МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Испытание ряски на угнетение роста

(OECD, Test № 221:2006, IDT)

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения. обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ» (ФГУП «ВНИЦСМВ»);

Техническим комитетом по стандартизации ТК 339 «Безопасность сырья, материалов и веществ» Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии;

Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации ТК 339 «Безопасность сырья, материалов и веществ»

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

дарт)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 5 ноября 2013 г. № 61-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Азербайджан AZ Азстандарт Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Киргизия KG Кыргызстаидарт Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт Таджикистан TJ Т аджике тандар т Туркменистан TM Главгосслужба «Туркменстандартлары» Узбекистан uz Узстандарт Украина UA Минэкономразвития Украины

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 778-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32426-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2014 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту OECD Test No. 221:2006 «Lemna sp. Growth Inhibition» (Испытание ряски на угнетение роста).

Перевод с английского языка (ел).

Степень соответствия — идентичная (IDT)

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячных информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомления и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 32426-2013

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Термины и определения..........................................1

3    Принцип теста................................................2

3.1    Основные положения.........................................2

3.2    Информация относительно тестируемого вещества........................3

3.3    Применимость теста..........................................3

3.4    Референтное вещество........................................3

4    Описание метода..............................................3

4.1    Оборудование.............................................3

4.2    Тестовый организм..........................................3

4.3    Культура................................................4

4.4    Тестовая среда............................................4

4.5    Экспериментальный раствор.....................................4

4.6    Тестовые и контрольные группы...................................5

4.7    Воздействие..............................................5

4.8    Условия инкубации..........................................6

4.9    Продолжительность..........................................6

4.10    Измерения и аналитические определения.............................6

4.11    Частота измерений и аналитических определений........................7

4.12    Лимитирующий тест.........................................7

5    Результаты и отчет.............................................7

5.1    Время удвоения............................................7

5.2    Переменные..............................................8

5.3    Средняя удельная скорость роста..................................8

5.4    Урожайность..............................................9

5.5    Кривая концентрация-эффект....................................9

5.6    Оценка ЕСх..............................................9

5.7    Статистические методы........................................9

5.8    Отчет.................................................10

Приложение А (справочное) Описание Lemna spp.............................12

Приложение В (справочное) Обслуживание маточной культуры.....................14

Приложение С (рекомендуемое) Питательная (культивационная) среда................15

Библиография................................................19

III

ГОСТ 32426-2013

Введение

Настоящий стандарт описывает определение токсичности веществ с использованием видов: ряска горбатая (Lemna gibba) и ряска малая (Lemna minor). Таксономия Lemna spp. является трудоемкой по причине существования большого количества фенотипов. Хотя Lemna может проявить генетическую изменчивость в качестве ответной реакции на яды. в настоящее время недостаточно данных по вопросу этой изменчивости, чтобы рекомендовать для использования какую-либо определенную генетическую линию. Необходимо отметить, что тест не проводят в стерильных (аксенных) условиях, но он включает процедуры по минимизации другими организмами.

Метод основан на руководящих принципах [1]—(6], но включает модификации этих методов, отражая недавние исследования и консультацию в ряде ключевых вопросов. Предложенный метод был утвержден международным межлабораторным тестом [7].

Описаны детали тестирования с обновлением (полустатический и проточный эксперименты) и без обновления (статический) культивационной среды. В зависимости от целей рекомендуется применять полустатический и проточный эксперименты для летучих, фотодеградируемых. выпадающих в осадок и биоразлагаемых веществ, дополнительное руководство дано в (8).

IV

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Испытание ряски на угнетение роста

Testing of chemicals of environmental hazard. Lemna spp. growth inhibition test

Дата введения — 2014—08—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод оценки токсичности веществ по действию на пресноводные растения рода Lemna (ряска).

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1    биомасса (Biomass): Сухой вес живого вещества, присутствующего в популяции. В рамках этого теста биомасса измеряется косвенно, как правило, по количеству пластинок и площади их покрытия. поэтому термин «биомасса» относится к этим параметрам.

2.2    хлороз (Chlorosis): Пожелтение зеленой пластинки.

2.3    клон (Clone): Организм или клетка, появившиеся от одной особи неполовым путем. Организмы одного и того же клона генетически идентичны.

2.4    колония (Colony): Означает совокупность пластинок материнской и дочерней особей (обычно две-четыре), прикрепленных друг к другу. Иногда используют термин «растение».

2.5    ЕС_Ж: Концентрация тестируемого вещества, растворенного в тестируемой среде, которая приводит к сокращению роста Lemna на х % (например. 50 %) в пределах установленного периода воздействия (с точным указанием на стандартную продолжительность или продолжительность теста). Чтобы однозначно различать значения ЕС на измеряемые темпы роста, используют символ «Е,С» для темпа роста и «Е_уС» для урожайности.

2.6    проточный (динамический) тест (Flow-throwing): Тест, в котором тестовые растворы непрерывно обновляются.

2.7    пластинка (зеленая пластинка) (Frond): Индивидуальная/единственная «листоподобная» структура растения ряски. Редуцированные лист и стебель растения. Это наименьшая единица ряски, способная к воспроизводству.

2.8    горб (Gibbosity): Вздутие или утолщение, появляющееся на пластинке.

2.9    рост (Growth): Увеличение измеряемой переменной (например, количества пластинок, сухого веса, живого веса или площади покрытия пластинок) за период тестирования.

2.10    скорость (темп) роста (средний удельный темп (скорость) роста) (Growth rate (average specific growth rate)): Логарифмическое увеличение биомассы во время периода воздействия.

2.11    наименьшая эффективная наблюдаемая концентрация (Lowest Observed Effect Concentration (LOEC): Самая низкая концентрация, при которой вещество оказывает статистически достоверный ингибирующий эффект на рост (р < 0,05) при сравнении с контролем, в пределах определенного периода воздействия. Однако все тестируемые концентрации выше LOEC должны иметь токсический эффект, равный или больший LOEC. Если эти два условия не могут быть выполнены, должно быть дано развернутое объяснение для полученного LOEC (и. следовательно. NOEC).

Изданио официальное

ГОСТ 32426-2013

2.12    измеряемые переменные (Measurement variables): Все типы переменных, которые измеряются в течение теста по одному или нескольким параметрам. В настоящем стандарте имеются в виду количество пластинок, живой и сухой вес.

2.13    монокультура (Monoculture): Культура с одного вида растений.

2.14    некроз (Necrosis): Мертвые ткани пластинок (то есть побелевшие или утонувшие).

2.15    неэффективная наблюдаемая концентрация (No Observed Effect Concentration (NOEC): Тестовая концентрация, меньшая LOEC.

2.16    фенотип (Phenotype): Видимые особенности организма, определенного взаимодействием его генов с окружающей средой.

2.17    изучаемая переменная (Response variable): Переменные для оценки токсичности, полученной из любого измеряемого параметра, описывающие биомассу различными методами расчета. В настоящем стандарте это темп роста и урожайность, полученные из таких измеряемых переменных, как количество пластинок, живой или сухой вес. площадь поверхности пластинок.

2.18    полустатический тест (Semi-static (renewal) test): Тест, в котором тестовый раствор периодически заменяется в определенные интервалы времени во время теста.

2.19    статический тест (Static test): Метод тестирования без обновления тестируемого раствора во время эксперимента.

2.20    изучаемое влияние (Test endpoint): Общий фактор, который будет изменяться по сравнению с контрольным (далее — контроль) тестируемого вещества. В настоящем стандарте изучаемое влияние — ингибирование роста, который может быть выражен различными изучаемыми переменными. основанными на одной или более измеряемых переменных.

2.21    тестовая (экспериментальная) среда (Test medium): Полностью синтетическая среда, в которой растут тестовые растения и в которую добавляют тестируемое вещество. Тестируемое вещество обычно растворяется в тестовой среде.

2.22    урожайность (Yield): Изучаемая переменная, выражающая биомассу в конце периода воздействия за вычетом этой переменной в начале теста.

3 Принцип теста

3.1    Основные положения

3.1.1    Монокультура растений рода Lemna в экспоненциальной фазе роста содержится в различных концентрациях тестируемого вещества в течение семи дней. Цель теста состоит в том, чтобы определить количество связанных с веществом эффектов на рост растений за этот период, основанный на оценках выбранных переменных. Количество зеленых пластинок - основная из измеряемых переменных, но также измеряют по крайней мере еще одну переменную (общую площадь листьев, сухой вес или живой вес), так как некоторые вещества могут влиять на другие параметры значительно сильнее, чем на количество зеленых пластинок. Для количественной оценки эффектов, связанных с веществом, рост ряски в тестируемом растворе сравнивают с контролем, и концентрацию, вызывающую х % ингибирования роста (например. 50 %). определяют как ЕС_Х (например. ЕС_М).

3.1.2    В данном исследовании наблюдаемый эффект торможения роста выражается в виде логарифмического увеличения переменной (средняя удельная скорость роста) в течение периода воздействия. Концентрация, вызывающая процент ингибирования роста (например. 50 %). определяется по средней удельной скорости роста по отношению к серии разбавлений и выражается в Е,С_Х (например. Е_ГС_М). От средних определенных темпов роста, зарегистрированных в ряду испытательных решений, концентрация, вызывающая указанное замедление темпа роста на х % (например, 50 %), определена и выражена как Е_ГС_Х (например. Е,^).

3.1.3    Основной тест также включает различные дополнительные исследования, используемые в методиках некоторых стран. Они определяются как разница между измерениями в конце и в начале периода воздействия. Концентрация, вызывающая процент ингибирования роста (например. 50 %). определяется по средней удельной скорости роста по отношению к серии разбавлений и выражается в Е_ГС_Х (например. ЕС_Ю). От установленного среднего темпа роста, зарегистрированного в серии тестируемых концентраций, концентрация, вызывающая указанное х % ингибирование темпа роста (например. 50 %). определена и выражена как Е_ГС_Х (например. Е,^).

3.1.4    Дополнительно могут быть статистически определены самая низкая вызывающая эффект концентрация (LOEC) и концентрация, не вызывающая эффекта (NOEC).

2

ГОСТ 32426-2013

3.2 Информация относительно тестируемого вещества

3.2.1    Должен существовать достаточно чувствительный аналитический метод для определения количества вещества в тестируемой среде.

3.2.2    Информация о тестируемом веществе включает структурную формулу, чистоту, растворимость в воде, стабильность в воде и на свету, рК_а, К,*,. давление паров и способность к биодеградации. Растворимость в воде и давление паров можно использовать для расчета константы Генри, которая показывает вероятность существенных потерь тестируемого вещества во время тестирования. Это поможет узнать, нужны ли специфические меры для управления такими потерями. Если информация относительно растворимости и стабильности тестируемого вещества сомнительна, рекомендуется провести оценку в условиях теста, то есть в культивационной среде, температуре, режиме освещения, который будет использован в тесте.

3.2.3    Контроль pH среды может быть особенно важен, например, при тестировании металлов или нестабильных веществ в воде. В этом случае рекомендуется дополнительно к культивационной среде использовать буфер (см. 4.4). Более подробные пояснения по тестированию веществ с физико-химическими свойствами, затрудняющими исследование, представлены в [8].

3.3    Применимость теста

Результаты теста считают достоверными, если время удвоения количества зеленых пластинок в контроле составляет меньше 2.5 дня (60 часов), соответствуя приблизительно семикратному увеличению через семь дней и средним удельным темпам роста 0,275 день^-1. Использование культивационной среды и условия эксперимента, описанные в настоящем стандарте, позволяют достичь этого критерия в статичном тесте (5). Этот критерий также достижим при полустатичном и проточном экспериментах. Расчет времени удвоения приведен в 5.1.

3.4    Референтное вещество

Для проверки процедуры тестирования можно использовать референтные вещества, такие, как 3,5-дихлорфенол, использованный в международном межлабораторном тесте (7).

Желательно проверять референтное вещество по крайней мере два раза в год или. если тестирование выполняют редко, параллельно с определением токсичности тестируемого вещества.

4 Описание метода

4.1    Оборудование

4.1.1    Все оборудование, вступающее в контакт с тестовой средой, должно быть выполнено из стекла или другого химически инертного материала. Стеклянная посуда, используемая для культивирования и тестирования, должна быть стерилизована и очищена от всех химических загрязнений, которые могли бы попасть в тестовую среду. Тестовые емкости должны быть достаточно широкими для зеленой массы различных колоний в контрольных емкостях, чтобы расти, не накладываясь друг на друга к концу теста.

Не имеет значения, если корни касаются оснований тестового сосуда, но минимальная глубина не должна быть менее 20 мм и минимальный объем не должен быть менее 100 мл для каждого тестового сосуда. Тип тестовой емкости неважен, если он отвечает этим требованиям. Это могут быть стеклянные стаканы, кристаллизаторы или чашки Петри соответствующих размеров.

Тестовые емкости должны быть накрыты для минимизации испарения и случайных загрязнений, не нарушая необходимого воздухообмена. Соответствующие тестовые емкости, и особенно покрытие, не должны создавать затенения или изменения в спектре освещения.

4.1.2    Культуры и тестовые емкости не следует содержать вместе. Это лучше всего сделать, используя отдельные помещения для культивации, инкубаторы. Освещение и температура должны быть управляемы и поддерживаться на постоянном уровне (см. 5.8.1 и 5.8.2).

4.2    Тестовый организм

4.2.1 Организмом, используемым для этого теста, является Lemna gibba (L. gibba) или Lemna minor (L. minor). Краткие описания видов ряски, которые используют для тестирования токсичности, даны в приложении А. Растительный материал может быть получен из коллекции культуры, другой лаборатории или собран в природе. Если материал собран в природе, растения следует содержать в той же питательной среде, которую используют для теста, минимум восемь недель до использования.

Участки отбора образцов для стартовой культуры в природе должны быть свободными от очевидных источников загрязнения. Если образцы получены из другой лаборатории или коллекции культуры.

3

ГОСТ 32426-2013

они должны быть также выдержаны минимум три недели. Об источнике растительного материала, так же как о виде растений и клона (если известно), используемых для эксперимента, нужно всегда сообщать в отчете.

4.2.2    Следует использовать монокультуры, которые явно свободны от загрязнения другими организмами. такими, как водоросли и простейшие. Здоровые растения L. minor будут состоять из колоний, содержащих от двух до пяти зеленых пластинок, в то время как колонии L. gibba могут содержать до семи пластинок.

4.2.3    Качество и однородность растений, используемых для теста, имеют существенное влияние на результат теста, и поэтому должны быть отобраны с особым вниманием. Следует использовать молодые, быстро растущие растения без видимых повреждений или обесцвечивания (хлороза). Культуры хорошего качества имеют большое количество колоний, содержащих не менее двух пластинок. Большое количество колоний с одной пластинкой является признаком стресса, такого, как недостаток питательных веществ, и растительный материал таких культур не следует использовать для тестирования.

4.3    Культура

4.3.1    Чтобы уменьшить частоту обслуживания культуры (например, когда не планируют тесты с Lemna), культуру можно содержать под уменьшенным освещением при температуре 4 *С—10 °С. Детали культивирования даны в приложении В. Очевидные признаки загрязнения водорослями или другими организмами могут потребовать поверхностной стерилизации образца пластинки Lemna и смены среды на свежую (см. приложение В). В этом случае необходимо отказаться от сохранения загрязненной культуры.

4.3.2    По крайней мере за семь дней до тестирования культуру асептически пересаживают в свежую среду и культивируют в течение 7—10 дней при условиях теста.

4.4    Тестовая среда

4.4.1    Рекомендуются различные среды для L. minor и L. gibba. описанные ниже. Необходимо с осторожностью использовать pH-буферы в тестовой среде (MOPS ((4-морфолино)пропан сульфокислота. CAS 1132-61-2) в среде для L. minor и NaHC0₃ в среде для L. gibba), если есть подозрение, что буфер может реагировать с тестируемым веществом и оказать влияние на показатели токсичности. Среду (9) Штейнберга (Steinberg) можно использовать, при соблюдении критериев достоверности.

4.4.2    Модификация среды шведского стандарта (SIS) для Lemna рекомендуется для культивирования и тестирования L. minor. Состав этой среды дан в приложении С.

4.4.3    Среда роста 20Х—ААР. описанная в приложении С. рекомендуется для культивирования и тестирования L. gibba.

4.4.4    Среда Штейнберга. описанная в приложении С. также подходит для L. minor, но может быть также использована для L. gibba, если отвечает критериям достоверности.

4.5 Экспериментальный раствор

4.5.1    Экспериментальные растворы обычно готовят разбавлением маточного раствора. Маточные растворы обычно готовят растворением тестируемого вещества в культивационной среде.

4.5.2    Самая высокая тестируемая концентрация испытуемого вещества не должна превышать его растворимость в воде при условиях тестирования. Нужно отметить, однако, что виды Lemna spp. плавают на поверхности и могут быть подвергнуты воздействию веществ, которые аккумулируются в водновоздушном пространстве (например, плохо растворимые в воде, гидрофобные или поверхностно-активные вещества). В этом случае воздействие будет результатом других концентраций, отличных от тестовых и превышающих растворимость исследуемого вещества в воде.

Для плохо растворимых веществ может потребоваться подготовить концентрированный маточный раствор или дисперсию вещества, используя органический растворитель или диспергатор для облегчения добавления точных количеств тестируемого вещества к испытательной среде и ее более легкой дисперсии и растворения. Использования этих веществ необходимо по возможности избегать. Растворители и диспергаторы не должны обладать фитотоксичностью. Например, ацетон и диметил-формамид являются примерами растворителей, которые не вызывают фитотоксичность при концентрациях до 100 мкл/л. Если используют растворитель или диспергатор, их конечная концентрация должна быть сведена к минимуму и не превышать 100 мкл/л. Концентрация этих веществ должна быть одинаковой во всех тестах, и это должно быть указано в отчете об исследовании. Более подробное руководство по использованию диспергаторов дано в [8].

4

ГОСТ 32426-2013

4.6    Тестовые и контрольные группы

4.6.1    Данные о предварительной токсичности тестируемого вещества для ряски Lemna могут быть полезны в отборе подходящих тестовых концентраций. В финальном тесте по определению токсичности должно быть по крайней мере пять экспериментальных концентраций, взятых в геометрической прогрессии. Желательно, чтобы фактор разведения между тестовыми концентрациями не превышал 3.2. но может быть использован больший фактор, если кривая концентрация-эффект имеет нулевой наклон. Использование менее пяти концентраций должно быть обосновано. Должно быть по крайней мере три дублирования для каждой тестовой концентрации.

4.6.2    Выбор диапазона тестовых концентраций (тест для определения диапазона и/или финальный тест определения токсичности) должен учитывать следующее:

-    для определения ЕС„ тестовые концентрации должны быть подтверждены величинами ЕС_Х необходимого уровня достоверности.

Пример — При оценке ЕС_М самая высокая тестовая концентрация должна быть больше чем величина ECfQ. Если ЕС_и выходит за пределы диапазона тестовых концентраций, доверительный интервал слишком велик, ость риск того, что сделать соответствующую статистическую оценку модели но представляется возможным;

-    если целью является оценка LOEC/NOEC, самая низкая тестовая концентрация должна быть достаточной для того, чтобы рост не был значительно меньше, чем в контроле. Кроме того, самая высокая тестовая концентрация должна быть достаточно высокой для того, чтобы рост был значительно ниже, чем в контроле. Если дело обстоит иначе, тест должен быть повторен с использованием другого диапазона концентраций (с учетом того, что самая высокая концентрация не должна превышать максимальную растворимость или верхний разрешенный предел концентрации, например 100 мг/л).

4.6.3    Каждый тест должен включать контроль, содержащий ту же самую питательную среду, количество пластинок и колоний, условия окружающей среды и процедур тестирования, как и тестовые емкости. но без исследуемого вещества. Если дополнительно применяют растворитель или диспергатор, проводят дополнительный контроль с растворителем или диспергатором в тех же концентрациях, что и в экспериментальных емкостях. Число повторностей в контроле (и контроль с растворителем, если применимо) должно быть по крайней мере равным и в идеале дважды превышать количество емкостей, используемых для каждой тестовой концентрации.

4.6.4    Если определение NOEC не требуется, концепция эксперимента может быть изменена в сторону увеличения количества концентраций и сокращения количества повторностей. Количество повторений контроля должно быть не меньше трех.

4.7    Воздействие

4.7.1    Колонии, состоящие из двух—четырех зеленых пластинок, берут из маточной культуры и переносят в тестовые емкости в асептических условиях. Каждая экспериментальная емкость должна содержать в общей сложности 9—12 пластинок. Число пластинок должно быть одинаковым во всех экспериментальных емкостях. Опыт, полученный в ходе международных межлабораторных испытаний с этим методом, показал, что использование трех повторов, содержащих изначально по 9—12 пластинок каждый, достаточно для обнаружения различия приблизительно 4 %—7 % по ингибированию в темпах роста (10 %—15 %, рассчитанных на урожай) между обработками (7).

4.7.2    Расположение экспериментальных емкостей в инкубаторе должно быть случайным, чтобы минимизировать влияние пространственных различий в интенсивности света или температуре. Расположение емкостей во время наблюдения (или чаще в случае перемещения емкостей) также следует проводить в случайном порядке.

4.7.3    Если предварительный тест стабильности исследуемого вещества показывает, что тестовая концентрация не может быть выдержана (т. е. измеренная концентрация падения ниже 80 % начальной) в течение эксперимента (семь дней), рекомендуется проводить полустатический эксперимент. В этом случае культивационная среда в контроле и экспериментальных емкостях должна обновляться минимум дважды во время теста (например, на третий и пятый день). Частота замены среды зависит от стабильности тестируемого вещества: более высокая частота обновления может потребоваться для поддержания необходимых концентраций очень нестабильных или летучих веществ. В некоторых случаях может потребоваться динамический (проточный) эксперимент [8]. (10).

4.7.4    Путь воздействия через лиственные аппликации (разбрызгивание) не описан в настоящем стандарте, взамен см. (11).

5

ГОСТ 32426-2013

4.8    Условия инкубации

4.8.1    Применяют непрерывное освещение флуоресцентной лампой теплого или холодного белого света для обеспечения конечной интенсивности освещения в диапазоне 85— 135nEnr²s^-1 с длиной волны в диапазоне фотосинтеза (400—700 нм) на таком же расстоянии от источника света как зеленые пластинки Lemna (эквивалент 6500—10000 лк). Отклонения от указанной интенсивности света не должны превышать г15 %. Метод определения и измерения света, особенно тип датчика, влияет на точность измерения. Сферические датчики (которые определяют свет со всех углов выше и ниже уровня измерения) и косинусоидальные датчики (которые определяют свет со всех углов выше уровня измерения) предпочтительнее однонаправленных датчиков и дадут более высокую точность для многоточечного источника света, описанного в настоящем стандарте.

4.8.2    Температура в экспериментальных емкостях должна быть (24 г 2) °С. pH среды в контроле не должен увеличиться больше чем на 1.5 единицы за время теста. Отклонение более 1.5 единицы не должно влиять на тест, если соблюдены критерии достоверности. Необходимо быть особенно внимательным к изменениям pH в ряде случаев, таких как нестабильные вещества или металлы (8).

4.9    Продолжительность

Тест заканчивается через семь дней после помещения растений в экспериментальные емкости.

4.10    Измерения и аналитические определения

4.10.1    В начале теста необходимо подсчитать количество зеленых пластинок в экспериментальных сосудах, не пропуская все отчетливо видимые пластинки. Количество пластинок, кажущихся нормальными или ненормальными, должно быть определено в начале теста, по крайней мере один раз каждые три дня во время периода воздействия (то есть по крайней мере дважды во время семидневного периода), и в конце эксперимента. Следует отмечать изменения в развитии растений (например, в размере зеленых пластинок, признаках некроза, хлороза или сгорбленности, распада колонии или потери плавучести, в длине и появлении корней). Существенные особенности тестовой среды (например, наличие нерастворенного материала, развитие водорослей в экспериментальных емкостях) также должны быть отмечены.

4.10.2    В течение теста в дополнение к определениям числа пластинок также измеряют действие тестируемого вещества на одну или больше следующих переменных:

-    общая поверхность пластинок;

-    сухой вес;

-    живой вес.

4.10.3    Определение общей площади поверхности пластинок имеет преимущество в том, что она может быть установлена для каждого экспериментального сосуда и для контроля в начале, во время и в конце теста. Сухой или живой вес должен быть определен в начале теста от образца, взятого из используемой маточной культуры в начале и в конце теста из каждой экспериментальной и контрольной емкостей. Если площадь поверхности не измеряется, сухой вес более предпочтителен живому.

4.10.4    Общая площадь поверхности пластинок, сухой и живой вес могут быть определены следующим образом:

-    общая площадь поверхности: общая площадь поверхности всех пластинок может быть определена анализом фотографии. Проекцию тестовой емкости и растений можно снять на видеокамеру (то есть помещая емкость в световой короб) и получающееся изображение перевести в цифровую форму. Калибровку осуществляют по известной площади поверхности тестовой емкости, которая позволяет определить площадь покрытия листовых пластинок. Необходимо соблюдать осторожность, стараясь не трогать растения в тестовой емкости. Другими более трудоемкими методами являются фотографирование тестовой емкости и растений, распечатывание фотографии, вырезание силуэтов колонии и дальнейший анализ с помощью миллиметровой бумаги. Другие методы также подходят (такие. как соотношение коэффициента весов между областью силуэта колоний и общей площадью поверхности);

-    сухой вес: все колонии собирают в каждом тестовом сосуде и ополаскивают дистиллированной или деионизированной водой. Растения раскладывают на фильтровальную бумагу для поглощения избытка воды и высушивают при температуре 60 °С до постоянного веса. Все фрагменты корней должны быть включены. Сухой вес должен быть выражен с точностью до 0.1 мг минимум;

-    живой вес: все колонии переносят в предварительно взвешенную полистироловую трубку (или трубку из любого другого инертного материала) с просверленными маленькими (1-миллиметровыми) от-

6