ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения содержания афлатоксинов Bi и Mi

Издание официальное

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ Минск

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН МТК93, Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овошссушильной промышленности (ВНИИКОП) и Институтом питания Академии медицинских наук Российской Федерации (ИП АМН РФ) и ТК 08 Кыргызской Республики, Кыргызским научно-исследовательским институтом профилактики и медицинской экологии

ВНЕСЕН Госстандартом России

2    ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

Наимсноваинс государства	Наименование национального органа по стандартганин
Азсрбайджанекая Рсспубли ка Республика Армения Республика Беларусь Грузия Республика Казахстан Кыргызская Республика Республика Молдова Российская Федерация Республика Таджикистан Туркменистан Республика Узбекистан Украина	Азгосстандарт Армгосстандарт Госстандарт Республики Беларусь Груэстандарт Госстандарт Республики Казахстан Кыргызстандарт М олдоваста н дарт Госстандарт России Таджнкстандарт Главгосслужба «Туркмснстандартлары» Узгосстандарт Госстандарт Украины

3    Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. № 296-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30711-2001 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта РФ с I июля 2002 г.

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 2001

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Госстандарта России

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Методы выявления и определения содержания афлатокеннов Bi и Mi

Food-stuffs.

Methods for detection and determination of aflatoxins B, and VI, content

Дата введения 2002—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает методы выявления и определения содержания афлатокеннов В, и М,.

2 Нормативные ссылки

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 1277-75 Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуд;» мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Анетон. Технические условия

ГОСТ 3652-69 Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Йод. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Толуол. Технические условия

ГОСТ 5848-73 Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 5955-75 Бензол. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 9411-91 Стекло оптическое цветное. Технические условия

ГОСТ 10455-80 1.4-Диоксан. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 22300-76 Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть I. Общие требования

И (длине официальное

3 Метол тонкослойной хроматографии

Метол основан на экстракции афлатоксинов В, и М, из пробы продукта, очистке экстракта от мешающих веществ и измерении массовой концентрации афлатоксинов В, и М, с помощью тонкослойной хроматографии при визуальном определении количества вещества в пятне.

Диапазон измеряемых содержаний афлатоксина В, во всех продуктах, кроме молочных: 0.003—0.02 мг/кг; в молочных продуктах: 0.0005—0,003 мг/кг; афлатоксина М, — 0,0005— 0.005 мг/кг.

3.1    Отбор и подготовка проб

Отбор проб и подготовка их к испытанию — по методам, указанным в нормативном документе на конкретную продукцию. При испытании зерновых, зернобобовых продуктов, орехов и концентратов с высоким содержанием жира, какао-бобов и шоколада среднюю пробу перед измельчением замораживают при температуре нс выше минус 10 *С.

Средние пробы орехов, зерна, зернобобовых, кондитерских изделий, какао-бобов, зерен кофе и листового чая измельчают до порошкообразного состояния, шоколад измельчают до получения однородной массы.

3.2    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивании 20 г не ниже 2-го класса точности.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 500 г не ниже 4-го класса точности.

Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 360 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания нс более I %; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима от 40 до 150 *С с температурной погрешностью ±5 *С.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения 4000 об/мин. стаканы центрифужные стеклянные вместимостью 200 см³.

Испаритель ротационный ИР 2М или аналогичный.

Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе мол. 833 или диагностическая лампа ОЛД 41. снабженные светофильтром УФС 1. УФС 2 или УФС 5 по ГОСТ 9411.

Аппарат дтя встряхивания проб типа АВУ-6С |1|

Баня водяная |2).

Электроплитка по ГОСТ 14919.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 с допускаемой погрешностью ±2 *С в диапазоне измерений 0—100 "С.

Микрошприц МШ-10 вместимостью 0.01 см⁵ (3).

Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 вместимостью 10. 100 и 250 см'.

Цилиндр по ГОСТ 1770 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 100 см³.

Пипетки по ГОСТ 29227 типа 3 исполнения I 1-го класса точности вместимостью 1 и 10 см³.

Воронка делительная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 250 см³.

Воронка лабораторная по ГОСТ 25336 типа В диаметром 56 мм и высотой 80 мм.

Колба плоскодонная по ГОСТ 25336 исполнения 2 вместимостью 250 см³.

Колба грушевидная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 100 см³.

Колб;з остродонная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25 см³.

Распылитель стеклянный с грушей.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 300 и внутренним диаметром 20 мм.

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по ГОСТ 12026.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Силикагель Л. 100—160 или 100—250 мкм. фирма «Лахема», Чехия.

Флоризил, 60—100 меш, фирма «Мерк», Германия.

Пластинки дтя тонкослойной хроматографии «Силуфол* 15x15 см, фирма «Кавалиер». Чехия.

Пластинка стеклянная 20 х 20 см.

Афлатоксин В, кристаллический, фирма «Ссрва», Германия.

Афлатоксин В, кристаллический, фирма «Серва», Германия.

2

ГОСТ 30711-2001

Афлатоксин \1| кристаллический, фирма «Серю». Германия.

Ацетон по ГОСТ 2603, ч. д. а.

Бензол по ГОСТ 5955, ч. д. а.

Ацетонитрил |4). ч.

Гексан |5|. ч.

Метанол-яд по ГОСТ 6905, ч.

Хлороформ технический по ГОСТ 20015.

Эфир этиловый технический (6).

1,4-Диоксан по ГОСТ 10455, ч. л. а.

Йод но ГОСТ 4159. х. ч., раствор в этиловом эфире массовой концентрации 100 г/дм¹.

Спирт изопропиловый |7|. ч. д. а.

Кислота азотная по ГОСТ 4461. ч. л. а., водный раствор 1:2.

Кислота лимонная 1 -водная по ГОСТ 3652. ч. д. а.

Кислота уксусная по ГОСТ 61. ч. д. а.

Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277, х. ч., раствор массовой концентрации 250 г/дм³.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, х. ч.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233. ч. д. а., растворы массовыми концентрациями 40 г/дм' и 100 г/дм³.

Свинец (II) уксуснокислый основной (8). ч.. раствор массовой концентрации 150 г/дм³.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, не уступающих перечисленным выше по метрологическим и техническим характеристикам.

3.3    Условия измерений

Температура и относительная влажность в лабораторном помещении при выполнении измерений нс должны превышать значений, оговоренных в нормативных документах на средства измерений, указанные в 3.2.

3.4    Подготовка к выполнению измерений

3.4.1    Подготовка растворителей

Все растворители квалификации «ч.» или «технический» перед использованием перегоняют, строго отбирая фракцию, соответствующую по температуре кипения основному веществу. Этиловый эфир перед перегонкой освобождают от перекисей общепринятыми методами.

3.4.2    Приготовление основных растворов афлатоксинов В_{ и В₂

I мг кристаллического афлатоксина В, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. В другу ю мерную колбу такой же вместимости количественно переносят 1 мг афлатоксина В,. В колбы вносят по 2 см³ ацетонитрила. Содержимое колб тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов афлатокеннов. после чего объем в колбах доводят до метки бензолом и содержимое колб вновь тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатокеннов в полученных основных растворах составляет около 10 мкг/см³. Основные растворы хранят в закрытых мерных колбах, плотно завернутых в алюминиевую фольгу, в холодильнике. Срок годности основных растворов афлатокеннов — 1 г.

Точную концентрацию афлатокеннов В, и В, в основных растворах определяют спсктрофото-мстрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность слоя раствор;! толщиной I см по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны 362 нм. В качестве контрольного раствора используют смесь бензол-ацетонитрил (98:2).

Массовую концентрацию афлатокеннов В, и В₂ в основных растворах с. мкг/см³, вычисляют по формуле

_ D А/1000    m

^С е/ ’

где D — оптическая плотность раствора:

М — молекулярная масса афлатоксина:

для афлатоксина В, М = 312.3 г/моль; для афлатоксина В₂ М = 314.3 г/моль: е — молярный показатель поглощения раствора афлатоксина в смеси бензол-анетонитрил (98:2) при длине волны 362 нм: для афлатоксина В, £ = 1,98 10⁴ дм³ моль^-1 см~'; для афлатоксина В₂ е = 2,09 IО⁴ дм³-маль^-|см^-1;

/— толщина слоя раствора, см.

3

3.4.3    Приготовтше рабочего раствора смеси анатоксинов Я, и В,

В мерную колбу вместимостью 100 см¹ пипеткой вносят 10,0 см' основного раствора афлаток-сина В, и 5,0 см¹ основного раствор;! афлатокемна В₂. Объем в колбе доводят до метки смесью бензола с ацетонитрилом (98:2 по объему). Содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксинов В, и В₂ в полученном рабочем растворе составляет около I мкг/см' и 0.5 мкг/см* соответственно. Точная концентрация афлатоксина В, в рабочем растворе соответствует его точной концентрации в основном растворе, деленной на фактор разведения 10. Рабочий раствор афлатоксинов В, и В, хранят в тех же условиях, что и основные растворы. Срок годности рабочего раствора афлатоксинов В, и В₂ — I г.

3.4.4    Пригото&1ение рабочего раствора афлатоксина А/,

Ампулу, полученную от фирмы-производителя и содержащую 0,01 мг афлатоксина М,. вскрывают. В ампулу вносят 1.0 см* ацетонитрила. Содержимое ампулы аккуратно перемешивают и переносят в мерную колбу вместимостью 10 см'. Остаток афлатоксина М, извлекают из ампулы двумя порциями бензола объемом по 1.0 см', каждый раз тщательно перемешивая содержимое ампулы и перенося его в ту же колбу. Объем содержимого в колбе доводят до метки бензолом. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксина М, в полученном рабочем растворе составляет 1.0 мкг/см'. Рабочий раствор афлатоксина М, хранят в тех же условиях, что и растворы афлатоксинов В, и В_;. Срок годности рабочего раствора афлатоксина М, — I г.

3.4.5    Приготов.1ение смешанного раствора мюристого натрия и лимонной кислоты

В мерную колбу вместимостью 500 см’ вносят 100 г хлористого натрия и 12 г лимонной кислоты. Содержимое колбы растворяют в небольшом количестве волы, после чего объем в колбе доводят водой до метки.

3.4.6    Подготовка флоришла

100 г флори зила помешают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 200 см' смеси гексан-уксусная кислота (99:1). Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин. после чего жидкость декантируют. Операцию повторяют еще 2 раза, каждый раз используя порции по 200 см¹ гексана. Флоризил высушивают на часовом стекле сначала в вытяжном шкафу при комнатной температуре до исчезновения запаха гексана, затем в сушильном шкафу при температуре 110 *С в течение 12 ч. После охлаждения флоризил переносят в плоскодонную колбу, куда вносят 10 см’ дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 60 мин. после чего флоризил переносят в герметично закрывающийся сосуд и выдерживают в закрытом состоянии в течение суток. Приготовленную порцию фдоризила используют в течение недели.

3.5 Выполнение измерений

3.5.1    Экстракция

3.5.1.1    Экстракция афлатоксина В, из зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов и концентратов

Навеску пробы массой 25.0 г помешают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 25 см' раствора хлорида натрия концентрацией 100 г/дм³. Содержимое колбы тщательно перемешивают, добиваясь равномерного смачивания пробы. В колбу с помощью микрошприца вносят 0.0125 см' основного раствора афлатоксина В₂, используемого в качестве внутреннего стандарта, и 100 см' ацетона. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. после чего содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 50 см' фильтрата.

3.5.1.2    Экстракция афлатоксина В, из плодовых и овощных консервов

Навеску пробы массой 25.0 г помешают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 25 см' раствора хлорида натрия концентрацией 100 г/дм'. Содержимое колбы тщательно перемешивают. В колбу с помощью микрошприпа вносят 0,0125 см' основного раствора афлатоксина В,, используемого в качестве внутреннего стандарта, и 100 см' ацетона. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³. Содержимое колбы доводят до метки смесью ацетон-вода (4:1). тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 100 см' фильтрата. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С приблизительно до половины объема.

3.5.1.3    Экстракция афлатоксина В, из какао-бобов, какао-порошка и шоколада

Навеску пробы массой 25,0 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 50 см' гексана. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 15 мин. выдерживают до полного осаждения нерастворимых в гексане веществ, после чего осторожно декантируют гексано-

4

ГОСТ 30711-2001

вый слой. Процедуру повторяют еше два раза аналогичным способом, каждый раз используя свежие порции гексана. Остатки гексана удаляют высушиванием в сушильном шкафу при 50 *С до исчезновения запаха растворителя.

К сухому остатку добавляют 0.010 см³ основного раствора афлатоксина В,, используемого в качестве внутреннего стандарта. 25 см' раствора азотнокислого серебра и 125 см' хлороформа. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего переносят в делительную воронку. После разделения фаз нижний хлороформный слой фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 75 см¹ фильтрата. Фильтрат переносят в плоскодонную колбу, куда добавляют 10 см ' раствора азотнокислого серебра. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин. после чего переносят в делительную воронку. После разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Процедуру повторяют, используя свежую порцию раствора азотнокислого серебра. Хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон. Отбирают 50 см’ фильтрата и упаривают его на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С приблизительно до половины объема.

3.5.1.4    Экстракция афлатоксина В, из кофе и чая

Навеску пробы массой 25.0 г помешают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 15 см³ воды и перемешивают содержимое до равномерного смачивания пробы. Туда же вносят 0.010 см³ основного раствора афлатоксина В_;. используемого в качестве внутреннего стандарта, и 125 см' хлороформа. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. после чего переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. После этого верхний водный слой отбрасывают и отбирают 50 см³ хлороформного экстракта.

3.5.1.5    Экстракция афлатоксина В, из растительных масел и афлатоксинов В, и М, из животных масел

Навеску пробы массой 15.0 г помещают в плоскодонную колбу, куда добавляют 0,0125 см' основного раствора афлатоксина В,, используемого в качестве внутреннего стандарта. 25 см³ гексана. 5 см¹ раствора хлорида натрия массовой концентрации 40 г/дм³ и 100 см³ ацетонитрила. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. затем переносят в делительную воронку. После разделения слоев гексановый слой отбрасывают.

3.5.1.6    Экстракция афлатоксинов В, и М, из молочных продуктов

Навеску натурального молока, кефира, сливок, ряженки, йогурта, простокваши массой 50,0 г, сухого молока массой 5.0 г. концентрированного молока, сыра и сметаны массой 25.0 г помешают в коническую колбу. К навеске концентрированного молока, сыра и сметаны добаатяют 25 см ' воды, к навеске сухого молока — 50 см' волы. Содержимое колбы доводят до температуры 35—38 *С на водяной бане, при этом добиваются растворения сухого молока и диспергирования сыра и кисломолочных продуктов. В колбу вносят 0.0125 см' основного раствора афлатоксина В_:. используемого в качестве внутреннего стандарта, 10 см ' предварительно подогретого до температуры 35—38 *С смешанного раствора хлорида натрия и лимонной кислоты массовыми концентрациями соответственно 200 и 24 г/дм³ и 100 см’ хлороформа, предварительно подогретого до той же температуры. Содержимое колбы встряхивают 5 мин. после чего переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. после чего верхний водный слой отбрасывают, хлороформный слой переносят в плоскодонную колбу и обезвоживают добавлен нем 10 г сернокислого натрия. Хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон в цилиндр вместимостью 100 см³, измеряют объем фильтрата. Фильтрат переносят в грушевидную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С. Остаток в колбе растворяют в I см' хлороформа.

3.5.2 Очистка экстракта

3.5.2.1 Очистка экстракта из зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов. плодоовощных консервов и концентратов

Водно-аиетоновый экстракт переносят в мерную колбу вместимостью 100 см'. В колбу вносят 20 см' раствора уксуснокислого свинца. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают, после чего фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 80 см' фильтрата. Фильтрат переносят в делительную воронку, куда добаатяют 30 см' гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение I мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Процедуру повторяют, используя свежую порцию гексана и отбрасывая гексановый слой после разделения фаз.

К оставшемуся в делительной воронке водно-ацетоновому слою добаатяют 40 см’ хлороформа. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение I мин. После разделения фаз нижний хлороформный СЛОЙ переносят в плоскодонную колбу. Экстрагирование остатков афлатоксинов из

5

волно-аистоновой фазы проводят ешс 2 рам. каждый раз используя по 30 см³ смеси хлороформ-ацетон (3:1). Объединенные хлороформные экстракты обезвоживают в плоскодонной колбе, добавляя 10 г безводного сульфата натрия и выдерживая содержимое в течение 30 мин в темноте. После обезвоживания экстракт по частям фильтруют через ватный тампон в остродонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С. Оставшийся сернокислый натрий промывают 15 см' хлороформа, смыв добааляют к фильтрату'. Содержимое отгонной колбы упаривают досуха. Остаток псрсрастворяют в 0.4 см' смеси бензол-ацетонитрил (98:2) и используют для хроматографического анализа.

3.5.2.2    Очистка экстракта из какао-бобов, какао-порошка и шоколада

Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии, для чего на дно стеклянной колонки помешают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и 10 г силикагеля, суспендированного в 30 см⁵ хлороформа. Нс позволяя просохнуть верхней кромке слоя силикагеля, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Хлороформу лают стечь до поверхности слоя сернокислого натрия, после чего через колонку последовательно пропускают 150 см³ гексана и 150 см³ этилового эфира. Элюат отбрасывают. В колонку вносят 150 см' смеси хлороформ-меганал (97:3) и с этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной калбе на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0.4 см' смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и испальзуют для хроматографического анализа.

3.5.2.3    Очистка экстракта из кофе и чая

Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки помещают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и 5 г флоризила, суспендированного в 20 см' хлороформа. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя флоризила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Хлороформу дают стечь до поверхности слоя сернокислого натрия, после чего через колонку пропускают 150 см' диоксана. Элюат отбрасывают. В колонку вносят 100 см' смеси ацетон-метанол (9:1). С этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35—40 ‘С досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0.4 см' смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

3.5.2.4    Очистка экстракта из растительных масел

Ацетонитрильный экстракт обезжиривают гексаном, предварительно насыщенным ацетонитрилом. Для этого 160 см³ гексана встряхивают в делительной воронке с 10 см’ ацетонитрила. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отбрасывают.

Ацетонитрильный экстракт из пробы масла переносят в делительную воронку, куда добавляют 50 см' гексана, насыщенного ацетонитрилом. Содержимое воронки встряхивают в течение I мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Обезжиривание экстракта повторяют еще два раза в аналогичных условиях, каждый раз используя свежую порцию гексана, насыщенного ацетонитрилом. Обезжиренный ацетонитрильный экстракт обезвоживают добавлением 10 г сернокислого натрия и выдерживанием в темноте в течение 30 мин.

Экстракт фильтруют через ватный тампон в грушевидную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40—45 *С. Остаток в отгонной колбе растворяют в 2 см' хюроформа и проводят его очистку с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки помешают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и суспензию 4 г силикагеля в 20 см' бензола. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя силикагеля, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Экстракту дают полностью впитаться в фильтрующий слой, после чего в колонку вносят 100 см ' смеси бенэол-гсксан-этиловый эфир (1:1:2). Растворителю дают полностью пройти через колонку, элюат отбрасывают. В колонку вносят 100 см' смеси хлороформ-ацетон (9:1), с этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной катбе на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0.4 см' смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

3.5.2.5    Очистка экстракта из молочных продуктов (включая животное масло)

Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии. Для этого готовят колонку по 3.5.2.4, используя при этом 2 г силикагеля. В колонку вносит экстракт и дают ему полностью

ГОСТ 30711-2001

впитаться в фильтрующий слой. После этого проводят последовательное элюирование следующими смесями растворителей порциями по 25 см':

-    толуол-уксусная кислота (9.5:0.5);

-    гексан;

-    этиловый эфир-гексан-ацетонитрил (5:3:0.5).

Элюаты отбрасывают. В колонку вносят 60 см³ смеси хлороформ-ацетон (4:1). с этого момента начинают отбирать выходящий элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35—40 *С досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0.2 см³ смеси бенэол-анстонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

3.5.3    Качественное определение аф.штоксинов 5, и М,

На пластинку «Силуфол» сверху и снизу наносят две тонкие карандашные линии на расстоянии

1.5 см от краев. На нижней (стартовой) линии отмечают 3 точки на расстоянии 2 см друг от друга, в которые наносят с помощью микрошприна по 0,002. 0.005 и 0.01 см' рабочего раствора смеси афлатоксинов В, и В,. При испытании молочных продуктов в эти же точки наносят дополнительно по 0.002. 0.005 и 0.01 см' рабочего раствора афлатоксина М,. На расстоянии 1 см между пятнами рабочих растворов наносят 0.01 и 0.02 см' исследуемого раствора. Пластинку стартовой линией вниз помещают в хроматографическую камеру, предварительно заполненную смесью этиловый эфир-ме-танол-вода (94:4.5:1.5) (при испытании молочных продуктов — этиловый эфи р- мета пол-вода (90:8:2)). Развитие хроматограммы проводят до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии.

Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 мин и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете. На хроматограмме рабочего раствора смеси афлатоксинов последние располагаются по направлению движения фронта растворителя в следующем порядке: М,. В,. В,. Обнаружение на хроматограммах экстракта пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флюоресценции пятнам афлатоксинов В, и М, из рабочих растворов, свидетельствует о возможном наличии этих афлатоксинов в пищевом продукте. Обнаружение на хроматограммах экстракта пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флюоресценции пятнам афлатоксина В,, свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из пробы.

Для подтверждения присутствия афлатоксинов В, и М, используют любой из следующих тестов.

По первому тесту пластинку опрыскивают из распылителя раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают се в ультрафиолетовом свете. Если цвет флюоресценции пятен на хроматограммах афлатоксинов изменился с синего на желтый, а цвет флюоресценции соответствующих пятен на хроматограммах экстракта не изменился, то афлатоксин в пробе отсутствует. Если же цвет флюоресценции соответствующих пятен на хроматограммах экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пробе.

По второму тесту на стеклянную пластинку 20x20 см наносят 2—4 см ’ раствора йода в этиловом эфире, распределяют его по всей поверхности и дают эфиру испариться. Над хроматографической пластинкой на расстоянии 0,5—1.0 см помещают пластинку с тонким слоем йода и подвергают се воздействию паров йода в течение 1—2 мин. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете. Сохранение цвета и интенсивности флюоресценции пятен стандартов и соответствующих нм пятен экстр;!кта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в пробе продукта.

3.5.4    Количественное онре<кление афлатоксинов B_t и М,

Пластинку «Силуфол* размечают тонкими карандашными линиями в соответствии с рисунком 1. В точку 1 микрошприцем наносят 0.020 см' исследуемого раствора. В точку 2 наносят 0,005 см', в точки 3, 4 и 5 соответственно 0,002. 0.004 и 0.006 см' рабочего раствора смеси афлатоксинов В, и В,. При испытании молочных продуктов дополнительно наносят рабочий раствор афлатоксина М, в тех же количествах и в те же точки, что и рабочий раствор смеси афлатоксинов В, и В₂. Массу афлатоксинов В, и М, т_ш% нг, нанесенную в каждую точку, рассчитывают по формуле

т_а - с К1000,    (2)

где с — концентрация афлатоксина в рабочем растворе, мкг/см';

V — объем рабочего раствора афлатоксина. нанесенный в точку на пластинке, см'.

7

Хроматографическую камеру заполняют смесью эфир-метанол-вода (94:4.5:1.5) (при испытании молочных продуктов — (90:8:2)). Пластинку помешают в камеру для развития хроматограммы в первом направлении до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии.

Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. затем развитие хроматограммы проводят во втором направлении в системе хлороформ -анетол (9:1) (при испытании молочных продуктов — хлороформ-ацетон-изопропило-вый спирт (85:10:5)). После достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете.

Обнаружение афлатоксинов В, и М, проводят аналогично 3.5.3. В случае подтверждения присутствия афлатоксинов В, и М, в пробе их количественно определяют. сравнивая интенсивность фпоо-рсспснции пятен афлатоксинов в пробе и пятен из рабочего раствора афлатоксинов. Если интенсивность флюоресценции пятен афлатоксинов в исследуемом растворе выше интенсивности фиоорс-сисннии пятен, соответствующих 0.006 см' рабочего раствор;! смеси афлатоксинов. проводят повторное хроматографическое разделение. В этом случае на пластинку наносят меньшее количество исслсдусмого раствора.

3.6 Обработка результатов измерений

3.6.1 Содержание афлатоксина В,. Х_х, мг/кг, для зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов, плодоовощных консервов и концентратов вычисляют по формуле

где /и, — масса афлатоксина В,, обнаруженная в пятне пробы, нг;

У, — общий объем водно-ацетонового экстракта (при испытании зерновых, зернобобовых и хлебопродуктов — суммарный объем добавленных растворов хлорида натрия и ацетона). см';

Г, — объем водно-ацетонового экстракта после прибавления к нему раствора а пега та свинца и волы, см³;

Г₅ — объем, до которою сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, см³;

К — коэффициент извлечения афлатоксина В, по таблице 1;

т — масса навески пробы, г;

V, — объем водно-ацетонового фильтрата, взятый на анализ, см';

— объем водно-ацетонового фильтрата после очистки ацетатом свимна. взятый на анализ, см³;

У_ь — объем экстракта, нанесенный на пластинку, см³.

3.6.2 Содержание афлатоксина В,. Х₂. мг/кг, для кофе. чая и какао вычисляют по формуле