МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

ГОСТ

31710-

2012

(ISO 8870:2006)

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МОЛОКА

Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

(ISO 8870:2006, MOD)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2013

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ    1.2—2009    «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты

межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» совместно с ГУ «Ярославская государственная испытательная лаборатория молочного сырья и продукции» на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. № 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MK (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Казахстан KZ Г осстандарт Республики Казахстан Кыргызстан KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Российская Федерация RU Росстандарт Таджикистан TJ Т аджикстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. № 1770-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31710-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5    Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 8870:2006 Milk and mik-based products — Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci (Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками) путем изменения отдельных фраз (слов, значений показателей, ссылок), которые выделены в тексте курсивом.

Степень соответствия — модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52832-2007

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок—в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты»

© Стандартинформ, 2013

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ 31710-2012

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Термины и определения..........................................1

4    Сущность метода.............................................1

5    Подготовка к испытанию.........................................1

6    Оборудование и лабораторная посуда..................................3

7    Отбор проб.................................................3

8    Проведение испытания..........................................3

9    Обработка результатов.........................................4

10    Протокол испытания...........................................5

III

ГОСТ 31710-2012 (ISO 8870:2006)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МОЛОКА

Обнаружение термонукпеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

Milk and milk-based products.

Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci

Дата введения —2013—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает качественный метод определения термонукпеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками в молоке и продуктах на основе молока.

Наличие в молоке и продуктах на основе молока термонукпеазы может использоваться как индикатор достижения роста стафилококков опасного уровня и может отражать вероятное присутствие стафилококкового энтеротоксина.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISO 7218—11 Микробиология продуктов питания и кормовых продуктов. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1    термонуклеаза (thermonuclease): Фермент, образуемый коагулазоположительными стафилококками, гидролизирующий дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) при условиях, описанных в настоящем стандарте.

4    Сущность метода

Метод основан на расщеплении ДНКтермонуклеазой, при котором цветагара изменяется с синего на розовый. Цветная реакция обусловлена метахроматическими свойствами толуидинового синего О.

5    Подготовка к испытанию

5.1    Основные материалы

Для текущей лабораторной практики см. ГОСТ 9225.

Издание официальное

Используют реактивы только аналитического качества, если не оговорено иначе, и только дистиллированную или деминерализованную воду, или воду аналогичной чистоты.

Если приготовленные среды и реактивы не используют немедленно, их хранят, если не оговорено иначе, в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С не более 1 мес в условиях, предотвращающих любые изменения в их составе.

5.2 Толуидиновый синий О-ДНК агар

5.2.1    Трис-буфер

5.2.1.1    Состав:

трис(гидроксиметил)аминометан (C^^NC^) — 6,06 г; хлорид кальция (СаС1₂) — 0, 11 г; вода —1000 см¹.

5.2.1.2    Приготовление

Растворяют трис(гидроксиметил)аминометан и хлорид кальция в 980 см¹ воды. Доводят pH до 9,0 и воду до 1000 см¹.

5.2.2    Основа среды

5.2.2.1    Состав:

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — 0,3 г; хлорид натрия (NaCI) —10,0 г; агар —10,0 г;

трис-буфер (см. 5.2.1) — 1000 см¹

5.2.2.2    Приготовление

Компоненты нагревают на водяной бане (см. 6.2) до полного растворения ДНК и агара (около 1,5ч).

5.2.3    Раствор толуидинового синего О

5.2.3.1    Состав:

толуидиновый синий О (C₁₅H₁₆N₃SCI)^a) — 0,31 г;

вода — 10 см¹.

5.2.3.2    Приготовление

Толуидиновый синий О растворяют в воде при слабом нагревании и фильтруют через марлю (см. 6.12).

5.2.4    Полная среда

5.2.4.1    Состав:

основа среды (см. 5.2.2) — 1000 с/и¹;

раствор толуидинового синего О (см. 5.2.3) — 3 см¹

5.2.4.2    Приготовление

Основу среды охлаждают до (50 ± 1) °С, добавляют профильтрованный раствор толуидинового синего О и перемешивают.

Полная среда может храниться маленькими порциями в закупоренных колбах или бутылях несколько месяцев в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С.

5.2.5    Приготовление чашек со средой

В чашки Петри (см. 6.8) вносят по 13 см¹ свежей полной среды (см. 5.2.4) или хранившейся среды, предварительно расплавленной при (50+ 1) °С. Дают агару застыть.

Приготовленные среды могут храниться не более 2 мес (дном кверху и защищенными от высыхания) в защищенном от света месте при температуре от 0 °С до 5 °С.

5.3    Соляная кислота, c(HCL) = 2 моль/<Эм¹.

5.4    Гидроокись натрия, c(NaOH) = 2 моль/0м¹.

5.5    Трихлоруксусная кислота, с(СС/₃СООН) = 3 моль/0м¹.

Растворяют 49,02 г трихлоруксусной кислоты в 100 см¹ воды.

5.6    Обезжиренное сухое молоко

Обезжиренное сухое молоко должно быть свободно от термонукпеазы. Наличие термонуклеазы проверяют в каждой новой партии, используя метод, приведенный в настоящем стандарте.

5.7    Бульон на основе сердечно-мозгового перевара (BHI бульон)

5.7.1 Состав:

ферментативный перевар животных тканей —10,0 г;

ГОСТ 31710-2012

обезвоженный перевар телячьего мозга — 12,5 г;

обезвоженный перевар бычьего сердца — 5,0 г;

глюкоза — 2,0 г;

хлорид натрия — 5,0 г;

моногидрофосфат натрия, безводный (Na₂HP0₄) — 2,5 г;

вода — 1000 см²

5.7.2 Приготовление

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают такой уровень pH, чтобы после стерилизации он соответствовал 7,4 + 0,2 при температуре 25 °С.

Среду разливают по 5 см² в пробирки (см. 6.11).

Среду стерилизуют при (121 ±1)° С в течение 15 мин.

5.8 Тест-микроб (положительный контроль)

В качестве положительного контроля используют любой штамм Staphylococcus aureus, образующий термонукпеазу.

6    Оборудование и лабораторная посуда

Используют оборудование, необходимое для подготовки проб согласно ГОСТ ISO 7218, обычное лабораторное оборудование, а также следующее:

6.1    Термостат, поддерживающий температуру (37 + 1) °С.

6.2    Водяная баня, поддерживающая температуру (50 ±1) °С, а также температуру кипячения (для разогрева и охлаждения питательных сред и реактивов до необходимой температуры).

6.3    Центрифуга с частотой вращения более 27 000 мин^-1.

6.4    Центрифуга с частотой вращения более 2 800 мин^-1.

6.5    Металлический цилиндрический пробойник диаметром около 2 мм для прорезания лунок в толуидиновом синем О-ДНК агаре.

6.6    Микропипетки емкостью 0,01 см².

6.7    Бактериологические петли из проволоки платино-иридиевого или никельхромового сплава диаметром около Змм.

6.8    Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, диаметром 90 и 100 мм.

6.9    Мерные цилиндры вместимостью 10, 100 и 1000 см².

6.10    Бутыли с пробками для хранения толуидинового синего О-ДНК агара.

6.11    Пробирки диаметром 15 мм и длиной 100 мм.

6.12    Марля.

При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Стеклянная лабораторная посуда должна выдерживать повторные циклы стерилизации и быть химически инертной.

7    Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуемым методом отбора проб является метод, приведенный в ГОСТ26809.

Образцы хранят в условиях, предотвращающих их порчу и любые изменения в составе.

8    Проведение испытания

Величину pH молока, восстановленного сухого молока или гомогенизированных продуктов на основе молока после добавки обезжиренного сухого молока доводят до 3,8 и центрифугируют. Супернатант осаждают трихлоруксусной кислотой. Центрифугируют, pH осадка доводят до pH 8,5 и добавляют трис-буфер. Раствор прогревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин и определяют наличие тер-монуклеазной активности на толуидиновом синем О-ДНК агаре.

8.1    Подготовка образцов

8.1.1    Молоко

pH пробы молока объемом 100 см³ доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

8.1.2    Продукты на основе молока

Суспензируют 20 г образца и 5 г обезжиренного сухого молока (см. 5.6) в 50 см³ воды. pH пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

Добавление обезжиренного сухого молока не является обязательным для всех продуктов на основе молока. При исследовании, например, сухого обезжиренного молока, цельного сухого молока или казеинов его можно не добавлять. Добавление обязательно в случае сухой сыворотки, йогурта, фруктового йогурта и фруктового мороженого. Для остальных продуктов на основе молока добавление обезжиренного сухого молока также рекомендуется.

Для испытания сыра можно использовать альтернативную процедуру. Суспензируют с помощью блендера 20 г сыра в 100 см³ теплой (45 °С) воды. После смешивания pH пробы доводят соляной кислотой (6 моль/л) до 4,5. Суспензию переносят в плоскодонную колбу объемом 750 см³. Добавляют воды до конечного объема, в 12,5 раза большего массы сыра. Суспензию встряхивают в течение ночи (16 ч) на водяной бане при температуре (25 ± 1) °С. Снова доводят pH до 4,5. Суспензию центрифугируют и фильтруют. Отбирают 100 см³ фильтрата и проводят испытание согласно 8.1.3.

Если сухое обезжиренное молоко не добавляется, суспензируют 20 г в 40 см³ воды. pH пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3,8.

8.1.3    Общий ход испытания

8.1.3.1    Центрифугируют (см. 6.3) пробу с частотой вращения от 27000 мин^-1 до 34000 мин^-1 при 5 °С в течение 20 мин.

8.1.3.2    Супернатант декантируют. Добавляют 0,05 см³ холодной трихлорацетоуксусной кислоты (см. 5.5) на 1 см³ пробы и смешивают.

8.1.3.3    Центрифугируют с частотой вращения от 27000 мин^-1 до 34000 мин^-1 при 5 °С в течение 20 мин.

8.1.3.4    Осадок растворяют в 1 см³ трис-буфера (см. 5.2.1). pH доводят до 8,5 с помощью гидроокиси натрия (см. 5.4). Раствор разводят трис-буфером до 2 см³, перемешивают.

8.1.3.5    Раствор прогревают в кипящей водной бане (см. 6.2) в течение 15 мин.

8.2 Приготовление тест-культуры (положительный контроль)

8.2.1    Тест-культуру (см. 5.8) засевают в бульон BHI (см. 5.7). Инкубируют 24 ч при (37± 1) °С. Центрифугируют (см. 6.4) с частотой вращения от 2800 мин^-1 до 3500 мин^-1 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость декантируют.

8.2.2    Супернатант прогревают на кипящей водяной бане (см. 6.2) в течение 15 мин. Прогретый супернатант может храниться при температуре 5 °С не более четырех недель.

При необходимости любой штамм Staphylococcus aureus (например, выделенный из молока или продуктов на основе молока) может быть исследован на наличие термонуклеазы методом, приведенным выше для тест-культуры.

8.3    Приготовление толуидинового синего О-ДНК агара

Цилиндрическим пробойником (см. 6.5) в агаре (см. 5.2.5) прорезают две лунки. Агар поверхностью вниз подсушивают в термостате (см. 6.1) со снятой крышкой и в течение 60 мин при температуре (37 ± 1) °С.

При испытании нескольких образцов в одном агаре прорезают до 10 лунок.

8.4    Определение термонуклеазы

8.4.1    В одну из лунок вносят 10 мм³ положительного контроля (см. 8.2.2), в остальные — по 10/им³ проб (см. 8.1.3.5).

8.4.2    Чашки Петри с крышками сверху инкубируют (см. 6.1) 4 ч при температуре (37 ±1)°С. При отрицательном результате чашки инкубируют до 24 ч.

9 Обработка результатов

Розовое гало (ореол или зона свечения) диаметром более 1 мм вокруг лунки свидетельствует о наличии термонуклеазы (необходимо сравнить с положительным контролем). Г ало любого иного цвета, кроме розового, не считается признаком термонуклеазной активности. ³

ГОСТ 31710-2012

Положительный тест на термонуклеазу указывает на рост коагулазоположительных стафилококков в количестве до 10⁴ КОЕ/г и более, что приводит к образованию энтеротоксина.

Такое количество коагулазоположительных стафиллококков может выработать энтеротоксин в концентрации, достаточной для развития заболевания. Молоко и продукты на основе молока, в которых при использовании настоящего метода испытаний выявлена термонуклеаза, образуемая коагулазоположительными стафилококками, в обязательном порядке подлежат проверке на наличие энтеротоксина.

10 Протокол испытания

В протоколе испытания указывают:

-    всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

-    метод отбора проб;

-    использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

-    все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте, или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

-    полученные результаты и повторяемость (если определялась), окончательный уточненный результат испытания. ⁵

УДК 637.544:006.354    МКС    67.100.01    Н09    MOD

Ключевые слова: молоко, продукты на основе молока, обнаружение термонуклеазы, коагулазоположительные стафилококки ⁴

Редактор Н.В. Таланова Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор И.А. Королева Компьютерная верстка Л.А. Круговой

Сдано в набор 22.04.2013. Подписано в печать 22.05.2013. Формат 60x84%. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,40. Уч.-изд. л. 0,75. Тираж 153 экз. Зак. 505.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

1

^а) Толуидиновый синий О (цветовой индекс: C.I. основной синий 17; C.I. No. 52040).

2

3

4

5