенной и андрогенной

активности: 21-дневный тест

Testing of chemicals of environmental hazard. 21-day Fish Assay A Short-Term Screening for Oestrogenic and

Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition

Дата введения - 2014-09-01

1    Область применения

Настоящий стандарт описывает in vivo пробит тест на группе рыб (состоящей из половозрелых самцов и самок в репродуктивном возрасте), подвергающихся воздействию химиката в период ограниченный их биологическим циклом (21 день). По завершении 21-дневного периода воздействия, в зависимости от подопытного вида измеряют один или два биомаркера у самцов и самок в качестве индикаторов эстрогенной, андрогенной активности или ингибирования ароматазы. Этими биомаркерами являются вителлогенин (VTG) и характеристики вторичных половых признаков Вителлогенин измеряют у гольяна, японской медаки и данио, тогда как вторичные половые признаки определяются только у гольяна и японской медаке.

Настоящий стандарт не позволяет обнаружить антагонисты андрогенов. Этот тест не предназначен для идентификации конкретных механизмов гормональных разрушений, поскольку подопытные животные обладают здоровой «гипоталамо-гипофизно-гонадной» (ГГГ) осью гормональной регуляции и способны реагировать на вещества, воздействующие на ось ГГГ на различных уровнях.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применимы термины с соответствующими определениями:

2.1    величина загрузки: Живой вес рыбки в объем воды.

2.2    вителлогенин фосфолипогликопротеин (VTG): Предшественник белка желтка яйца, который обычно синтезируется у сексуально активных самок всех яйцекладущих видов.

2.3    максимальная допускаемая концентрация (МДК): составляет приблизительно 10 % LC».

2.4    ось HPG: Гипоталамическая гипофизарная гонадальная ось

2.5    плотность заселения: Количество рыбок в объеме воды.

3    Основные положения

3.1    Вителлогенин (VTG) обычно производится печенью самок яйцекладущих позвоночных животных в ответ на циркуляцию эндогенного эстрогена, предшественника белков яичного желтка, который производится печенью и затем переносится кровотоком в яичники, где используется в развитии и изменении ооцитов. Вителлогенин практически не обнаруживаем в плазме незрелых самок и самцов рыб, потому что они испытывают недостаток в эстрогене; однако их печень способна к синтезу и выделению вителлогенина в ответ на экзогенную стимуляцию эстрогена.

3.2    Измерение вителлогенина используется для обнаружения веществ с различными антиэстрогенными свойствами. Обнаружение антиэстрогенных химических веществ возможно через измерение индукции вителлогенина у самцов рыб. Индукция вителлогенина была также продемонстрирована после экспонирования ароматизированными андрогенами. Снижение уровня циркулирующих эстрогенов у самок в результате, например, ингибирование ароматазы, фермента, который превращает андрогены в эндогенные эстрогены в естественных условиях (17р эстрадиол), приводит к снижению уровня вителлогенина, используемого для обнаружения ингибиторов ароматазы. Биологическая значимость реакция вителлогенина в ответ на ингибирование эстрогена /ароматазы установлена и хорошо изучена. Однако производство VTG у самок также может быть изменено токсическим действием веществ, не обладающих эндокринной токсичностью (например.

гепатотоксичность).__

Издание официальное

1

3.3    Несколько методов измерения были успешно разработаны и стандартизированы для повседневного использования. Это касается конкретных видов иммуноферментного анализа (ИФА), использующихся в иммунохимии методов для количественного определения вителлогенина, синтезированного в малых образцах крови или печени, собранных от отдельных особей рыб. Образцы для измерения VTG отбирают у трех видов: тупоголового гольяна (кровь), данио рерио (кровь или гомогенат) головы/хвоста и медаки японской (печень). У медаки наблюдается хорошая корреляция между концентрацией VTG, измеренной в крови и печени. Наборы для измерения вителлогенина широко доступны; такие наборы должны быть основаны на утвержденном видоспецифичном методе ELISA.

3.4    Вторичные половые признаки у самцов рыб отдельных видов являются вполне различимыми, определяются количественно и реагируют на уровни циркулирующих эндогенных андрогенов, в случае толстоголового гольяна и медаки. но не для данио рерио. не обладающего вторичными половыми признаками, которые возможно измерить количественно. Самки обнаруживают способность формировать мужские вторичные половые признаки, когда они подвергаются действию андрогенных веществ в воде. Уменьшение вторичных половых признаков у самцов следует интерпретировать с осторожностью из-за низкой статистической достоверности, и они должны быть подтверждены экспертными оценками и убедительными доказательствами. Существуют ограничения к использованию данио рерио в этом пробит анализе, в связи с отсутствием измеримых вторичных половых признаков, чувствительных к действию андрогенотоксичных веществам.

3.5    У толстоголового гольяна главным индикатором воздействия экзогенного андрогена является количество брачных бугорков, расположенных на передней части головы самки. У медаки главным маркером экзогенного воздействия андрогенов является число папиллярных бугорков у самок рыб.

4    Принцип теста

4.1    В пробит анализе самцы и самки рыб репродуктивного возраста подвергаются воздействию совместно в тестовых сосудах. Состояние разведения позволяет дифференцировать каждый пол. и таким образом связать результаты с анализом каждой конечной точки, что гарантирует их чувствительность к экзогенным химическим веществам. По завершению теста пол подтверждается макроскопическим исследованием гонад после вскрытия брюшной полости ножницами.

Исследование начинают с отбора рыб. из поголовья, которое находится в состоянии икрометания: старые животные не должны использоваться. Исследование проводится с использованием трех концентраций воздействия химического вещества, плюс «чистый» контроль, и контрольная проба с растворителем, если это необходимо. Используют два параллельных испытания (каждый сосуд, содержит пять самцов и пять самок) для медаки или данио рерио, тогда как для гольяна используют четыре репликации (каждый сосуд, содержит двух самцов и четырех самкок). Этот принцип учитывает территориальное поведение самцов тупоголового гольяна, сохраняя при этом достаточную точность анализа. Время экспозиции составляет 21 день, отбор образцов также осуществляется на 21 день.

4.2    На 21 день все рыбы подвергаются эвтаназии. Вторичные половые признаки измеряют на толстоголовом гольяне и медаке; отбирают образцы крови для определения вителлогенина у данио рерио и гольяна, альтернативно голова/хвост могут быть отобраны для определения вителлогенина у данио рерио: печень собриряют для анализа VTG у медаки.

5    Критерии достоверности теста

Для результатов теста могут быть применены следующие условия:

-смертность в воде (или растворителе) не должна превысить 10 процентов на момент окончания периода воздействия:

-концентрация растворенного кислорода должна составлять, по крайней мере. 60 процентов от концентрации насыщения кислородом воды при температуре эксперимента;

-температура воды не должна колебаться более, чем на ± 1,5 °С между тестовыми сосудами в любой момент проведения теста, и поддерживаться в пределах диапазона в 2 °С. определенных для тестируемых видов;

-полученные данные должны демонстрировать, что концентрации тестируемого вещества в растворе поддерживаются в пределах ± 20 % от средневзвешенных значений.

2

ГОСТ 32429-2013

6 Описание метода

6.1    Оборудование

Стандартное лабораторное оборудование, в частности.

-    кислородомеры и pH метры;

-    оборудование для определения жесткости и щелочности воды;

-    надлежащий прибор для контроля температуры, предпочтительно непрерывного действия;

-    емкости, выполненные из химически инертного материала и имеющие обьем соответствующий рекомендуемой загрузке и плотности заселения;

-    свежий субстрат для тупоголового гольяна и данио рерио;

-    весы соответствующего класса точности (± 0.5 мг).

6.2    Вода

Для эксперимента может использоваться любая вода, которая обеспечивает условия долговременного выживания и рост тестовых видов. Она должна иметь постоянные характеристики в течение проведения теста. pH воды должно быть в диапазоне от 6,5 до 8.5. но во время теста это значение должно колебаться в пределах ± 0.5. Чтобы гарантировать, что вода, используемая для разбавления, не будет влиять на результаты эксперимента (например, путем образования комплексов с тестируемым веществом), должны быть взяты пробы воды для анализа. Необходимо каждые три месяца в разбавляющей воде измерять концентрацию тяжелых металлов (Си. Pb. Zn. Hg. Cd. N и тд.), основных анионов и катионов (Са. Mr. Na. К. Cl, S04 и т. д), пестицидов (общее содержание фосфор и хлорорганических веществ), содержание общего органического углерода и сухого остатка для того, чтобы иметь уверенность в том. что вода является относительно постоянной по своему составу. Если существуют доказательства того, что качество воды постоянно в течение года, определения могут быть менее частыми (например, каждые шесть месяцев).

6.3    Тестовые растворы

6.3.1    Тестовые растворы требуемых концентраций готовятся путем разбавления основного раствора. Основной раствор подготавливается путем растворения необходимых веществ 8 воде с использованием механических средств (например, магнитные или ультразвуковые мешалки). Для получения необходимого концентрированного раствора можно использовать таблицы растворимости. Использование растворителей не рекомендуется. Однако, в случае, если это необходимо, нужно отдельно поставить контрольную пробу с растворителем в той же самой концентрации, что и в эксперименте. Выбор растворителя будет определен химическими свойствами вещества. Рекомендуемая максимальная концентрация растворителя 100 мкл/л.

Рекомендуется минимизировать концентрацию растворителя везде, где это технически выполнимо (в зависимости от физико-химических свойств тестируемого вещества).

6.3.2    Может быть использован динамический (проточный) тип эксперимента. Такой тест требует установки системы непрерывного распределения и разбавления основного раствора тестируемого вещества (например, дозаторный насос, пропорциональный разбавитель, система растворения), для обеспечения ряда концентраций в тестовых аквариумах. Объемные скорости потока основных растворов и разбавляющей воды должны проверяться регулярно, предпочтительно ежедневно, во время теста и не должны меняться более чем на 10 % в течение теста. Необходимо с осторожностью использовать низкосортные пластиковые трубки или другие материалы, которые могут содержать биологически активные вещества. Выбирая материал для перекачивающей системы, необходимо учитывать возможную адсорбцию испытательного вещества на этом материале.

6.4    Содержание рыб

6.4.1    Подопытные рыбы должны быть отобраны из лабораторий, предпочтительно из одной лаборатории, которые акклиматизированы в течение, по крайней мере, двух недель до теста при тех же условиях качества воды и освещения, которые используются в эксперименте. Важно соблюдать норму заселения в аквариумы для каждого вида рыб.

6.4.2    После 48-часового периода акклиматизации регистрируют смертность по следующим параметрам:

-    более чем 10 % смертность выборки через семь дней: исключают из эксперимента всю группу;

-    смертность между 5 % и 10 % выборки: акклиматизация в течение семи дополнительных дней; если больше, чем 5 % смертность в течение дополнительных семи дней: исключают из эксперимента всю группу.

-    смертность меньше 5 % выборки через семь дней: рыбы допускаются к тесту.

6 4 3 Рыбы не должны получать лечение в случае болезни во время периода акклиматизации, в период перед экспозицией или во время теста.

6.5    Предварительная экспозиция и выбор рыб

6.5.1 Рекомендуется недельный период предварительной экспозиции с рыбками, помещенными

3

в емкости аналогичные реальному тесту. Рыб необходимо хорошо кормить в течение периода акклиматизации и экспозиции. Период экспозиции начинают с отбора взрослых сексуально диморфных особей из лабораторной поставки половозрелых животных (например, с выраженными вторичными половыми признаками, заметными у тупоголового гольяна и медаки). пригодными для разведения. Для ориентира (эти критерии не могут рассматриваться изолировано от фактически наблюдаемого репродуктивного статуса конкретных рыб), тупоголовый гольян должен быть приблизительно (20 ± 2) недельного возраста, при условии, что рыбки выращивались при температуре (25 ± 2) *С в течение всей продолжительности жизни. Японская медака должна быть в возрасте приблизительно (16 ± 2) недель, содержащаяся при (25±2)°С в течение всей жизни Данио рерио должны быть приблизительно в возрасте (16 ± 2) недель при культивировании при (26± 2) вС.

6.6 Концепция теста

6.6.1    Три концентрации тестируемого вещества, один контроль (вода) и. если необходимо, один контроль с используемым растворителем. Данные могут быть объектом статистического анализа, позволяющего определить статистически значимые различия между результатами контроля и эксперимента. Статистическая обработка полезна для установления других возможных долгосрочных негативных эффектов (например, выживание, развитие, рост и воспроизводство) вещества.

6.6.2    Для данио и медаки на 21 день эксперимента в экспериментальных группах каждой тестируемой концентрации (пять самцов и пять самок в каждой из двух повторностей) и в контроле(ях) берут пробы на виллогенин, и вторичные половые признаки, где это применимо. Для тупоголового гольяна на 21 день экспозиции самцов и самок (два самца и четыре самки в каждой из четырех репликаций), и в контроле(ях) берут пробы для измерения вителлогенина. и проверки вторичных половых признаков.

6.6.3    Выбор тестовых концентраций

6.6.3.1    Для этого теста самой высокой тестируемой концентрацией должна быть максимально допускаемая концентрация (МДК). установленная в ходе предварительного эксперимента или других данных токсичности, или ее принимают равной 10 мг/л, или определяют, исходя из максимальной растворимости в воде, выбирая самую низкую концентрацию. МДК определяют как самую высокую тестовую концентрацию вещества, которая приводит к менее, чем 10 % смертности. Использование этого подхода предполагает, что существуют эмпирические данные по острой или другой токсичности, по которым может быть оценена МДК Оценка МДК может быть неточной и обычно требует некоторого обсуждения.

6.6.3.2    Требуются три тестовые концентрации с постоянным фактором, не превышающим 10. и контроль без вещества (в случае необходимости, и кроме того контроль с растворителем). Рекомендуется диапазон факторов разбавления между 3.2 и 10.

7 Процедура

7.1    Выбор и взвешивание экспериментальных рыб

Важно минимизировать разброс в весе рыбы в начале теста. Соответствующий диапазон размеров различных видов, рекомендуемых для теста, приведен в приложении А. Для всей партии рыб используемых в тесте, диапазон весов отдельно для самцов и самок должен находиться по возможности в пределах 20 % от среднеарифметического веса рыбы одного и того же пола. Рекомендуется взвесить подвыборки в партии рыб для оценки среднего веса перед началом эксперимента.

7.2    Условия экспонирования

7.2.1    Продолжительность

Продолжительность теста - 21 день после периода предварительной экспозиции. Рекомендуемый период предварительной экспозиции-одна неделя.

7.2.2    Кормление

7.2.2.1    Рыб необходимо кормить соответствующим кормом в объемах достаточных для поддержания физической формы. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать роста микроорганизмов и помутнения воды. Рекомендуется ежедневную порцию разделить на две или три равных части для многократного кормления в сутки, разделяя каждое кормление, по крайней мере, трехчасовым промежутком. Корм можно давать одной большой порцией во время выходных дней. Кормление необходимо прекратить за 12 часов до начала выборки/вскрытия животных.

7.2.2.2    Пища рыбы должна быть проверена на наличие загрязняющих примесей, таких как хлорорганические пестициды, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). полихлорированные бифенилы (ПХБ). Корм с высоким уровнем фитоэстрогенов, который может поставить под угрозу точность анализа, как известные антагонисты эстрогена (например. 17р эстрадиол) недопустим.

4

ГОСТ 32429-2013

7.2.2.3    Несъеденная пища и фекалии должны удаляться из тестовых емкостей, по крайней мере, два раза в неделю, например, с помощью тщательной очистки дна с помощью сифона.

7.2.3    Свет и температура

Фотопериод и температура воды должны соответствовать требованиям содержания видов.

7.3    Частота аналитических измерений

7.3.1    До начала периода экспозиции должна быть проверена система внесения вещества. Все необходимые аналитические методы должны быть проведены, включая информацию о стабильности вещества, в тестируемой среде. Во время теста концентрацию тестируемого вещества определяют через равные промежутки по следующим параметрам: объемные скорости потока растворителя и основного раствора изучаемого вещества. Измерения осуществляют по возможности ежедневно, но реже чем два раза в неделю, они не должны изменяться более, чем на 10 % в течение теста. Рекомендуется измерить фактические концентрации вещества всех сосудах в начале теста и в еженедельных интервалах после этого.

7.3.2    Рекомендуется обосновывать результаты на измеренных концентрациях. Если концентрация тестового вещества в растворе была удовлетворительно поддержана в пределах ±20 % от номинальной концентрации в течение всего теста, то результаты могут быть привязаны или к номинальной концентрации, или к измеренным значениям.

7.3.3    При необходимости образцы должны быть отфильтрованы (например, с помощью фильтра с размерами пор 0.45 мкм) или отцентрифугированы. Центрифугирование является предпочтительным. Если тестируемое вещество не адсорбирует на фильтры, фильтрация приемлема.

7.3.4    Во время теста растворенный кислород, температура и pH среды должны измеряться во всех тестовых сосудах, по крайней мере, раз в неделю. Общая жесткость и щелочность должны измеряться в одном сосуде с самой высокой концентрацией раз в неделю. Температура должна проверяться непрерывно, по крайней мере, в одном тестовом сосуде.

7.4    Наблюдения

Ряд общих биологических реакций (выживание, например) и целевых тестов (уровни вителлогенина. например), оцениваются в ходе или по окончании теста. Количественный контроль плодовитости можно, при необходимости, проводить ежедневно. Измерения и оценки этих биомаркеров, и их полезность, описываются далее в данном руководстве

7.4.1    Выживаемость

Рыбки должны обследоваться ежедневно во время тестового периода и смертность в этот период должна регистрироваться. Мертвые рыбки должны удаляться как можно скорее. Заменять мертвых рыбок в контроле или в тестовых сосудах нельзя. Пол рыб. которые гибнут во время теста, должен быть определен макроскопической оценкой гонад.

7.4.2    Поведение и внешний вид

7.4.2.1    Любое отклонение в поведении (относительно контроля) должно быть отмечено: это может быть проявлением общей токсичности, включая гипервентиляцию, нескоординированное плавание, потерю равновесия, неподвижность или атипичное кормление. Следует также отмечать любые внешние аномалии (например, кровотечение, изменение цвета). Следует проявлять осторожность при интерпретации этих признаков токсичности, так как они не являются надежными свидетельствами биомаркеров о потенциальном воздействии на эндокринную систему. Эти наблюдения могут также предоставить качественную информацию полезную для планирования будущих экспериментов на рыбках. Например, территориальную агрессивность самцов или маскулинизацию самок у толстоголового гольяна под воздействием андрогенов. Характерное поведение данио выметывать икру с первыми лучами солнца может меняться под воздействием эстрогенов или антиандрогенов.

7.4.2.2    Наблюдения за качественными изменениями в поведении рыбок важны так же и при отборе экспериментальных животных. Некоторые активные для эндокринной системы вещества могут немедленно повлиять на следующие особенности поведения тупоголового гольяна: окраска (осветление или потемнение), равномерность окраски (наличие вертикальных полос) и форма тела (в районе головы и груди). Поэтому наблюдения за физическим появлением рыбы должны проводиться в течение всего теста вплоть до его завершения.

7.4.3 Эвтаназия рыбы

На 21 день, то есть при завершении экспозиции, рыбки должны быть подвергнуты эвтаназии с помощью раствора трикаина (трикаина метансульфонат. Metacain, MS 222 (CAS 886-86-2) в концентрации от 100 до 500 мг/л. буферизованного с 300 мг/л NaHC03 (CAS 144-55-8). предназначенного для снижения раздражения слизистой оболочки: затем собирают кровь и ткань для определения вителлогенина.

5