Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

36 страниц

487.00 ₽

Купить ГОСТ 32368-2013 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Описывает invivo пробит–тестна группе рыб (состоящей из половозрелых самцов и самок в репродуктивном возрасте), подвергающихся воздействию химиката в период, ограниченный их биологическим циклом (21 день).

 Скачать PDF

Идентичен OECD Test No.229:2009

Оглавление

1 Область применения

2 Термины и определения

3 Основные положения

     3.1 Исходные положения и ограничения

     3.2 Принцип теста

     3.3 Критерии достоверности исследования

4 Описание метода

5 Процедура испытания

     5.1 Выбор и взвешивание экспериментальных труб

     5.2 Условия воздействия

     5.3 Частота аналитических определений и измерений

     5.4 Наблюдения

6 Данные и отчетность

     6.1 Оценка ответов биомаркеров с помощью дисперсионного анализа (ANOVA)

     6.2 Отчет об исследовании

     6.3 Руководство по интерпретации и принятии результатов тестирования

Приложение А (справочное) Условия проведения эксперимента по воздействию вещества на эндокринную систему рыб без репродуктивной функции

Приложение В (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для данио рерио

Приложение С (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для толстоголового гольяна

Приложение D (рекомендуемое) Оценка вторичных половых признаков у толстоголового гольяна для обнаружения некоторых веществ, активных по отношению к эндокринной системе

Приложение Е (рекомендуемое) Оценка вторичных половых признаков у японской медаки для обнаружения определенных веществ, воздействующих на эндокринную систему

Приложение F (рекомендуемое) Рекомендуемые процедуры для типового определения содержания вителлогенина

Приложение G (справочное) Усиленные образцы вителлогенина, используемые как эталоны при проведении межлабораторного теста

Приложение Н (рекомендуемое) Блок-схема проведения статистического анализа

Библиография

 
Дата введения01.08.2014
Добавлен в базу12.02.2016
Актуализация01.01.2019

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

05.11.2013УтвержденМежгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации61-П
22.11.2013УтвержденФедеральное агентство по техническому регулированию и метрологии791-ст
ИзданСтандартинформ2015 г.
РазработанФГУП ВНИЦ СМВ

Testing of chemicals of environmental hazard. 21-day fish assay. A short- fish short term reproduction assay

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Оценка репродуктивной способности рыб

(OECD, Test No. 229:2009, IDT)

Издание официальное

ГОСТ

32368-

2013

Москва

Стамдартинформ

2015


Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ» (ФГУП «ВНИЦСМВ») на основе аутентичного перевода на русский язык международного документа. указанного в пункте 5

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

дарт)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 5 ноября 2013 г. № 61-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Азербайджан

А2

Азстандарт

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-С тандарт

Россия

RU

Росстаидарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Туркменистан

TM

Главтосслужба «Туркменстандартлары»

Узбекистан

uz

Узстандарт

Украина

UA

Минэкономразвития Украины

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 791-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32368-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2014 г.

5    Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD. Test No. 229:2009 «Fish short term reproduction assay» (ОЭСР, Тест № 229 «Оценка репродуктивной способности рыб»).

Международный документ разработан Организацией экономического сотрудничества и развития (03CP/0ECD).

Перевод с английского языка (ел).

Степень соответствия — идентичная (IDT).

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информацион-номуказателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячных информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ.2015

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 32368-2013

представителей другого пола; например, антагонисты рецепторов андрогена, такие, как тренболон. метилтестостерон и дигидротестостерон, могут привести к развитию у самок толстоголового гольяна брачных бугорков или появлению папиллярных полос у самок японской медаки. Также было отмечено, что антагонисты рецепторов эстрогена могут привести к уменьшению числа брачных бугорков и размера затылочной подушки у взрослых самцов. Такие морфологические наблюдения могут предоставить полезную качественную и количественную информацию при планировании дальнейших исследований. Число и размер свадебных бугорков у гольяна и папиллярные бугорки у медаки могут быть определены количественно непосредственно или позднее в сохраненных образцах.

5.4.6    Вителлогенин (VTG)

5.4.6.1    Кровь собирают у хвостовой артерии/вены капиллярной трубочкой с гепарином с помощью микрогематокрита или шприцем пункцией сердца. В зависимости от размера рыбки собираемые объемы крови колеблются от 5 до 60 мкл для толстоголового гольяна и 5—15 мкл для данио рерио. Плазму отделяют от крови центрифугированием и хранят с ингибиторами протеазы при минус 80 °С до анализа на вителлогенин. У медаки для анализа используются печень, у данио рерио также можно использовать как источник ткани для анализа вителогенина гомогенат головы/хвоста. Измерение VTG следует проводить по утвержденному гомологическому методу ELISA с использованием гомологических стандартов и антител VTG. Рекомендуется использовать метод, способный обнаружить VTG в плазме на уровне нескольких нанограмм/милллиметр плазмы(нг/мл ткани), который является фоновым уровнем для интактных самцов рыб.

5.4.6.2    Контроль качества анализа вителлогенина достигается с помощью стандартных наборов химикатов и дублированием анализа. Для каждого метода ELISA строят матричный эффект (эффект разбавления пробы) для определения минимального фактора разбавления. Каждая пластина ELISA, используемая для анализа VTG, должна включать следующие контрольные образцы: по крайней мере шесть стандартных калибровочных растворов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций вителлогенина. и по крайней мере один холостой опыт (проанализированный в двух повторностях). Степень поглощения света в холостых пробах должна составить менее чем 5 % максимальной абсорбции стандартного калибровочного раствора. Будут проанализированы по крайней мере два определенных количества (абсолютно одинаковых) каждого типового разбавления В случае разброса между повторностями более чем на 20 % анализ повторяют.

5.4.6.3    Коэффициент корреляции (R2) для калибровочных кривых должен быть больше 0.99. Высокая степень корреляции недостаточна для того, чтобы гарантировать адекватное предсказание концентрации во всех диапазонах. В дополнение к наличию достаточно высокой корреляции значений калибровочной кривой к концентрации каждого стандарта вычисляют кривую стандартных растворов, которая должна находиться между 70 % и 120 % ее номинальной концентрации. Если номинальная концентрация расположена далеко от линии регрессии калибровочного графика (например, при более низких концентрациях), это может привести к необходимости разбить калибровочную кривую в низком и высоком диапазонах или к применению нелинейной модели, чтобы соответственно удовлетворить полученные результаты абсорбции. Если кривая разбита, каждый ее сегмент должен иметь R2 > 0.99.

5.4.6    4 Предел обнаружения (LOD) обозначается как концентрация наименьшего аналитического стандарта, предел количественного определения (LOQ) понимают как наименьшую концентрацию наименьшего стандарта, умноженную на самый низкий фактор разбавления.

5.4.6.5 В день выполнения анализа на вителлогенин. проводят анализ усиленного образца стандартного раствора (приложение 3). Также систематически сверяют отношения между ожидаемой и измеренной концентрацией, выполненной в тот же день.

5.4.7    Оценка гонадальной гистопатологии

Гонады фиксируются либо сохраняется все тело или его части. Когда требуется гистопатология, специфические эндокринно-связанные ответы на гонады будут искать в оценке эндокринной деятельности исследуемого вещества. Эти диагностические результаты по существу включают наличие яичек ооцитов, гиперплазию клеток Лейдига. снижение образования желтка, увеличение сперматогонии и околофолликулярную гиперплазию. Другие половые поражения, такие как атрезия яйцеклетки, дегенерация яичек, и другие стадии изменения могут иметь различные причины. Руководящий документ по гистопатологии гонад рыб содержит процедуры, которые используются при вскрытии, фиксации, секционировании и гистопатологических оценках гонады.

6 Данные и отчетность

6.1    Оценка ответов биомаркеров с помощью дисперсионного анализа (ANOVA)

Чтобы идентифицировать потенциальное воздействие вещества на эндокринную систему, сравнивают результаты опытной контрольной группы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). Где используется контроль содержащий растворитель, соответствующий статистический тест должен быть выполнен между контролем с водой и контролем с растворителем для каждого наблюдаемого эффекта.

Все данные, связанные с биологической реакцией, должны быть проанализированы и приведены в привязке к полу. Если гипотеза не проверятся с помощью параметрических методов — ненормальное распределение (например, тест Шапиро — Вилка) или гетерогенная дисперсия (тест Барлета или тест Левена), должна быть рассмотрена возможность трансформировать данные для гомогенизации дисперсии до выполнения ANOVA. или к выполнению взвешенного анализа. Тест Даннетта (параметрический) на многократные попарные сравнения или анализ Манна — Уитни (непараметрический) с регулированием Бонферрони может использоваться для немонотонного отношения доза — ответ. Другие статистические тесты также могут использоваться (например, тест Jonckheere-Terpstra или тест Williams), если отношение доза — ответ является приблизительно монотонным.

6.2    Отчетов исследовании

Отчетов исследовании должен включать:

6.2.1    Установочные данные:

-    степень подготовленности персонала к проведению теста;

-    каждая лаборатория должна продемонстрировать свою компетентность, включая наличие необходимых реактивов.

6.2.2    Тестируемое вещество:

-    характеристики тестируемого вещества;

-    физическая природа и соответствующие физико-химические свойства;

-    метод и частота подготовки тестовых концентраций;

-    информация о стабильности и способности к разложению микроорганизмами.

6.2.3    Растворитель:

-    исследование растворителя (природа, используемые концентрации);

-    обоснование выбора растворителя (кроме воды).

6.2.4    Подопытные животные:

-    виды и место разведения;

-    поставщик и оборудование, применяемое при доставке;

-    возраст рыб в начале теста и репродуктивный статус;

-    детали процедуры акклиматизации животных;

-    вес тела рыб в начале экспозиции (начиная с предварительного выбора рыб).

6.2.5    Условия проведения теста:

-    используемый метод (тип эксперимента, степень нагрузки, плотность заселения и т. д.);

-    метод подготовки основных растворов и их расход;

-    номинальные тестовые концентрации, еженедельное измерение концентраций экспериментальных растворов реактивов и используемые аналитические методы, средневзвешенные значения и среднеквадратичные отклонения в тестовых сосудах, и данные, демонстрирующие, что измерения соотносятся с истинными концентрациями тестируемого вещества;

-    особенности разбавляющей воды (включая pH. жесткость, щелочность, температуру, концентрацию растворенного кислорода, уровни остаточного хлора, общий органический углерод, сухой остаток и любые другие сделанные измерения);

-    качество воды в тестовых аквариумах: pH. жесткость, температура и концентрация растворенного кислорода;

-    подробная информация относительно кормления (например, тип корма(ов), источник, выданное количество корма и частота кормления, исследования о наличии загрязняющих примесей, если доступны (например. ПХБ. хлорорганические пестициды).

6.2.6    Результаты

-    доказательство того, что контроль соответствует применяемым критериям теста:

-    данные по смертности для каждой концентрации и контроля;

-    использованные статистические методики, обработка данных и объяснение примененных методик:

8

ГОСТ 32368-2013

-    данные по биологическим макроскопическим наблюдениям, включая вторичные половые признаки. плодовитость и вителлогенин;

-    результаты анализа данных предпочтительно в табличной и графической форме;

-    частота любых необычных реакций рыбок и любых видимых эффектов, вызванных исследуемым веществом.

6.3 Руководство по интерпретации и принятии результатов тестирования

6.3.1    В данном разделе обсуждаются параметры, которые необходимо учитывать для интерпретации результатов тестирования в отношении различных измеряемых эффектов. Результаты необходимо интерпретировать с осторожностью, когда кажется, что исследуемое вещество является причиной появления признаков токсичности или влияет на общее состояние экспериментальных животных.

6.3.2    В ходе предварительного теста по определению концентрации для того, чтобы можно было надежно интерпретировать данные, следует обратить внимание на то. чтобы не были превышены максимально переносимые концентрации. Важно применять по меньшей мере одну концентрацию, которая не вызывает каких-либо признаков токсичности. Симптомы заболевания и признаки токсичности анализируют и включают в подробный отчет. Например, возможно, что на образование VTG у самок могут также повлиять общая токсичность и неэндокринные токсические воздействия, например гепато-токсичноть. Интерпретация полученных эффектов может быть дополнена другими уровнями загрязнений. которые не связаны с системной токсичностью.

6.3.3    Есть несколько аспектов, которые необходимо рассмотреть для принятия результатов тестов. Уровни VTG в контрольных группах самцов и самок должны отличаться примерно на три порядка у толстоголового гольяна и данио рерио, и на один порядок у японской медаки. Примерный диапазон значений, с которыми сталкиваются в контрольных группах, доступны в отчетах проверки точности. Высокие значения VTG у контрольных самцов могут поставить под угрозу точность анализа и его способность обнаружить слабых антагонистов эстрогена. Низкие значения VTG у контрольных самок контроля могут поставить под угрозу чувствительность анализа и его способность обнаружить ингибиторы арома-тазы и антагонистов эстрогена. Исследования по проверке точности проводились для целей написания руководства.

6.3.4    Что касается количественного определения образования икры, то это тот случай, когда допускаются важные изменения (коэффициент изменчивости (CV) может колебаться от 20 % до 60 %]. которые влияют на способность испытания обнаружить существенное уменьшение образования икры, меньше чем на 70 %, поскольку коэффициент изменчивости приближается к 50 % или более. Когда коэффициент изменчивости ограничен нижними значениями (приблизительно от 20 % до 30 %), то у испытания будет приемлемая сила (80 %) для обнаружения от 40 % до 50 % уменьшения образования икры. Вид испытания, используемый для толстоголового гольяна, включая четыре воспроизведения на уровень воздействия, должен придать больше власти итогам испытания репродуктивной способности, по сравнению с видом исследований с двумя воспроизведениями.

6.3.5    Если лаборатория не выполняла ранее этот анализ или были допущены значимые изменения (например, вида рыб или поставщика), желательно, чтобы было проведено исследование технической компетенции. Рекомендуется использовать вещества, охватывающие диапазон воздействий или влияющие на некоторые измеряемые параметры во время теста. Каждой лаборатории рекомендуется разрабатывать свою собственную базу данных по контрольным самцам и самкам и делать тесты с положительным контролем для эстрогенной активности (например. 17[*-эстрадиола на уровне 100 нг/л. или другим известным слабым агонистом), вызывающим увеличение VTG у самцов, положительным контролем для ингибирования ароматазы (например, фадрозол и прохлораз при 300 мг/л), вызывающим снижение VTG у самок, и положительным контролем для андрогенной активности (17(Мренболона в дозе 5 мг/л), в результате индукции вторичных половых признаков у самок толстоголового гольяна и японской медаки. Все эти данные можно сравнить с имеющимися данными по проверке исследований для обеспечения компетентности лаборатории.

6.3.6    Вообще, измерения вителлогенина должны считаться положительными, если есть статистически значимое увеличение VTG у самцов (р < 0,05), или статистически значимое снижение у самок (р < 0.05) по крайней мере при самых высоких концентрациях по сравнению с контрольной группой при отсутствии признаков общей токсичности. Положительный результат далее подтверждается демонстрацией биологически вероятной зависимости между дозой и динамической характеристикой. Как упомянуто ранее, уменьшение вителлогенина может не всегда иметь эндокринное происхождение; однако положительный результат должен интерпретироваться как доказательство эндокринной деятельности in vivo и обычно является поводом для дальнейших исследований.

9

6.3.7 Представление гонадальной гистопатологии не может быть необходимо в тех случаях, когда реакция и вителлогенина, и вторичных половых признаков положительна (т. е. увеличение или уменьшение VTG или индукция вторичных половых признаков). Оценка гистопатологии гонад может быть представлена регулирующим органам для определения репродуктивного здоровья подопытных животных и получения данных об их весе в качестве доказательств оценки результатов теста. Представление гистопатологии гонад может не потребоваться в случаях, когда ВТГ или вторичные половые признаки положительны (т. е. увеличение или уменьшение количества ВТГ или индукция вторичных половых признаков).

Ю

ГОСТ 32368-2013

Приложение А (справочное)

Условия проведения эксперимента по воздействию вещества на эндокринную систему рыб без репродуктивной функции

Рекомендуемы© виды

Толстоголовый гольян (Pimophalos promotes)

Японская медака (Oyiiastotyjes)

Данио рерио {Danto rorio)

1 Тип эксперимента

Динамический

Динамический

Динамический

2 Температура воды

(25 1 2)*С

(25 1 2)*С

(26 1 2) ‘С

3 Качество освещения

Флуоресцентные лампы (широкого спектра)

Флуоресцентные лампы (широкого спектра)

Флуоресцентные лампы (широкого спектра)

4 Интенсивность освещения

10—20 ME/M2/s 540— 1000 люкс или 50—100 fc (освещение лаборатории)

10—20 pE/M2/s 540— 1000 люкс или 50—100 fc (освещение лаборатории)

10—20 ц E/M2/s 540— 1000 люкс или 50—100 fc (освещение лаборатории)

5 Фотонериод (переход — рассвет и закат — опционно, но не является обязательным)

16 ч освещения 8 ч темноты

12—16 ч освещения 12—8 ч темноты

12—16 ч освещения 12—8 ч темноты

6 Величина нагрузки

<5 Tin

< 5 г/л

< 5 г/л

7 Объем испытательной камеры

10 л (минимально)

2 л(минимально)

5 л (минимально)

8 Объем тестируемого раствора

8 л(минимально)

1,5 л (минимально)

4 л (минимально)

9 Величина обмена тестируемого раствора

Минимально 6 раз/день

Минимально 5 раз/день

Минимально 5 раз/день

10 Возраст тестируемых организмов

См. пункт 20

См. пункт 20

См. пункт 20

11 Примерный живой вес взрослых рыб

Самки: 1.5 120% Самцы: 2.5120%

Самки: 0.35 1 20 % Самцы: 0.35120%

Самки. 0.65 1 20 % Самцы: 0.4 1 20 %

12 Количество рыб в кювете

6 (2 самца и 4 самки)

10 (5 самцов и 5 самок)

10 (5 самцов и 5 самок)

13 Количество проб

= 3 (плюс соответствующий контроль)

= 3 (плюс соответствующий контроль)

= 3 (плюс соответствующий контроль)

14 Количество повторностей

4 минимально

2 минимально

2 минимально

15 Количество рыб на тестируемую концентрацию

16 взрослых самок и 8 самцов (4 самки и 2 самца в каждой повторности)

10 взрослых самок и 10 самцов (5 самок и 5 самцов в каждой повторности)

10 взрослых самок и 10 самцов (5 самок и 5 самцов в каждой повторности)

16 Режим питания

Взрослая артемия или личинки артемии. живые или замороженные. 2—3 раза в день (adlibitum). коммерческие корма или их комбинация

Личинки артемии. живые или замороженные. 2— 3 раза в день (adlibitum). коммерческие корма или их комбинация

Личинки артемии. живые или замороженные. 2— 3 раза в день (adlibitum). коммерческие корма или их комбинация

17 Аэрация

Не аэрировать, если концентрация кислорода выше 60% от максимальной насыщающей концентрации

Не аэрировать, если концентрация кислорода выше 60 % от максимальной насыщающей концентрации

Не аэрировать, если концентрация кислорода выше 60 % от максимальной насыщающей концентрации

11

Рекомендуемые виды

Толстоголовый гольян (Pimophalos promotes)

Японская мсдака (Oryzia&latipes)

Данио рсрио (Daruo гвпо)

18 Разбавляющая вода

Природная вода, колодезная или дехлорированная водопроводная вода

Природная вода, колодезная или дехлорированная водопроводная вода

Природная вода, колодезная или дехлорированная водопроводная вода

19 Период пре-экспо-зиции

7 дней (рекомендуется)

7 дней (рекомендуется)

7 дней (рекомендуется)

20 Длительность экспозиции химическою продукта

21 день

21 день

21 день

21 Измеряемый биологический эффект

-    выживаемость

-    поведение

-    вторичные половые признаки

-    VTG

-    выживаемость

-    поведение

-    вторичные половые признаки

-    VTG

• выживаемость - поведение -VTG

22 Критерии достоверности теста

Концентрация кислорода о воде ^ 60 % от насыщающей. средняя темп. 25 i 2 *С. 90 % выживаемость в контроле, измеряемая концентрация тестируемого вещества в интервале 120 % от средних измеряемых величин для каждой тестируемой концентации

Концентрация кислорода в воде £ 60 % от насыщающей. средняя темп. 2512 ‘С. 90 % выживаемость в контроле, измеряемая концентрация тестируемого вещества в интервале 120 % от средних измеряемых величин для каждой тестируемой концентации

Концентрация кислорода в воде £ 60 % от насыщающей. средняя темп. 25 1 2 вС. 90 % выживаемость в контроле, измеряемая концентрация тестируемого вещества в интервале 120 % от средних измеряемых величин для каждой тестируемой концентрации

НЕКОТОРЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВОДЫ РАЗБАВЛЕНИЯ

ВЕЩЕСТВО

КОНЦЕНТРАЦИИ

Взвешенные вещества

< 20 мг/л

Общий ортаничесжий углерод

< 2 мг/л

Аммиак неионизированный

< 1 мкг/л

Остаточный хлор

<10 мкг/л

Общие фосфорорганические пестициды

< 50 нг/л

Общие хлорорганические пестициды и полихлорированные бифенилы

< 50 нг/л

Общий органический хлор

< 25 нг/л

12

ГОСТ 32368-2013

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Термины и определения................................................1

3    Основные положения..................................................1

3.1    Исходные положения и ограничения......................................1

3.2    Принцип теста....................................................2

3.3    Критерии достоверности исследования....................................3

4    Описание метода.....................................................3

5    Процедура испытания..................................................5

5.1    Выбор и взвешивание экспериментальных труб...............................5

5.2    Условия воздействия................................................5

5.3    Частота аналитических определений и измерений.............................5

5.4    Наблюдения.....................................................6

6    Данные и отчетность...................................................8

6.1    Оценка ответов биомаркеров с помощью дисперсионного анализа (ANOVA).............8

6.2    Отчет об исследовании..............................................8

6.3    Руководство по интерпретации и принятии результатов тестирования.................9

Приложение А (справочное) Условия проведения эксперимента по воздействию вещества

на эндокринную систему рыб без репродуктивной функции.................11

Приложение В (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для даниорерио..................13

Приложение С (рекомендуемое) Нерестовый субстрат для толстоголового гольяна...........14

Приложение D (рекомендуемое) Оценка вторичных половых признаков у толстоголового гольяна для обнаружения некоторых веществ, активных по отношению

к эндокринной системе........................................15

Приложение Е (рекомендуемое) Оценка вторичных половых признаков у японской медаки для обнаружения определенных веществ, воздействующих на эндокринную

систему..................................................18

Приложение F (рекомендуемое) Рекомендуемые процедуры для типового определения

содержания вителлогенина.....................................20

Приложение G (справочное) Усиленные образцы вителлогенина, используемые как эталоны

при проведении межлабораторного теста............................28

Приложение Н (рекомендуемое) Блок-схема проведения статистического анализа...........29

Библиография........................................................30

III

Введение

Необходимость разработки и утверждения методики анализа репродуктивной способности рыб. способного обнаружить эндокринно-активные вещества, обусловлена опасением, чтофоновый уровень загрязнения химическими веществами окружающей среды может оказывать вредное воздействие и на человека, и на объекты окружающей среды путем взаимодействия этих веществ с эндокринной системой.

Метод оценки репродуктивной способности рыб прошел широкую программу проверки, состоящей из межлабораторных исследований с отдельными химическими веществами для демонстрации актуальности и достоверности данного метода испытаний веществ, влияющих на воспроизводство рыб и различные механизмы, включая эндокринные. Все результаты испытаний в соответствии с описываемым методом были проверены на гольяне (Pimephales promelas) и были подтверждены на японской медаке (Oryzias latipes) (вителлогенин и вторичные половые признаки) и данио рерио (вителлогенин).

IV

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Оценка репродуктивной способности рыб

Testing of chemicals of environmental hazard. Fish short term reproduction assay

Дата введения — 2014—08—01

1    Область применения

Настоящий стандарт описывает in vivo пробит-тест на группе рыб (состоящей из половозрелых самцов и самок в репродуктивном возрасте), подвергающихся воздействию химиката в период, ограниченный их биологическим циклом (21 день). По завершении 21 -дневного периода воздействия измеряют два биомаркера у самцов и самок в качестве показателей эндокринной активности исследуемых химических веществ. Этими биомаркерами являются вителлогенин (VTG) и вторичные половые признаки. VTG измеряют у толстоголового гольяна, данио рерио и японской медаки, вторичные половые признаки измеряю у толстоголового гольяна и японской медаки.

Анализ не предназначен для определения конкретных механизмов гормонального нарушения, поскольку подопытные животные обладают здоровой гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) осью и способны реагировать на вещества, воздействующие на ось ГГТ на различных уровнях.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1    коэффициент вариации (КВ) (CV — coefficient of variation).

2.2    ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.3    величина загрузки (Loading rate): Живой вес рыбы в объеме воды.

2.4    плотность заселения (Stocking density): Количество рыб в объеме воды.

2.5    ВТГ (VTG): Вителлогенин-фосфолипогликопротеин, предшественник белка желтка яйцеклетки, который обычно синтезируется у сексуально активных самок всех яйцекладущих видов.

2.6    ось ГГГ (HPGaxis): Гипоталамическая гипофизарная гонадальная ось.

2.7    МДК: Максимальная допускаемая концентрация (составляет приблизительно 10 % LC50).

3    Основные положения

3.1    Исходные положения и ограничения

3.1.1    На протяжении всего испытания ежедневно количественно отслеживают репродуктивность. Сохраняют половые железы и оценивают гистопатологию для характеристики репродуктивной способности подопытных животных и придания убедительности другим результатам.

3.1.2    Данный биоанализ проводят в естественных условиях В настоящем стандарте репродуктивную способность рыб рассматривают как метод анализа в естественных условиях и предоставления данных о нескольких механизмах эндокринной системы.

3.1.3    VTG обычно производится печенью самок яйцекладущих позвоночных в ответ на циркуляцию эндогенного эстрогена, предшественника белков яичного желтка, который производится печенью и затем переносится кровотоком в яичники, где используется в развитии и изменении ооцитов. VTG

Изданио официальное

практически необнаружим в плазме незрепых самок и самцов рыб. потому что они испытывают недостаток в эстрогене; однако их печень способна к синтезу и выдепению VTG в ответ на экзогенную стимуля-цию эстрогена.

3.1.4    Измерение VTG испопьзуют для обнаружения веществ с различными антиэстрогенными свойствами. Обнаружение антиэстрогенных химических веществ возможно через измерение индукции VTGy самцов рыб. Индукция VTG была также продемонстрирована после экспонирования ароматизированными андрогенами. Снижение уровня циркулирующих эстрогенов у самок в результате, например, ингибирования ароматазы-фермента. который превращает андрогены в эндогенные эстрогены в естественных условиях (17^эстрадиол), приводит к снижению уровня VTG, используемого для обнаружения ингибиторов ароматазы. Биологическая значимость реакции VTG в ответ на ингибирование эстрогена/ароматазы установлена и хорошо изучена. Однако производство VTG у самок также может быть изменено общей токсичностью и токсическим действием веществ не обладающих эндокринной токсичностью (например, гепатотоксичность).

3.1.5    Несколько методов измерения были успешно разработаны и стандартизированы для повседневного использования. Это касается конкретных видов иммуноферментного анализа (ИФА), использующихся в иммунохимии для количественного определения VTG, синтезированного в малых образцах крови или печени, собранных от отдельных особей рыб. Образцы для измерения VTG отбирают у трех видов; толстоголового гольяна (кровь), данио рерио (кровь или гомогенат головы/хвоста) и медаки японской (печень). У японской медаки наблюдается высокая корреляция между концентрацией VTG. измеренной в крови и печени. В приложении А приведены рекомендуемые процедуры отбора проб для анализаVTG. Оборудование для измерения вителлогенина доступно, такие установки должны быть основаны на проверке видоспецифическим методом ИФА.

3.1.6    Вторичные половые признаки у самцов рыб отдельных видов являются вполне различимыми, определяются количественно и реагируют на уровни циркулирующих эндогенных андрогенов, в случае толстоголового гольяна и японской медаки. но не для данио рерио. не обладающего вторичными половыми признаками, которые возможно измерить количественно. Самки обнаруживают способность формировать мужские вторичные половые признаки, когда они подвергаются действию андрогенных веществ в воде. Уменьшение вторичных половых признаков у самцов следует интерпретировать с осторожностью из-за низкой статистической достоверности и должно быть подтверждено экспертными оценками и убедительными доказательствами. Существуют ограничения в использовании данио рерио в этом пробит анализе, в связи с отсутствием измеримых вторичных половых признаков, чувствительных к действию андрогенотоксичных веществ.

3.1.7    У толстоголового гольяна главным индикатором воздействия экзогенного андрогена является количество брачных бугорков, расположенных на передней части головы самки. У японской медаки главным маркером экзогенного воздействия андрогенов является количество папиллярных бугорков у самок рыб. В приложении В и приложении С приведены рекомендуемые процедуры, которым необходимо следовать для оценки половых характеристик толстоголового гольяна и японской медаки. соответственно.

3.1.8    21-дневная методика анализа рыб включает количественную оценку производства яйцеклеток и сохранение гонад для дополнительной экспертизы гистопатологии. Некоторые регулирующие органы могут потребовать наличия данного показателя для более полной оценки репродуктивной функции подопытных животных или в случаях, когда вителлогенин и вторичные половые признаки не реагируют на воздействие химических веществ. Некоторые показатели легко диагностируемы (например, индукция вителлогенина у самцов и образование бугорка у самок), не все данные анализа (например, плодовитость и гистопатология гонад) способны однозначно определить конкретные клеточные механизмы действия. Совокупность полученных результатов позволяет сделать выводы в отношении возможных нарушений эндокринной системы и тем самым служит руководством для дальнейших испытаний. Хотя этот параметр не относится к эндокринному и к общей плодовитости из-за демонстрации чувствительности на воздействие известных эндокринно-активных веществ, он является важным показателем. так как отсутствие данных реакций, а также других реакций увеличивает вероятность того, что соединение не имеет эндокринной активности.

3.2 Принцип теста

3.2.1 В пробит-анализе самцы и самки рыб репродуктивного возраста совместно подвергаются воздействию в тестовых сосудах. Состояние нереста позволяет дифференцировать каждый пол и таким образом связать результаты с анализом каждой конечной точки, а также гарантирует их чувствительность к экзогенным химическим веществам. По завершении теста животные подвергаются макроскопи-

ГОСТ 32368-2013

ческим исследованиям гонад после вскрытия брюшной полости ножницами. Обзор соответствующих условий для отбора биопроб приведен в приложении D.

Исследование начинают с отбора рыб. выбранных из поголовья, которое находится в состоянии икрометания; старые животные не должны использоваться. Исследование проводят с использованием воздействия трех концентраций химического вещества плюс «чистый» контроль и контрольная проба с растворителем, если это необходимо. Используют два параллельных испытания (каждый сосуд, содержит пять самцов и пять самок) для японской медаки или данио рерио, тогда как для толстоголового гольяна используют четыре репликации (каждый сосуд содержит два самца и четыре самки). Этот принцип учитывает территориальное поведение самцов толстоголового гольяна, сохраняя при этом достаточную точность анализа.В ремя экспозиции составляет 21 день, отбор образцов также осуществляется на 21-й день.

3.2.2 На 21-й день все рыбы подвергаются эвтаназии. Вторичные половые признаки измеряют на толстоголовом гольяне и японской медаке (приложения В и С): отбирают образцы крови для определения вителлогенина у данио рерио и толстоголового гольяна, альтернативно голова/хвост может быть отобраны для определения вителлогенина у данио рерио (приложение А); образцы печени, отбираются для анализа VTG у японской медаки (приложение А); все гонады фиксируются по отдельности для потенциальных гистопатологических оценок.

3.3 Критерии достоверности исследования

Для результатов теста могут быть применены следующие условия:

-    смертность в воде (или растворителе) не должна превышать 10 % на момент окончания периода воздействия;

-    концентрация растворенного кислорода должна составлять по крайней мере, 60 % величины воздушного насыщения в течение всего периода воздействия;

-    температура воды не должна колебаться более чем на ±1.5 °С между тестовыми сосудами в любой момент проведения теста и должна поддерживаться в пределах диапазона в 2 °С определенном для тестируемых видов (приложение D);

-    полученные данные должны демонстрировать, что концентрация тестируемого вещества в растворе поддерживается в пределах =20 % средневзвешенных значений;

-    рыбы должны находиться в состоянии активного нереста во всех взятых для оценки воздействия химических веществах и в контроле во время теста.

4 Описание метода

4.1    Оборудование

Стандартное лабораторное оборудование, в частности;

-    кислородомеры и рН-метры;

-    оборудование для определения жесткости и щелочности воды;

-    надлежащий прибор для контроля температуры, предпочтительно, непрерывного действия;

-    емкости, выполненные из химически инертного материала и имеющие объем соответствующий рекомендуемой загрузке и плотности заселения (приложение D);

-    свежий субстрат для толстоголового гольяна и данио рерио (приложение Е);

-    весы соответствующего класса точности (г0.5 мг).

4.2    Вода

Для эксперимента может быть использована любая вода, которая обеспечивает условия долговременного выживания и рост тестовых видов. Она должна иметь постоянные характеристики в течение проведения теста. Величина pH воды должна быть в диапазоне 6,5—8.5. но во время теста это значение должно колебаться в пределах :0,5. Чтобы гарантировать, что вода, используемая для разбавления, не будет влиять на результаты эксперимента (например, путем образования комплексов с тестируемым веществом), должны быть взяты пробы воды для анализа.

Необходимо каждые три месяца в разбавляющей воде измерять концентрацию тяжелых металлов (Си. РЬ. 2п, Hg. Cd. N и т. д.), основных анионов и катионов (Са. Mr. Na. К. Cl, SO., и т. д ). пестицидов (общее содержание фосфора и хлорорганических веществ), содержание общего органического углерода и сухой остаток для того, чтобы быть уверенным в том. что вода является относительно постоянной по своему составу. Если существуют доказательства того, что качество воды постоянно в течение года, определения могут быть менее частыми (например, каждые шесть месяцев). Некоторые химические характеристики приемлемого разбавления водой перечислены в приложении F.

3

4.3    Тестовый раствор

4.3.1    Тестовые растворы требуемых концентраций готовят путем разбавления основного раствора. Основной раствор подготавливают путем растворения необходимых веществ в воде с использованием механических средств (например, магнитные или ультразвуковые мешалки). Для получения необходимого концентрированного раствора можно использовать таблицы растворимости. Использование растворителей не рекомендуется. Однако при необходимости нужно отдельно поставить контрольную пробу с растворителем в той же самой концентрации, что и в эксперименте. Выбор растворителя будет определяться химическими свойствами вещества. Рекомендуется максимальная концентрация растворителя 100 мкл/л. Рекомендуется минимизировать концентрацию растворителя везде, где это технически выполнимо (в зависимости от физико-химических свойств исследуемого вещества).

4.3.2    Может быть использован динамический (проточный) тип эксперимента. Такой тест требует установки системы непрерывного распределения и разбавления основного раствора исследуемого вещества (например, дозаторный насос, пропорциональный разбавитель, система растворения) для обеспечения ряда концентраций в тестовых аквариумах. Объемные скорости потока основных растворов и разбавляющей воды следует проверять регулярно, предпочтительно ежедневно, во время теста и они не должны меняться более чем на 10 % в течение теста. Необходимо с осторожностью использовать низкосортные пластиковые трубки или другие материалы, которые могут содержать биологически активные вещества. Выбирая материал для перекачивающей системы, необходимо учитывать возможную адсорбцию исследуемого вещества на этом материале.

4.4    Содержание подопытных рыб

4.4.1    Подопытные рыбы должны быть отобраны из лабораторий, предпочтительно из одной лаборатории. и должны быть акклиматизированы в течение по крайней мере двух недель до теста при условиях качества воды и освещения, подобных используемым в тесте. Важно соблюдать норму заселения в аквариумы для каждого тестового вида рыб (приложения D и G).

4.4.2    После 48-часового периода акклиматизации регистрируют смертность и следующие параметры:

-    более чем 10 % смертность выборки через семь дней: исключают из эксперимента всю группу;

-    смертность между 5 % и 10 % выборки: акклиматизация в течение семи дополнительных дней; если более чем 5 % смертность в течение дополнительных семи дней: исключают из эксперимента всю группу;

-    смертность меньше 5 % выборки через семь дней: рыбы допускаются к тесту.

4.4.3    Рыбы не должны получать лечение от болезней во время периода акклиматизации, в период перед экспозицией или во время теста.

4.5    Предварительная экспозиция и выбор рыб

4.5.1    В период от одной до двух недель до контакта рекомендуется поместить рыб в емкости, аналогичные тестовым. Рыб необходимо хорошо кормить в течение периода акклиматизации и экспозиции. Период экспозиции начинают с отбора взрослых сексуально диморфных особей из лабораторной поставки половозрелых животных (например, с выраженными вторичными половыми признаками, заметными у толстоголового гольяна и японской медаки), пригодными для разведения. Для ориентира (эти критерии не могут рассматриваться изолировано от фактически наблюдаемого репродуктивного статуса конкретных рыб), толстоголовый гольян должен быть приблизительно 20 (^2)-недельного возраста, при условии, что рыбки выращивались при температуре 25 (г2) ®С в течение всей продолжительности жизни. Японская медака должна быть приблизительно 16 (t2) недель, содержащаяся при 25 (г2) °С в течении всей жизни. Данио рерио должны быть приблизительно 16 (г2) недель при культивации при 26 (=2) °С. Производство яйцеклеток следует оценивать ежедневно в течение предварительной экспозиции. Рекомендуется, чтобы икрометание наблюдалось во всех репликациях до начала фазы экспозиции. Рекомендации по значению количества ежедневно производящейся икры не могут быть предоставлены на данном этапе, но довольно часто наблюдается в среднем более 10 яйцеклеток/сам-ка/день для каждого вида.

4.6    Процедура тестового метода

4.6.1    Используют два раствора различных концентраций исследуемого вещества, один контрольный (вода) и. при необходимости, один раствор с растворителем. Данные могут быть проанализированы для определения статистически значимых различий между основными и контрольными растворами. Эти анализы дают представление о долгосрочном воздействии теста на побочные эффекты(а именно.

4

ГОСТ 32368-2013

выживание, развитие, рост и размножение), необходимые для оценки химического вещества, а не для использования при оценке рисков.

4.6.2 Для данио рерио и японской медаки, на 21-й день эксперимента, в экспериментальных группах каждой тестируемой концентрации (пять самцов и пять самок в каждой из двух повторностей) и в контроле(ях) берут пробы на вителлогенин и вторичные половые признаки, где это применимо. Для толстоголового гольяна на 21-й день экспозиции, самцов и самок (2 самца и 4 самки в каждой из четырех репликаций) и в контроле(ях) берут пробы для измерения вителлогенина и проверки вторичных половых признаков.

Количественная оценка плодовитости, если это необходимо, и гонадный материал фиксируют целиком или в части, необходимой для проведения гистопатологической оценки, в случае необходимости.

4.7 Выбор тестовых концентраций

4.7.1    Для данного теста самой высокой тестируемой концентрацией должна быть максимально допускаемая концентрация (МДК), установленная в ходе предварительного эксперимента или от других данных токсичности, или принимают равной 10 мг/л. или определяют исходя их максимальной растворимости в воде, выбирая самую низкую концентрацию. МДК определяют как самую высокую тестовую концентрацию вещества, которая приводит к менее чем 10 % смертности. Использование этого подхода предполагает, что существуют эмпирические данные по острой или другой токсичности, по которым может быть оценена МДК Оценка МДК может быть неточной и обычно требует некоторого обсуждения.

4.7.2    Требуются три тестовые концентрации с постоянным фактором, не превышающим 10, и контроль без вещества (в случае необходимости еще и контроль с растворителем). Рекомендуется диапазон факторов разбавления между 3,2 и 10.

5 Процедура испытания

5.1    Выбор и взвешивание экспериментальных рыб

Важно минимизировать разброс в весе рыб в начале теста (приложение D). Диапазон индивидуального веса для самцов и самок рыб в начале теста должен быть по возможности в пределах :20 % от среднего арифметического веса животных того же пола. Взвешивание рекомендуется проводить в период предварительной экспозиции.

5.2    Условия воздействия

5.2.1    Продолжительность

Продолжительность теста — 21 день после периода предварительной экспозиции. Рекомендуемый период предварительной экспозиции — одна неделя.

5.2.2    Кормление

5.2.2.1    Рыб необходимо кормить соответствующим кормом в объемах достаточных для поддержания физической формы. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать роста микроорганизмов и помутнения воды. Рекомендуется ежедневную порцию делить на две или три равные части для многократного кормления в сутки, разделяя каждое кормление по крайней мере трехчасовым промежутком. Корм можно давать одной большой порцией во время выходных дней. Кормление необходимо прекратить за 12 ч до начала выборки/вскрытия животных.

5.2.2.2    Пища рыб должна быть проверена на наличие загрязняющих примесей, таких какхлорорга-нические пестициды, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). полихлорированные бифенилы (ПХБ). Корм с высоким уровнем фитоэстрогенов, который может поставить под угрозу точность анализа как известных антагонистов эстрогена (например, 17(1 эстрадиол) недопустим.

5.2.2.3    Несъеденную пищу и фекалии следует удалять из тестовых емкостей по крайней мере два раза в неделю, например, с помощью тщательной очистки дна с помощью сифона.

5.2.3    Свет и температура

Фотопериод и температура воды должны соответствовать требованиям содержания видов (приложение D).

5.3    Частота аналитических определений и измерений

5.3.1 До начала периода экспозиции должна быть проверена система внесения вещества. Все необходимые аналитические методы должны быть проведены, включая информацию о стабильности вещества в тестируемой среде. Во время теста концентрацию исследуемого вещества определяют через равные промежутки следующим образом: объемные скорости потока растворителя и основного раствора исследуемого вещества по возможности ежедневно, но реже чем два раза в неделю, и не

должны изменяться более чем на 10 % в течение теста. Рекомендуется измерять фактические концентрации вещества во всех сосудах в начале теста и в еженедельных интервалах после этого.

5.3.2    Рекомендуется обосновывать результаты на измеренных концентрациях. Если концентрация тестового вещества в растворе была удовлетворительно поддержана в пределах =20 % от номинальной концентрации в течение всего теста, то результаты могут быть привязаны или к номинальной концентрации, или измеренным значениям.

5.3.3    При необходимости образцы должны быть отфильтрованы (например, с помощью фильтра с размерами пор 0.45 мкм) или отцентрифугированы. Центрифугирование является предпочтительным. Если тестируемое вещество не адсорбирует на фильтры, фильтрация приемлема.

5.3.4    Во время теста растворенный кислород, температура и pH среды должны измеряться во всех тестовых сосудах по крайней мере раз в неделю. Общая жесткость и щелочность должны измеряться в одном сосуде с самой высокой концентрацией по крайней мере раз в неделю. Температура должна проверяться непрерывно по крайней мере в одном тестовом сосуде.

5.4    Наблюдения

Ряд общих биологических реакций(выживание. например) и целевых тестов(уровни вителлогени-на, например) оценивают в ходе или по окончании теста. Количественный контроль плодовитости можно при необходимости проводить ежедневно. Измерения и оценки этих биомаркеров и их полезность описаны далее в настоящем стандарте.

5.4.1    Выживание

Рыбы должны обследоваться ежедневно во время тестового периода, и смертность в этот период должна регистрироваться. Мертвые рыбы должны быть удалены как можно скорее. Заменять мертвых рыб в контроле или в тестовых сосудах нельзя. Пол рыб. которые гибнут во время теста, должен быть определен макроскопической оценкой гонад.

5.4.2    Поведение и внешний вид

5.4.2.1    Любое отклонение в поведении (относительно контроля) должно быть отмечено; это может быть проявлением общей токсичности, включая гипервентиляцию, нескоординированное плавание, потерю равновесия, неподвижность или атипичное кормление. Следует также отмечать любые внешние аномалии (например, кровотечение, изменение цвета). Следует проявлять осторожность при интерпретации этих признаков токсичности, так как они не являются надежными свидетельствами биомаркеров о потенциальном воздействии на эндокринную систему. Эти наблюдения могут также предоставить качественную информацию, полезную для планирования будущих экспериментов на рыбах, например, территориальную агрессивность самцов или маскулинизацию самок у толстоголового гольяна под воздействием андрогенов. Характерное поведение данио рерио выметывать икру с первыми лучами солнца может меняться под воздействием эстрогенов или антиандрогенов.

5.4.2.2    Наблюдения за качественными изменениями в поведении рыб важны также и при отборе экспериментальных животных. Некоторые активные для эндокринной системы вещества могут немедленно повлиять на следующие особенности поведения толстоголового гольяна: окраска (осветление или потемнение), равномерность окраски (наличие вертикальных полос) и форма тела (в районе головы и груди). Поэтому наблюдения за физическим появлением рыб следует проводить в течение всего теста, вплоть до его завершения.

5.4.3    Плодовитость

Ежедневные количественные наблюдения нереста должны быть записаны в рабочий журнал. Образование яйцеклеток должно учитываться как количество яйцеклеток/количество выживших самок/день. Яйцеклетки удаляются из испытательных камер ежедневно. Поверхность для нереста должна быть помещена в испытательную камеру для видов толстоголового гольяна и данио рерио чтобы испытуемые рыбы шли на нерест в нормальных условиях. Приложение Е дает более подробную информацию о рекомендуемых нерестовых субстратах для видов данио рерио и толстоголовый гольян. Обеспечение вида японская медака субстратом для нереста не считается необходимым.

5.4.4    Эвтаназия рыбы

В 21-й день, то есть в завершении экспозиции, рыбы должны быть подвергнуты эвтаназии с помощью раствора трикаина (трикаина метансульфонат, Metacain, MS 222 (CAS 886-86-2) в концентрации 100—500 мг/л. буферизованных с 300 мг/л NaHC03 (CAS 144-55-8), предназначенного для снижения раздражения слизистой оболочки; кровь и ткань собирают для определения вителлогенина.

5.4.5    Наблюдение вторичных половых признаков

Некоторые эндокринные нарушения могут влиять на вторичные половые признаки (количество брачных бугорков у самцов толстоголового гольяна, папиллярные бугорки у самцов японской медаки). Некоторые вещества могут также вызывать аномальные проявления вторичных половых признаков

6