МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

31959—

2012

(ISO 14669:1999)

ВОДА

Методы определения токсичности по выживаемости морских ракообразных

(ISO 14669:1999, MOD)

Издание официальное

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Обществом с ограниченной ответственностью «Протектор» совместно с Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» на основе официального аутентичного перевода на русский язык, указанного в пункте 4 стандарта, находящегося в Федеральном информационном фонде

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 343 «Качество воды»)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол по переписке № 54 от 3 декабря 2012 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Ар м госстандарт Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан Киргизия KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-стандарт Россия RU Росстандарт Таджикистан TJ Таджикстандарт Узбекистан UZ Узстандарт

4    Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту IS014669:1999 Water quality - Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea) (Качество воды. Токсикологические испытания по отношению к морским ракообразным (Copepoda, Crustacea)), путем:

-    изменения структуры. Сравнение структуры международного стандарта со структурой настоящего стандарта приведено в приложении Д.А;

-    внесения дополнительных положений, фраз и слов, что обусловлено учетом потребностей национальной экономики и особенностей межгосударственной стандартизации, выделенных в тексте настоящего стандарта курсивом, за исключением наименований тест-организмов.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в приложении Д.Б.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53886-2010

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2012 г. №1898-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31959-2012 (ISO 14669:1999) введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ГОСТ 31959-2012

Измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы воды.

Пробы природной морской воды и воды эстуариев тестируют без разбавлений (в случаях, когда пробы проявляют высокую токсичность, допускается их разбавление непосредственно перед тестированием).

4.3.4.2    Подготовка исходных проб сточной воды

Отобранные пробы сточной воды непосредственно перед тестированием фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленный фильтр «белая лента».

Измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода отфильтрованной пробы сточной воды.

4.3.4.3    Подготовка исходных проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений

Из проб донных отложений, отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов готовят водные вытяжки, затем измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода подготовленных водных вытяжек.

Подготовка водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов

Перед приготовлением водной вытяжки из пробы отработанных буровых растворов отобранную пробу тщательно перемешивают в смесителе со скоростью вращения 17 с¹(1000 об/мин) в течение 5 мин и определяют pH отработанного бурового раствора. Пробу отработанного бурового раствора считают не пригодной для тестирования, если:

-    pH пробы отработанного бурового раствора более 9,0 или ниже 6,0;

-    на стенках сосуда с пробой отработанного бурового раствора появились черные пятна;

-    проба отработанного бурового раствора имеет неприятный запах.

После перемешивания пробу отработанного бурового раствора смешивают с морской водой (см. 4.2) в соотношении соответственно 1:9 по объему и снова перемешивают с применением смесителя со скоростью вращения 17 с^-1 (1000 об/мин) в течение 5 мин.

После окончания перемешивания смесь отстаивают при температуре (20 ±5)°Св течение 1 ч, затем водную вытяжку над осадком осторожно переливают за один прием в стеклянную емкость и перемешивают в течение 5 мин, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Если отстоявшаяся смесь не имеет четкого раздела фаз, то весь объем подготовленной пробы используют для приготовления анализируемой пробы.

Не допускается консервация и хранение подготовленных водных вытяжек проб отработанных буровых растворов.

Подготовка водных вытяжек из проб твердых промышленных отходов

Перед приготовлением водной вытяжки из твердых промышленных отходов отобранную пробу твердых промышленных отходов разрыхляют и тщательно осматривают. В случае обнаружения частиц размером более 10 мм их измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Не допускается измельчать смесь с помощью механизированных устройств.

Измельченную пробу отходов высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении.

Водную вытяжку из высушенной пробы твердых промышленных отходов готовят в соотношении твердые промышленные отходы: морская вода соответственно 1:10 следующим способом:

В стеклянную емкость вместимостью 1500 см³ вносят 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов, добавляют 1000 см³ морской воды (см. 4.2) и перемешивают в течение 6-7 ч с использованием магнитной мешалки (или орбитального шейкера) с минимальной скоростью перемешивания, при которой проба твердых промышленных отходов поддерживается во взвешенном состоянии.

Примечание - Для приготовления 900 см3 водной вытяжки обычно требуется 100 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов.

Не допускается использовать для приготовления водной вытяжки менее 20 г сухой массы пробы твердых промышленных отходов и менее 200 см³ морской воды.

После окончания перемешивания емкость с полученной смесью ставят в холодильник, где ее выдерживают при температуре от 2 °С до 4 °С в течение 12 - 14 ч, затем жидкость над осадком осторожно переливают в другую емкость, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

7

Примечание - Жидкие промышленные отходы тестируют без разбавления, а также при разбавлениях в 10, 100, 1000 и 10000 раз.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек из твердых промышленных отходов при температуре от 2 °С до 4 °С не более 48 ч.

Подготовка водных вытяжек из проб донных отложений

Перед приготовлением водной вытяжки из донных отложений отобранную пробу донных отложений высушивают при температуре (20 ± 5) ⁰ С до воздушно-сухого состояния, удаляют остатки растений, камешки и т. п., затем измельчают в ступке и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

После просеивания навеску пробы донных отложений вносят в стеклянную емкость и заливают морской водой (см. 4.2) в соотношении соответственно 1 : 4 по объему, перемешивают с использованием орбитального шейкера (или качалки-мешалки) в течение 2 ч. После окончания перемешивания смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре (20 ± 5) °С, ставят в холодильник и выдерживают при температуре от 2 °С до 4 °С в течение 12- 14 ч, затем водную вытяжку над осадком осторожно переливают в стеклянную емкость и фильтруют, после чего используют ее для подготовки анализируемой пробы.

Допускается хранение подготовленных водных вытяжек донных отложений при температуре от 2°Сдо4 °С не более 72 ч.

4.3.4.4    Подготовка исходных растворов веществ

Исходные растворы веществ в зависимости от заданной концентрации готовят в стеклянной мерной емкости путем растворения определенного количества пробы вещества в определенном объеме морской воды (см. 4.2).

Исходные растворы веществ готовят непосредственно перед их тестированием, при этом, если известно, что вещества стабильны в растворе, исходные растворы допускается готовить заранее, но не более чем за двое суток до начала тестирования.

Для веществ, трудно растворимых в воде, при приготовлении их исходных растворов могут быть использованы ультразвуковые или другие устройства (шейкеры) для облегчения растворимости или диспергирования веществ.

Допускается также использовать органические растворители, обладающие малой токсичностью в отношении тест-организмов (например, ацетон), при условии, что концентрация растворителя в анализируемой пробе раствора не превышает 0,1 см³/дм³, при этом параллельно с основным тестированием проводят два контрольных тестирования, одно без растворителя и другое с максимальной концентрацией растворителя.

Для приготовления исходного раствора вещества заданной концентрации невозможно рекомендовать какую-либо единую методику. Например, используют следующую процедуру: в стеклянную мерную колбу вместимостью 1000 см³ (или 100, 50, 25 см³) вносят 1 г вещества (или другое его количество, в зависимости от заданной концентрации раствора), затем осторожно добавляют в колбу небольшое количество отфильтрованной морской воды, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем до метки морской водой и снова перемешивают. Приготовленный раствор маркируют и выдерживают перед тестированием при комнатной температуре не менее 2 ч.

Измеряют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода в исходном растворе вещества.

4.3.4.5    Исходные пробы (см. 4.3.4.1 - 4.3.4.3) и исходные растворы веществ (см. 4.3.4.4) должны иметь следующие характеристики:

a)    Минерализация от 6 до 33 г/дм³ (соленость от 6 %о до 33 %о)

Примечание - Приведен диапазон минерализации (солености) в зависимости от исследуемого объекта; минерализация (соленость) исходных проб (растворов) должна входить в указанный диапазон.

b)    Значение pH 8,0 - 8,3

Если значение pH пробы выходит за указанные пределы, то регулируют pH пробы (добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты или 10%-ный раствор гидроокиси натрия) и аэрируют пробу при помощи аквариумного компрессора в течение 10 - 20 мин для стабилизации pH.

Для исходных проб водных вытяжек из твердых промышленных отходов регулирование pH не допускается.

ГОСТ 31959-2012

с) Концентрация растворенного кислорода должна быть не ниже 7мг О^дм³. Если концентрация растворенного кислорода пробы ниже указанного значения, пробу аэрируют при помощи аквариумного компрессора.

4.3.4.6    Подготовка анализируемых проб

Анализируемые пробы природной морской воды и воды эстуариев готовят следующим способом: в пять конических колб вместимостью 150 см³ вносят по 100 см³ отфильтрованной пробы (см. 4.3.4.1). При необходимости, если анализируемая проба природной морской воды при тестировании по 4.4 показала высокую токсичность, проводят разбавление ее исходной пробы (см. 4.3.4.1) в два, пять, 10 и более раз искусственной морской водой (см. 4.3.2), соленость которой должна соответствовать солености исходной пробы.

Анализируемые пробы сточной воды готовят следующим способом: в пять конических колб вместимостью 150 см³ вносят подготовленную по 4.3.4.2 исходную пробу сточной воды и морскую воду (см. 4.2), соленость которой должна соответствовать солености исходной пробы сточной воды, в объемах:

-100 см³ исходной пробы (проба без разбавления);

- 50 см³ исходной пробы и 50 см³ морской воды (кратность разбавления: 50 %, в два раза);

-10 см³ исходной пробы и 90 см³ морской воды (кратность разбавления: 10%, в 10 раз);

-1 см³ исходной пробы и 99 см³ морской воды (кратность разбавления: 1 %, в 100 раз);

-0,1 см³ исходной пробы и 99,9 см³ морской воды (кратность разбавления: 0,1 %, в 1000 раз).

Анализируемые пробы отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений готовят из водных вытяжек (см. 4.3.4.3) путем их разбавления морской водой (см. 4.2) аналогично подготовке анализируемых проб сточной воды.

Анализируемую пробу раствора вещества готовят следующим способом: в пять конических колб вместимостью 150 см³ вносят по 100 см³ морской воды (см. 4.2), добавляют в колбы рассчитанные объемы исходного раствора вещества (см. 4.3.4.4) для получения заданных концентраций (см. 4.4.1, 4.4.2).

4.3.4.7    Измеряют и регистрируют минерализацию (соленость), pH и концентрацию растворенного кислорода в каждой емкости с анализируемой пробой.

4.3.5 Подготовка тест-организмов к тестированию

Подготовку тест-организмов к тестированию проводят в соответствии с требованиями приложения В с учетом требований 4.3.4.

4.4 Проведение тестирования

Тестирование проводят в два этапа: предварительное и окончательное.

4.4.1    Предварительное тестирование

Предварительное тестирование проводят для установления диапазона разбавлений (концентраций) проб, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование для определения значение 72 ч ЛКР₅₀ (96 ч ЛКР₅₀) или 72 ч ЛК₅₀ в зависимости от анализируемых проб.

При предварительном тестировании исследуют широкую область разбавлений (не менее пяти) сточных вод, водных вытяжек и концентрации растворов вещества, выбираемых в геометрической прогрессии, при этом, как правило, используют коэффициент 10 между разбавлениями (концентрациями).

При предварительном тестировании применяют не менее двух чашек Петри на каждое анализируемое разбавление (концентрацию) пробы и используют не менее 40 тест-организмов.

Предварительное тестирование проводят по 4.4.3.

Пример проведения предварительного тестирования и установления диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в приложении А.

4.4.2    Окончательное тестирование

По результатам предварительного тестирования (см. 4.4.1) выбирают диапазон разбавлений (концентраций) анализируемых проб для окончательного тестирования. При этом используют коэффициент между разбавлениями (концентрациями), как правило, 2,0 или 2,5.

9

Окончательное тестирование проводят по 4.4.3. При этом используют не менее пяти разбавлений (концентраций) анализируемых проб, применяют не менее трех чашек Петри для каждого разбавления (концентрации) и не менее 60 тест-организмов.

Пример проведения окончательного тестирования и установления значений средней летальной концентрации 72 ч ЛК₅₀ для вещества приведен в приложении А.

4.4.3 Процедура тестирования

4.4.3.1    Для каждой серии разбавлений (концентраций) анализируемых проб используют контрольную пробу, содержащую объем морской воды (см. 4.2 или 4.3.2), равный объему анализируемого раствора одного из разбавлений (одной из концентраций) пробы.

Контрольная проба, а также вода для замачивания яиц Artemia salina L. должны соответствовать минерализации (солености) анализируемой пробы.

4.4.3.2    Перед началом тестирования в емкости вместимостью 200 см³ вносят по 150 см³ анализируемой пробы заданного разбавления (концентрации) (см. 4.3.4.6) и измеряют концентрацию растворенного кислорода и pH. Измеряемые характеристики должны соответствовать указанным в 4.3.4.5. Аналогичную процедуру проводят для контрольной пробы (см. 4.4.3.1).

Примечание - Объем (150 см3) каждого разбавления ( концентрации) пробы достаточен для розлива в три чашки Петри по 40 см3 при проведении тестирования.

4.4.3.3    В каждую чашку Петри (см. 4.4.1 и 4.4.2) вместимостью 50 см³ вносят 40 см³ анализируемой пробы (см. 4.3.4.6), соответствующей требованиям 4.4.3.2, затем помещают по 20 экземпляров тест-организмов. Тест-организмы рекомендуется переносить пипеткой с достаточно широким внутренним диаметром (пипеткой Пастера), чтобы не повредить их. Аналогичную процедуру проводят и для контрольных проб (см. 4.4.3.1). Посадку тест-организмов начинают с контрольных проб. При этом плотность посадки не должна превышать один тест-организм на

2,0 см³ раствора.

В анализируемые пробы тест-организмы помещают, начиная с меньших концентраций веществ (больших разбавлений проб).

После окончания посадки тест-организмов в чашки Петри с анализируемыми пробами каждого разбавления (концентрации) пипетку Пастера промывают морской водой.

Не допускается во время тестирования кормить тест-организмы и менять растворы.

4.4.3.4    Тестирование проводят в климатостате (см. 4.2) при температуре (20 ± 2) °С в течение 3-4 сут, имитируя светлый период - 16 ч и темный период -8 ч.

Примечание - Допускается проводить тестирование в помещении с регулируемой температурой, инкубаторе или на водяной бане, обеспечивающих указанный режим тестирования.

4.4.3.5    Подсчитывают каждые сутки через 24, 48, 72 ч (96 ч) в каждой чашке Петри количество живых тест-организмов, при этом пипеткой удаляют мертвые тест-организмы. Для подсчета тест-организмов используют микроскоп. Мертвыми считают тест-организмы, которые в период подсчета не плавают или не двигают отростками в течение 10 с после легкого постукивания по чашке Петри. Для каждой анализируемой пробы заданного разбавления (концентрации), в том числе контрольной, регистрируют количество выживших тест-организмов после 24, 48, 72 ч (96 ч) тестирования. Регистрируют также любые отклонения внешнего вида или поведения тест-организмов по сравнению с тест-организмами в контрольной пробе.

4.4.3.6    После подсчета выживших тест-организмов измеряют в анализируемых и контрольных пробах концентрацию растворенного кислорода и pH.

4.5 Обработка результатов

4.5.1    По результатам тестирования (подсчета выживших тест-организмов см.4.4.3.5) для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы, в том числе контрольной, рассчитывают среднеарифметическое значение выживших тест-организмов.

4.5.2    Определение токсичности анализируемых проб

4.5.2.1 Токсичность анализируемых проб А, %, определяют по гибели тест-организмов для каждого заданного разбавления (концентрации) анализируемой пробы относительно контрольной пробы после 72 ч (96ч) тестирования и рассчитывают по формуле

ГОСТ 31959-2012

Хк — Хан Хк

(1)

где Хк - среднеарифметическое значение количества выживших тест-организмов в контрольной пробе, шт.;

Хан - среднеарифметическое значение количества выживших тест-организмов в анализируемой пробе, шт.

4.5.2.2    По результатам подсчета (см. 4.5.2.1), полученным в процентах, для каждого анализируемого разбавления (концентрации) пробы определяют среднюю летальную кратность разбавления пробы 72 чЛКР₅₀ (96 чЛКР₅₀), для растворов веществ - среднюю летальную концентрацию 72 ч ЛК₅₀.

При необходимости определяют:

-    минимальную концентрацию пробы, соответствующую 100%-ной смертности тест-организмов, и максимальную концентрацию пробы, соответствующую 0 %-ной смертности тест-организмов за 72 ч (96 ч).

-    безвредную кратность разбавления (концентрации) пробы, вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов;

-    максимальную концентрацию пробы вещества, при которой проводилось тестирование.

4.5.2.3    Если по результатам тестирования не удалось определить конкретное значение средней летальной кратности разбавления (концентрации) пробы, вызывающей 50%-ную гибель тест-организмов за 72 ч (96 ч), то для определения этого значения используют пробит-анапиз. Пример приведен в приложении А.

4.5.3 Определение степени токсичности анализируемых проб

4.5.3.1    Если значение токсического эффекта анализируемых проб, рассчитанное по формуле (1), составляет менее 10 %, то эффективную кратность разбавления (эффективную концентрацию) анализируемой пробы, при которой гибель тест-организмов отмечалась относительно контрольной пробы не более 10 % за 72 ч тестирования (или 96 ч тестирования в зависимости от исследуемого объекта), относят к безвредной кратности разбавления (безвредной концентрации).

4.5.3.2    Степень токсичности исследуемых проб оценивают:

-    природной морской воды и воды эстуариев - по таблице 2;

-    донных отложений - по таблице 3;

-    отработанных буровых растворов - по таблице 4;

-    химической продукции, смесевой химической продукции - по таблице 5*;

-    сточной воды, поступающей в морские водоемы, твердых промышленных отходов - по стандартам и другим нормативным документам, утвержденным в установленном порядке.

Примечание - Под нормативным документом следует понимать документы, устанавливающие критерии отнесения исследуемых объектов к классу опасности для окружающей природной среды, разработанные в целях реализации федеральных законов (технических регламентов) в данной области. Таблица 2 - Степень токсичности проб природной морской воды и воды эстуариев

Степень токсичности проб морской природной воды и воды эстуариев Значение токсического эффекта (см. 4.5.2.1) для проб природной морской воды и воды эстуариев без разбавления А, % Общая Детализированная Токсичность отсутствует Нетоксичная до Ювключ. Не обладает острой токсичностью Слаботоксичная св. 10 » 25 » Малотоксичная » 25» 35 » Среднетоксичная » 35» 50 » Обладает острой токсичностью Высокотоксичная » 50» 100»

Таблица 3 - Степень токсичности проб донных отложений

Степень токсичности проб водных вытяжек донных отложений Значение токсического эффекта (см. 4.5.2.1) для проб донных оппложений А, % Общая Детализированная Токсичность отсутствует Нетоксичная до Ювключ. Не обладает острой токсичностью Слаботоксичная св. 10 » 35 » Среднетоксичная » 35» 50 » Обладает острой токсичностью Высокотоксичная » 50» 100»

В Российской Федерации - по ГОСТ Р 53857, ГОСТ Р 53858; при необходимости оценки других водных растворов веществ - по таблице 5 настоящего стандарта.

11

Окончание таблицы 3

Примечание - При необходимости более детальной оценки токсичности загрязненных проб донных отложений степень токсичности определяют по значению кратности разбавления (см. 4.5.2) 96 ч ЭКР50 , приве-денным в таблице 4._

Таблица 4 - Степень токсичности проб отработанных буровых растворов, загрязненности проб донных отложений

Степень токсичности водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений) Значение кратности разбавления (см. 4.5.2) водных вытяжек проб отработанных буровых растворов (донных отложений) 96 ч 3KPVI, разы Нетоксичные 1,0 Слаботоксичная Менее 100 Среднетоксичная От 100 до 1000 Высокотоксичная » 1000 » 10000 Гчпертоксичная Более 10000

Таблица 5 - Степень токсичности водных растворов веществ

Степень токсичности водных растворов веществ Значение эффективной концентрации вещества (см.4.5.2) 72 ч ЭК50, мг/дм3 Нетоксичные Св. 1000 Практически нетоксичные От 1000 до 100 включ. Слаботоксичные Менее 100 » 10 » Среднетоксичные » 10 » 1,0 » Высокотоксичные » 1,0 » 0,01» Гипертоксичные » 0,01

4.5.4 Результаты тестирования считают достоверными, если соблюдаются следующие условия:

a)    процент гибели тест-организмов в контрольных пробах не более 10 %;

b)    токсичность модельного токсиканта находится в пределах, указанных в 4.3.3.4.

4.6 Оформление результатов тестирования

4.6.1    Результаты тестирования регистрируют в протоколе испытаний в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом дополнительно указывают следующую информацию:

a)    ссылку на настоящий стандарт с указанием метода определения;

b)    данные, необходимые для идентификации пробы или анализируемого вещества, прошедшего испытания;

c)    методы подготовки проб:

-    для природной морской воды, воды эстуариев или сточных вод - условия и продолжительность хранения проб и, при необходимости, условия, в которых проводились отстаивание, фильтрование, а также размораживание пробы,

-    для веществ и водных вытяжек - способ приготовления исходных и анализируемых проб (растворов);

d)    информацию, относящуюся к тестированию, включая вид, источник, возраст и стадию жизненного цикла тест-организма, условия культивирования, источник и характеристику морской воды;

e)    результаты окончательного определения средней летальной кратности разбавления 72 ч ЛКР₅₀ или 96 ч ЛКР₅₀ (средней летальной концентрации 72 ч ЛК₅₀), метод расчета (при необходимости);

f)    минимальную концентрацию пробы вещества (минимальную кратность разбавления пробы), соответствующую 100%-ной смертности, и максимальную концентрацию (максимальную кратность разбавления), соответствующую 0%-ной смертности тест-организмов за 24, 48, 72 и 96 ч;

д) любые отклонения в поведении или внешнем виде тест-организмов в условиях тестирования;

h)    обстоятельства и условия, не предусмотренные настоящим стандартом, способные повлиять на результат тестирования;

i)    значения pH и концентрацию растворенного кислорода в анализируемых и контрольных пробах в начале и конце тестирования.

4.6.2    Значения 72чЛКР₅₀ (96 чЛКР₅₀), 72 ч ЛК₅₀ и диапазон разбавлений (концентраций) пробы, соответствующий 0%-ной и 100%-ной смертности выражают:

12

ГОСТ 31959-2012

-    в процентах (%) или в кратности разбавления (разы) - для природной морской воды, воды эстуариев, сточных вод и водных вытяжек;

-    в миллиграммах (или микрограммах) на кубический дециметр-для растворов веществ.

5 Метод определения токсичности исследуемых объектов по выживаемости морских ракообразных видов Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco, Nitocra spinipes Boeck (Copepoda, Crustacea) (метод Б)

5.1    Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации гибели морских ракообразных видов Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco, Nitocra spinipes Boeck (Copepoda, Crustacea) в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 48 ч.

Среднюю летальную кратность разбавления за 48 ч тестирования, вызывающую гибель 50 % тест-организмов, обозначают 48 ч ЛКР₅₀\ среднюю летальную концентрацию - 48 ч ЛК^.

Примечание - Допускается проводить определение средней летальной кратности разбавления проб сточной воды (концентрации вещества), вызывающей гибель 50 % тест-организмов за 24 ч [24 ч ЛКР50 (24 ч ЛК50)], или при увеличенной продолжительности тестирования до 96 ч [96 ч ЛКР50 (96 ч ЛК50)].

5.2    Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы - по 4.2 со следующими дополнениями:

Контейнеры для тестирования из химически инертных материалов [например, стеклянные химические стаканы (или чашки Петри) по ГОСТ 25336] и одноразовые чашки Петри из твердого полимерного материала с ячейками для культур организмов.

Примечание - Для снижения испарения анализируемых растворов рекомендуется для контейнеров использовать неплотно прилегающие широкие крышки.

Для ранних стадий жизненного цикла тест-организмов могут быть использованы специальные контейнеры, приспособленные для наблюдений с использованием микроскопа.

Тест-организмы: морские ракообразные видов:

-    Acartia tonsa Dana;

-    Tisbe battagliai Volkmann-Rocco;

-    Nitocra spinipes Boeck.

Примечания

1    Для тестирования используют культуру тест-организмов одного из указанных видов.

2    Тест-организмы получают путем их культивирования в лабораторных условиях в соответствии с требованиями приложения В.

После откладывания яиц жизненный цикл тест-организмов состоит из стадий развития науплиев, копеподитов и взрослых особей. Возраст и стадия жизненного цикла тест-организма по состоянию на начало тестирования должны быть указаны в протоколе испытаний следующим образом:

-    Acartia tonsa Dana: крупные копеподиты (стадия 5) или взрослые особи;

-    Tisbe battagliai Volkmann-Rocco: копеподиды в возрасте (6 ± 2) сут;

-    Nitocra spinipes Boeck: взрослые особи в возрасте от 3 до 4 недель.

Модельный токсикант: 3,5-дихпорфенол, ч. д. а или по 4.2.

Морская вода (далее - вода для разбавления) - по 4.2.

Примечания

1    При тестировании по методу Б для применяемых тест-организмов недостаточно информации о возможности использования искусственной морской воды.

2    Использование воды для разбавления (природной морской воды) с более низкой соленостью, что больше подходит для испытаний устьевой (опресненной) или жесткой воды, должно быть отражено в протоколе испытаний.

3    Nitocra spinipes Boeck допускается использовать при минерализации воды менее 1 г/дм³ (солености менее 1 %о), a Tisbe battagliai Volkmann-Rocco - для воды с минерализацией до 20 г/дм³ (солености до 20 %о).

13

Перед началом тестирования тест-организмы культивируют и выдерживают не менее 7 сут в природной морской воде такой же солености (при допускаемом предельном отклонении ± 3 %о), что и анализируемые пробы.

4    Содержание растворенного кислорода в воде для разбавления должно быть более 7 мг 0₂/дм³, а значение pH-(8,0 ±0,3).

5    Природная морская вода (вода для разбавления) должна обеспечивать выживание тест-организмов не менее 48 ч и должна быть отобрана из того же источника, что и природная морская вода, которая применялась для культивирования тест-организмов на протяжении жизненного цикла не менее двух поколений.

Аммоний молибденовокислый 4-водный (NH₄)₆Mo₇0₂₄ ■ 4Н₂0.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245, х. ч.

Марганец (II) хлористый 4-водный по ГОСТ 612, х. ч.

Желез (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147, х. ч.

Натрий азотнокислый по ГОСТ 4168, х. ч.

Кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525, х. ч.

Цинк хлористый по ГОСТ 4529, х. ч.

Соль динатриевая 3muneHduaMUH-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х. ч.

Медь (II) сернокислая 5-водная (CuSO ■ 5Н₂0), х. ч.

Витамин В₁₂ (цианокобаламин).

Витамин В_г

5.3 Подготовка к тестированию

5.3.1    Подготовка посуды - по 4.3.1, при этом перед тестированием контейнеры для тестирования (см. 5.2) должны быть тщательно вымыты водопроводной водой и ополоснуты сначала дистиллированной водой, а затем морской водой (см. 5.2).

5.3.2    Подготовка исходных и анализируемых проб - по 4.3.4. При этом исходные растворы вещества готовят с использованием дистиллированной воды. Минерализация (соленость) анализируемых проб должна соответствовать минерализации (солености) использованной морской воды (см. 5.2).

Рекомендуется, чтобы объем приготовленной анализируемой пробы был достаточным и для определения концентрации растворенного кислорода и pH.

5.3.3    Проверка физиологической чувствительности тест-организмов

Периодически (не реже одного раза в месяц), а также непосредственно перед тестированием тест-организмы проверяют на физиологическую чувствительность. Для этого определяют среднюю летальную концентрацию модельного токсиканта 3,5-дихлорфенола при тестировании в течение 48 ч (48 ч ЛК₅₀).

Анализируемые растворы модельного токсиканта (3,5-дихлорфенола) готовят непосредственно перед определением физиологической чувствительности тест-организмов аналогично растворам модельного токсиканта на основе двухромовокислого калия (см 4.3.3.1 и 4.3.3.2), но для диапазона концентраций 3,5-дихлорфенола, приведенных в таблице 6.

Тестирование проводят в соответствии с требованиями 5.4 в течение 48 ч.

На основании полученных результапюв аналогично 4.5.5 определяют значение 48 ч ЛК₅₀ для модельного пюксиканта (3,5-дихлорфенола), при этом:

-    если значение 48 ч ЛК₅₀ модельного токсиканта находится в диапазоне концентраций 3,5-дихлорфенола, указанных в таблице 6, то используемые тест-организмы пригодны для тестирования;

-    если значение 48 ч ЛК₅₀ модельного токсиканта (3,5-дихлорфенола) не входит в диапазон концентраций, указанных в таблице 6, то проверяют соблюдение выполнения условий тестирования, условия культивирования тест-организмов и, при необходимости, используют новую культуру тест-организмов.

Примечание - Значение 48 ч ЛК50 модельного токсиканта указывают в протоколе испытаний, имея в виду, что это значение в установленном диапазоне концентраций характеризует токсичность модельного токсиканта только для использованных тест-организмов, а также характеризует их физиологическую чувствительность, что позволяет проводить тестирование с использованием указанных тест-организмов.

Таблица 6

Тест-организмы Массовая концентрация раствора модельного токсиканта (3,5-дихлорфенола), мг/дм3, соответствующая 50%-ной гибели тест-организмов (48 ч ЛК50) (20 - 80)%-ной гибели тест-организмов Acartia tonsa Dana 0,5-1,5 1,0 Tisbe battagliai Volkmann-Rocco 1,1 -3,5 2,3 Nitocra spinipes Boeck 1,9-5,7 3,8

Примечание - Значения 48 ч ЛК50 могут изменяться в зависимости от минерализации (солености) среды. Приведенные в таблице 6 значения относятся только к среде с минерализацией от 29 до 36 г/дмЗ. (со-леностью от 29 %о до 36 %о)._

Допускается проверять физиологическую чувствительность тест-организмов путем определения гибели тест-организмов в растворе модельного токсиканта при одной концентрации, приведенной в таблице 6, после тестирования в течение 48 ч. Если гибель тест-организмов при этом составляет от 20 % до 80 %, то чувствительность тест-организмов является приемлемой для тестирования. Если гибель тест-организмов не попадает в указанный диапазон их гибели, то проверяют соблюдение выполнения условий тестирования, способ культивирования тест-организмов и, при необходимости, используют новую культуру тест-организмов.

5.4    Проведение тестирования

5.4.1    Проведение тестирования - аналогично 4.4, но с использованием тест-организмов по 5.2 и тестирования в течение 48 ч.

При необходимости определяют 24 ч ЛК₅₀ (24 ч ЛКР₅₀), а также концентрации вещества (разбавлений), соответствующие 0%-ной и 100%-ной смертности тест-организмов за 48 ч.

Пример проведения предварительного тестирования и установления диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, приведен в приложении А. Для тестирования используют по одному контейнеру для каждой концентрации анализируемого раствора.

Пример проведения окончательного тестирования для определения значения средней летальной концентрации 48 ч ЛК^ приведен в приложении А. При проведении тестирования рекомендуется использовать одинаковые контейнеры (см. 5.2).

Процедура тестирования - по 4.4.3 со следующими уточнениями:

5.4.1.1    В серию контейнеров для тестирования (см. 5.2) вносят равные объемы анализируемой пробы (см. 5.3.2). Объем анализируемой пробы должен быть таким, чтобы при использовании необходимого количества тест-организмов их плотность не превышала одного организма на 0,5 см³ пробы, при этом для Acartia tonsa Dana рекомендуемая максимальная плотность посадки - один организм на 5 см³ анализируемой пробы.

5.4.1.2    Для каждой серии определений подготавливают контрольную пробу в контейнере, содержащую объем воды для разбавления (см. 5.2), равный объему анализируемого раствора одной из концентраций вещества (разбавлений сточной воды).

Если для растворения или диспергирования вещества используют растворитель, то одновременно готовят второй контрольный контейнер с контрольной пробой из воды для разбавления (см. 5.2), содержащей растворитель в максимальной используемой концентрации.

5.4.1.3    Тестирование трудно растворимых веществ проводят по 4.4.3 с использованием 20 тест-организмов и только при одной концентрации, которая соответствует массовой концентрации 100 мг/дм³ или более низкой концентрации, являющейся максимальной для растворения данного вещества.

5.4.2 После подсчета выживших тест-организмов измеряют в анализируемых и контрольных пробах концентрацию растворенного кислорода и pH.

5.5    Обработка результатов - аналогично 4.5 с определением токсичности и токсикологических показателей за 48 ч.

Информация о результатах тестирования проведенных межпабораторных испытаниий приведена в приложении С.

5.6    Оформление результатов - аналогично 4.6.

15

Приложение А (рекомендуемое)

Примеры определения средней летальной концентрации (разбавления)

А.1 Пример определения 72 ч ЛК₅₀ модельного токсиканта для метода А

Результаты определения физиологической чувствительности науплиев Artemia salina L в растворе модельного токсиканта (калий двухромовокислый) приведены в таблице А.1.

Таблица А.1

Продолжитель- Массовая концентрация Количество выживших тест- Среднеарифметическое Процент ность тести- раствора модельного организмов, шт., в чашках Петри значение количества выжив- гибели тест- роеания, ч токсиканта, мг/дм3 № 1 №2 №3 ших тест-организмов, шт. организмов, % 0 (контрольная) 20 20 20 20 0 1,0 20 20 20 20 0 72 2,0 20 20 20 20 0 5,0 16 17 15 16 20 7,5 9 9 9 9 55 10,0 2 3 1 2 90

По результатам тестирования, приведенным в таблице А. 1, гибель 50 % тест-организмов не зарегистрирована. В этом случае для обработки результатов тестирования применяют пробит-анализ аналогично А. 4.

Получают значение 72 ч ЛК₅₀ для указанного модельного токсиканта, равное 7,24 мг/дм³, которое входит в диапазон концентраций, указанный в 4.3.3.4 настоящего стандарта. Следовательно, использованные тест-организмы пригодны для тестирования.

А.2 Примеры определения средней летальной концентрации вещества при тестировании

по методу А

А. 2.1 Пример проведения предварительного тестирования по 4.4.1 настоящего стандарта для выбора диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование, приведен в таблице А.2.

Таблица А.2

Продолжительность тестирования, ч Массовая концентрация вещества, мг/дм3 Количество выживших тест-организмов в чашках Петри, шт. Среднеарифметическое значение количества выжив-ших тест-организмов, шт. Процент гибели тест-организмов, % № 1 №2 72 0 (контрольная проба) 20 20 20 0 0,1 20 20 20 0 1,0 20 20 20 0 10,0 11 9 10 50 100,0 3 3 3 85 1000,0 0 0 0 100

Из данных таблицы А.2 следует, что диапазон концентраций вещества, в пределах которого необходимо проводить окончательное тестирование, составляет от 1,0 до 100 мг/дм³.

А.2.2 Пример проведения окончательного тестирования по 4.4.2 настоящего стандарта приведен в таблице А.З.

Таблица А.З

Продолжительность тестирования, ч Массовая концентрация вещества, мг/дм3 Количество выживших тест-организмов в чашках Петри, шт. Среднеарифметическое значение количества выжив-ших тест-организмов, шт. Процент гибели тест-организмов, % № 1 №2 №3 72 0 (контрольная проба) 20 20 20 20 0 1,0 20 20 20 20 0 2,5 17 19 18 18 10 5,0 16 14 15 15 25 10,0 11 10 9 10 50 100,0 4 3 2 3 85

ГОСТ 31959-2012

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 31959-2012

Из данных таблицы А.З видно, что 50%-ной гибели тест-организмов соответствует массовая концентрация вещества, равная 10 мг/дм³ при тестировании в течение 72 ч (72 ч ЛК₅₀).

Если значение массовой концентрации вещества, которое соответствует 50%-ной гибели тест-организмов при тестировании в течение 72 ч, не зарегистрировано (см. таблицу А. 4), то его определяют, используя для обработки результатов тестирования пробит-анализ аналогично А. 4.

Таблица А.4

Продолжительность тестирования, ч Массовая концентрация вещества, мг/дм3 Количество выживших тест-организмов в чашках Петри, шт. Среднеарифметическое значение количества выживших тест-организмов, шт. Процент гибели тест-организмов, % № 1 №2 №3 72 0 (контрольная проба) 20 20 20 20 0 1,0 20 20 20 20 0 2,5 17 16 15 16 20 5,0 12 13 14 13 35 10,0 9 8 7 8 60 100,0 1 0 2 1 95

А.З Примеры определения средней летальной концентрации вещества при тестировании по методу Б

А.3.1 Пример проведения предварительного тестирования по 5.4 для выбора диапазона концентраций вещества, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование, приведен в таблице А.5.

Таблица А.5

Массовая концентрация вещества, мг/дм3 Количество выживших тест-организмов, шт., после тестирования в течение 24 ч 48ч 0 (контрольная проба) 5 5 0,10 5 5 0,32 5 5 1,0 5 5 3,2 5 3 10 0 0 32 0 0 100 0 0

Из данных таблицы А.5 следует, что диапазон концентраций вещества, в пределах которого необходимо провести окончательное тестирование, составляет от 1,0 до 10 мг/дм³.

А.3.2 Пример проведения окончательного тестирования приведен в таблице А.6.

Таблица А.6

Продолжительность тестирования, ч Массовая концентрация вещества, мг/дм3 Количество выживших тест-организмов в контейнерах, шт. Общее количество выживших тест-организмов, шт. Процент гибели тест-организмов, % № 1 № 2 № 3 №4 24 0 (контрольная проба) 5 5 5 5 20 0 1,0 5 5 5 5 20 0 1,8 5 5 5 5 20 0 3,2 4 5 4 5 18 10 5,6 2 3 1 2 8 60 10 0 1 0 1 2 90 48 0 (контрольная проба) 5 5 5 5 20 0 1,0 5 5 5 5 20 0 1,8 5 4 5 3 17 15 3,2 3 1 1 2 7 65 5,6 0 0 1 1 2 90 10 0 0 0 0 0 100

А.3.3 По результатам тестирования в течение 24 и 48 ч, приведенным в таблице А.6, 50%-ная гибель тест-организмов не зарегистрирована. В этом случае для обработки результатов тестирования применяют пробит-анапиз аналогично А.4 и получают следующие значения: средняя летальная концентрация пробы вещества при тестировании в течение 24 ч (24 ч ЛК^) равна 5,4 мг/дм³; средняя летальная концентрация пробы вещества при тестировании в течение 48 ч (48 ч ЛК^) равна 2,9 мг/дм³ ■

17

Содержание

1    Область применения....................................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки...................................................................................................................................1

3    Отбор проб....................................................................................................................................................2

4    Метод определения токсичности исследуемых объектов по выживаемости

эвригалинного рачка вида Artemia salina L. (Branchiopoda, Crustacea) (метод A).................................3

5    Метод определения токсичности исследуемых объектов по выживаемости морских ракообраз

ных видов Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco, Nitocra spinipes Boeck (Copepoda, Crustacea) (метод Б).................................................................................................................................13

Приложение А (рекомендуемое) Примеры определения средней летальной концентрации

(разбавления).....................................................................................................................16

Приложение В (обязательное) Методы культивирования тест-организмов..............................................19

Приложение С (справочное) Информация о результатах тестирования проведенных

при межлабораторных испытаниях для метода Б.........................................................24

Приложение Д.А (справочное) Сравнение структуры международного стандарта

со структурой межгосударственного стандарта..............................................................25

Приложение Д.Б (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов

ссылочным международным стандартам........................................................................27

Библиография................................................................................................................................................30

IV

ГОСТ 31959-2012 (ISO 14669:1999)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВОДА

Методы определения токсичности по выживаемости морских ракообразных

Water. Methods of determination of toxicity by survival of marine crustaceans

Дата введения — 2014—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на природные морские воды и воды эстуариев, а также сточные воды с минерализацией от б до 33 г/дм³ и устанавливает методы лабораторного биологического тестирования (далее - тестирование) с определением их токсичности по выживаемости морских ракообразных:

-    эвригапинного рачка вида Artemia salina L. (Branchiopoda, Crustacea) (метод A);

-    видов Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco, Nitocra spinipes Boeck (Copepoda, Crustacea) (метод Б).

Методы применяют также для определения токсичности растворимых веществ. Метод А применяют также для отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и морских донных отложений.

Методы позволяют определять токсичность исследуемых объектов и следующие их токсикологические показатели (относительно контрольной пробы):

-    среднюю летальную кратность разбавления (ЛКР₅₀) пробы, вызывающую гибель 50 % морских ракообразных (далее - тест-организмов), и безвредную кратность разбавления пробы (ЛКР₁₀), вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов за 72 ч (96 ч) тестирования (метод А); за 48 ч тестирования (метод Б);

-    среднюю летальную концентрацию (ЛК₅₀) растворов веществ, вызывающую гибель 50 % тест-организмов, и безвредную концентрацию (ЛК₁₀) растворов веществ, вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов за 72 ч тестирования (метод А) и за 48 ч тестирования (метод Б).

Примечание - Продолжительность тестирования 96 ч, указанную для метода А, используют при определении токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений.

В помещении лаборатории, где проводят тестирование:

-    окружающая среда (атмосфера) не должна содержать пара или пыли, токсичной для тест-организмов;

-    температура окружающего воздуха должна быть от 19 °С до 24 °С;

-    относительная влажность воздуха - не более 80 %;

-    атмосферное давление должно быть 84- 106 кПа (630 - 800 мм pm. cm.).

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17.1.5.05-85 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков

ГОСТ 17.4.4.02-84 Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализа

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 612-75 Реактивы. Марганец (II) хлористый 4-водный. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3765-78 Реактивы. Аммоний молибденовокислый. Технические условия

ГОСТ 4147-74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4168-79 Реактивы. Натрий азотнокислый. Технические условия

ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 4525-77 Реактивы. Кобальт хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4529-78 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая 3muneHduaMUH-N,N,N’,N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 19126-2007 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31861-2012 Вода. Общие требования к отбору проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор проб

3.1 Отбор проб воды и донных отложений проводят в соответствии стребованиями ГОСТ 17.1.5.05, ГОСТ 31861, [1]**, [2]** и [3]**. При этом объем пробы воды должен быть не менее 500 см³; масса пробы донных отложений - не менее 2 кг.

Примечание - Отбор проб сточных вод проводят до этапа хлорирования.

Рекомендуемый срок хранения проб природной морской воды, воды эстуариев, сточных вод и донных отложений при комнатной температуре не более 12 ч после их отбора до проведения тестирования. Допускается хранение проб до проведения их тестирования:

-    не более 48 ч при температуре от 0 °С до 4 °С;

-    не более 2 мес при температуре минус 18 °С.

Примечание - Если отобранную пробу воды перед тестированием требуется отстаивать или фильтровать, то отстаивание и фильтрование должны предшествовать ее замораживанию.

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».

** Действуют для Российской Федерации.

ГОСТ 31959-2012

3.2    Отбор проб отработанных буровых растворов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуются отработанные буровые растворы, массой не менее 5,0 кг, при этом под крышкой емкости, в которую отобрана проба, должен оставаться слой воздуха высотой 2 см.

Отобранные пробы отработанных буровых растворов хранят в емкостях-холодильниках при температуре от 0°Сдо4 °С не более 3 мес.

После вскрытия емкостей-холодильников для подготовки проб отработанных буровых растворов к тестированию срок хранения не должен превышать 14 сут.

3.3    Отбор проб твердых промышленных отходов проводят в соответствии с требованиями технической документации предприятия, на котором образуется отход, массой не менее 2 кг.

Срок хранения отобранных проб твердых промышленных отходов в емкостях с притертой или плотно закрытой крышкой при температуре от 0°Сдо 4 °С не более 7 сут.

3.4    Отбор проб веществ, условия и сроки их хранения должны соответствовать требованиям стандартов и другой документации на конкретную продукцию (группу однородной продукции).

3. 5 Для отбора проб природной морской воды, воды эстуариев, отработанных буровых растворов, донных отложений используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата или политетрафторэтилена, а при наличии в воде нефтепродуктов, поверхностно-активных веществ (ПАВ) и пестицидов - емкости из темного стекла.

Для отбора проб сточных вод, твердых промышленных отходов используют емкости из темного стекла или нержавеющей стали, при этом не допускается использовать емкости с хромовым покрытием.

Для отбора проб веществ используют емкости из полиэтилена, полиэтилентерефлата, политетрафторэтилена или темного стекла.

3.6    Продолжительность и условия хранения отобранной пробы указывают в протоколе испытаний.

3.7    Консервацию отобранных проб не проводят.

4 Метод определения токсичности исследуемых объектов по выживаемости эвригалинного рачка вида Artemia salina L.

(Branchiopoda, Crustacea) (метод A)

4.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в регистрации гибели науплиев эвригалинного рачка вида Artemia salina L. (Branchiopoda, Crustacea) в анализируемой пробе исследуемого объекта относительно контрольной пробы, определении ее токсичности и токсикологических показателей при тестировании в течение 72 ч (96 ч).

Примечание - Исследуемыми объектами являются природная морская вода, вода эстуариев, морские донные отложения, сточная вода, разной солености, а также отработанные буровые растворы, твердые промышленные отходы и растворы веществ в морской воде.

Продолжительность тестирования 72 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб природной морской воды, воды эстуариев и сточной воды, а также анализируемых проб веществ.

Примечание - Допускается проводить определение средней летальной кратности разбавления проб сточной воды (концентрации вещества), вызывающей гибель 50 % тест-организмов при увеличенной продолжительности тестирования до 96 ч [96 ч ЛКР50 (96 ч ЛК50)].

Продолжительность тестирования 96 ч указана для определения токсичности и токсикологических показателей анализируемых проб отработанных буровых растворов, твердых промышленных отходов и донных отложений.

Среднюю летальную кратность разбавления (ЛКР₅₀) за 72 ч тестирования обозначают как 72 ч ЛКР₅₀, за 96 ч тестирования - соответственно 96 ч ЛКР₅₀; среднюю летальную концентрацию (ЛК₅₀) за 72 ч тестирования как 72 ч ЛК₅₀.

Примечание - Примеры определения средней летальной кратности разбавления (концентрации) приведены в приложении А.

3

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, материалы

Климатостат, оснащенный лампами дневного света, обеспечивающий освещенность 3000 -6000 лк и поддержание температуры (20 ±2)°С.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 высокого класса точности (II) с ценой деления (дискретностью отсчета) не более 0,01 г и наибольшим пределом взвешивания 220 г.

pH-метр любого типа, обеспечивающий измерения pH в диапазоне от 3 до 10 единиц pH с допускаемой погрешностью ± 0,05 единиц pH.

Термометр лабораторный с диапазоном измерения от 0 °С до 50 °С, с ценой деления шкалы 0,5° С.

Оксиметр любого типа с допускаемой погрешностью измерения не более 0,5 мг О/дм³.

Прибор для измерения минерализации (солености) любого типа (например, карманный рефрактометр-солемер с автотермокомпенсацией) с допускаемой погрешностью измерения общей минерализации (солености) ± 1,0 г/дм³ [± 1 ■ 10"³ (± 1 %о)].

Пипетки автоматические - дозаторы любого типа вместимостью 0,1 -0,2 см³ с допускаемой погрешностью аттестованного значения ± 1,0%.

Пипетки по ГОСТ 29227 вместимостью 1, 2, 5, 10 см³ с ценой деления 0,1 см³.

Пипетка Пастера вместимостью 1,5 см³.

Микропипетки по ГОСТ 29227 вместимостью 0,1 см³, 0,2 см³ с ценой деления 0,01 см³.

Колбы мерные по ГОСТ 1770, 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2.

Микроскоп биологический типа МБС-10, обеспечивающий увеличение в 50- 100 раз.

Мешалка магнитная.

Устройство для встряхивания любого типа (например, орбитальный шейкер, качалка-мешалка).

Центрифуга лабораторная медицинская.

Сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения.

Аквариумный микрокомпрессор любого типа, например АЭН-4.

Шпатели металлические по ГОСТ 19126.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от минус 18 °С до минус 20 °Сиот2 °С до 4 °С.

Ступки и пестики фарфоровые по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтры обезволенные «белая лента».

Установка для фильтрования любого типа.

Фильтры мембранные с диаметром пор 0,45; 3,5 мкм.

Эксикаторы по ГОСТ 25336.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 10 см³.

Чашки Петри по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³.

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100, 1000 см³, второго класса точности.

Стаканы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 вместимостью 50, 100, 500, 1000 см³.

Сухие яйца Artemia salina L., коммерческие готовые.

Тест-организмы: Artemia salina L.

Примечание - Тест-организмы получают путем замачивания сухих яиц в морской воде в лабораторных условиях и подготавливают выклюнувшихся науплиев к тестированию в соответствии с требованиями, указанными в приложении В. Жизненный цикл Artemia salina L. состоит из науплиальных стадий (от ортонауплиуса до мета-науплиуса - 72 ч; молоди, взрослых особей - 21 сут). Стадия жизненного цикла тест-организма по состоянию на начало тестирования должна быть указана в протоколе испытаний.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деионизированная.

Природная или искусственная морская вода минерализацией 33 г/дм³ (соленостью 33 %о) (далее -вода для разбавления).

Примечание - Если в качестве воды для разбавления используют природную морскую воду, то ее отбирают вдали от берега с глубины 3 - 5 м, чтобы избежать поверхностного загрязнения, и транспортируют в лабораторию в стеклянных или полиэтиленовых емкостях. В лаборатории воду фильтруют через мембранный фильтр с порами диаметром 0,45 мкм, чтобы удалить находящиеся в ней взвешенные вещества и организмы, и хранят в темном месте при комнатной температуре.

Модельный токсикант: калий двухромовокислый по ГОСТ 4220, ч. д. а.

ГОСТ 31959-2012

Калий хлористый по ГОСТ 4234, х. ч.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, х. ч.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, х. ч.

Кальций хлористый, х. ч., безводный.

Магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209, х. ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

Кислота азотная по ГОСТ 4461, х. ч.

Кислота борная по ГОСТ 9656, х. ч.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

4.3 Подготовка к тестированию

4.3.1    Подготовка посуды

4.3.1.1    Емкости для отбора проб и тестирования должны быть химически чистыми.

Для проведения тестирования используют только стеклянную посуду.

4.3.1.2    Стеклянную посуду для тестирования осторожно промывают 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают 2-3 ч при комнатной температуре, затем тщательно промывают водопроводной водой, обрабатывают раствором натрия углекислого кислого, промывают водопроводной водой, после чего не менее 3-4раз ополаскивают дистиллированной водой.

При сильном загрязнении посуды, а также новую посуду промывают водопроводной водой, заполняют 10%-ным раствором азотной кислоты и выдерживают в течение суток, после чего обрабатывают раствором натрия углекислого кислого, затем тщательно промывают водопроводной водой и не менее 3-4раз ополаскивают дистиллированной водой.

4.3.1.3    Емкости для отбора проб и посуду для тестирования сушат на воздухе при комнатной температуре, затем стеклянную посуду, за исключением мерной, помещают в сушильный шкаф и выдерживают в течение 1 ч при температуре 150° С.

Чистую посуду (емкости) закрывают стеклянными притертыми пробками или крышками и хранят в шкафах или на полках.

4.3.2 Приготовление искусственной морской воды

Искусственную морскую воду готовят на дистиллированной воде по ГОСТ 6709 из реактивов, вносимых в количествах, приведенных в таблице 1.

Таблица 1

Наименование реактива Масса реактива, вносимая на 1 дм3 дистиллированной воды, г Натрий хлористый по ГОСТ 4233 (NaCI) 22,00 Магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209 (МдС12 ■ 6Н20) 9,70 Натрий сернокислый по ГОСТ4166 (Na2S04), безводный 3,70 Кальций хлористый (СаС12), безводный 1,00 Калий хлористый по ГОСТ 4234 (KCI) 0,65 Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201 (NaHCO^ 0,20 Борная кислота по ГОСТ 9656 (Н^О^ 0,023

Минерализация (соленость) приготовленной из указанных реактивов искусственной морской воды составляет 33 г/дм³ (33 %о). При необходимости, для уменьшения минерализации (солености), искусственную морскую воду разбавляют дистиллированной водой.

Допускается готовить искусственную морскую воду, используя готовую морскую соль (например, марки «Wieqandt»).

Приготовленную искусственную морскую воду аэрируют в течение 1-2 сут при помощи микрокомпрессора, затем дают отстояться в течение 10-14 сут.

Искусственная морская вода должна соответствовать следующим требованиям:

-    значение pH в пределах 8,0- 8,3;

-    содержание растворенного кислорода не менее 7 мг 0₂/дм³;

-    температура (20 ± 2) °С.

5

Искусственную морскую воду хранят в емкости из темного стекла с притертой крышкой (используют емкости до 10 дм³) при комнатной температуре не более года.

4.3.3 Проверка физиологической чувствительности тест-организмов

Периодически (не реже одного раза в месяц), а также непосредственно перед тестированием проб, тест-организмы (выклюнувшиеся науплии) проверяют на физиологическую чувствительность. Для этого определяют среднюю летальную концентрацию модельного токсиканта (72 ч ЛК₅₀) для тест-организмов, как указано ниже.

4.3.3.1    Готовят исходный раствор модельного токсиканта массовой концентрацией 1 г/дм³ следующим способом: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 1 г двухромовокислого калия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной (деионизированной) воды, доводят объем до метки, перемешивают и маркируют.

Срок хранения исходного раствора модельного токсиканта - не более 7 сут.

4.3.3.2    Готовят анализируемые растворы модельного токсиканта двухромовокислого калия массовой концентрацией от 1,0 до 10 мг/дм³ следующим способом: в пять мерных колб вместимостью 200 см³ вносят исходный раствор двухромовокислого калия массовой концентрацией 1 г/дм³ (см. 4.3.3.1) соответственно в первую колбу -0,2 см³, во вторую -0,5 см³, в третью - 1,0 см³, в четвертую -1,5 см³, в пятую -2,0 см³, доводят содержимое каждой колбы до метки морской водой (см. 4.2 или 4.3.2) и перемешивают. При этом массовая концентрация двухромовокислого калия в каждом растворе составляет соответственно 1,0; 2,0; 5,0; 7,5 и 10,0 мг/дм³.

Анализируемые растворы двухромовокислого калия каждой концентрации готовят непосредственно перед определением физиологической чувствительности тест-организмов.

В качестве контрольной пробы используют морскую воду (см. 4.2 или 4.3.2).

4.3.3.3    Проводят тестирование в течение 72 ч по 4.4 аналогично тестированию анализируемых проб. При этом используют не менее трех чашек Петри на каждую концентрацию анализируемого раствора (см. 4.3.3.2).

4.3.3.4    На основании полученных результатов определяют по 4.5 значение 72 ч ЛК₅₀ модельного токсиканта (двухромовокислого калия) для науплиев Artemia salina L.

При этом:

-    если значение 72 ч ЛК₅₀ указанного модельного токсиканта находится в диапазоне 6,5 - 8,0 мг/дм³, то используемые тест-организмы пригодны для тестирования;

-    если значение 72 ч ЛК₅₀ указанного модельного токсиканта не входит в указанный диапазон, то проверяют соблюдение правильности процедуры тестирования, условия подготовки тест-организмов к тестированию и, при необходимости, повторяют тестирование с использованием новыхтест-организмов, выращенных из новой партии яиц (см. приложение В).

Примечание - Значение 72 ч ЛК50 модельного токсиканта указывают в протоколе испытаний, имея в виду, что это значение в установленном диапазоне концентраций характеризует токсичность модельного токсиканта только для использованных тест-организмов, а также характеризует их физиологическую чувствительность, что позволяет проводить тестирование с использованием указанных тест-организмов.

4.3.3.5. Если в результате тестирования не удалось получить конкретное значение 72 ч ЛК₅₀, то для определения 72 ч ЛК₅₀ используют пробит-анализ. Пример приведен в приложении А.

4.3.4    Подготовка проб

Перед тестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы доводят до комнатной температуры (от 19 °С до 24 °С).

4.3.4.1 Подготовка исходных проб природной морской воды и воды эстуариев

Отобранные пробы природной морской воды и воды эстуариев фильтруют через мембранные фильтры с порами диаметром 3,5 мкм или через обеззоленные фильтры «белая лента».

Примечание - Мембранные фильтры перед применением должны быть промыты и простерилизованы кипячением в дистиллированной воде не менее 10 мин.

Не допускается для фильтрования использовать фильтр «синяя лента».

Примечание - Фильтр «синяя лента» задерживает коллоидные вещества, что занижает результаты тестирования.

6