ОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДОВ PROTEUS, MORGANELLA, PROVIDENC1A

И здание официальное

Москва

Стандартмнформ

2010

УДК 663/.664.001.4:006.354    Группа    Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providcncia

Food products. Method for detection of bacteria of Proteus. Morganella. Providcncia genera

MKC 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введения 01.07.91

Настоящий стандарт распространяется на пишеные продукты и устанавливает метод выявлении бактерий родов Proteus. Morganella. Providencia.

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36 ± 1) ’С в течение 48 ч. последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36 ± I) 'С в течение 48 ч. выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.

I. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб — по ГОСТ 26668. подготовка к испытанию — по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104*, с наибольшим предедом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ± 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до I кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический или импортный с аналогичными техническими характеристиками;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 *С. позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 *С; холодильник бытовой; стерилизатор горячим воздухом; адонит: мальтоза;

метил бутанол (амиловый спирт); мочевина;

• С I июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104— 2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228—200Х.

Перепечатка носи решена

© Издательство стандартов. 1990 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

С. 2 ГОСТ 28560-90

нейтральный красный; натрия деэоксихолаг, натрия тиосу;н>фат (NaiSiOySlbO); натрий аммония фосфат:

полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250 ООО ЕД и по 50 мг (500 000 ЕД); полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;

L — или DL-фенилаланин;

L — или DL-орнитин; феноловый красный;

желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;

железа (III) цитрат:

железо хлорное (FcCl y6HiO)

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1.    Приготовление растворов

3.1.1.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм⁵: 1.6 г бром тимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см⁵ и растворяют в этиловом спирте с массовой долей % %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.2.    Раствор массовой концентрацией мочевины 500 г/дм⁵: 50 г мочевины переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде, раствор доливают до метки.

3.1.3.    Щелочной раствор фенолового красного массовой концентрацией 16 г/дм': 1.6 г фенолового красного растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см' в растворе гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм'. Раствор доливают раствором гидроксида натрия до метки.

3.1.4.    Раствор хлорного железа массовой концентрацией ИХ) г/дм . 16.6 г (FeCly6lbO) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в диет и. и про ван ной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.5.    Раствор гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм³: 10 г гидроксида натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор долива ют до метки.

3.1.6.    Раствор кристаллического фиолетового массовой концентрацией I г/дм': 0.1 г криста.ыи-ческого фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.7.    Раствор для среды агара-дезоксихолат-цитрат лактозного: 17.0 г натрия лимоннокислого.

1.0 г натрия тиосульфата, 2.0 г железа (III) цитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± I) *С в течение I ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

3.1.8.    Раствор дезоксихолата натрия массовой концентрацией 100 г/дм': 10 гдезокенхолата натрия переносят в мерную колбу вместимостью 1 (К) см', растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± 1) *С в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 мес.

3.1.9.    Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см' стерильной дистиллированной воды.

3.1.10.    Реактивы для определения индола:

Реактив Ковача: 5.0 г парадиметилам инобензальдегнда растворяют в 75 см ' метил бутанола и добавляют 25 см’ концентрированной соляной кислоты (р = 1,18—1.19 г/см⁵).

Реактив Эрлиха: 4.0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 380 см' этилового спирта с массовой долей 96 % и добавляют 80 см' концентрированной соляной кислоты (р = 1,18 — 1.19 г/см'). Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4 ± 2) *С не более 1 мес.

3.1.11.    Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12.    Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм³: I г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см * и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

78

ГОСТ 28560-90 С. 3

3.2.2.    Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.3.    Среда жидкая селективная. Основ;» среды: к 1 дм³ мясо-неитонного бульона по и. 3.2.2 добавляют 1.0 г маннита. 50.0 см³ натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи. 0.8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2.0 см³ раствора кристаллического фиолетового, приготовленного но и. 3.1.6. 2,0 см³ спиртового раствора бромтиматового синего, приготовленного но п. 3.1.1. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6.9 ±0.1) при 25 'С. Стерилизуют текучим паром при 100 *С в течение 15 мин.

Для приготовления среды к основе добавляют асептически 10.0 см¹ раствора мочевины, приготовленного по п. 3.1.2. и 100 000 ЕД полимиксина В сульфата или 120 000 ЕД иолнмиксина М сульфата. Среду рахшвают в стерильные пробирки но 5 см³. Хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.

3.2.4.    Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.

Основа среды: в I дм¹ кипяшей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1. растворяют

5.0    г пептона. 10.0 г лактозы. 22.5 г агара, охлаждают до (45—50) *С. устанавливают pH таким образом, чтобы при 25 *С он составлял (7.4 ± 0.1). Прибавляют 0.03 г нейтрального красного, рахшвают в мерные колбы, стерилизуют при (115 ± 1) 'С в течение 20 мин. Хранят при (4 ± 2) 'С не более 7 сут.

Допускается использовать вместо 1 дм³ мясной воды и 5.0 г пептона 1 дм³ мясо-пептонного бульона, приготовленного по и. 3.2.2.

Для пригото&тенпя питательной среды к расплавленной и охлажденной до 45—50 *С основе прибавляют из расчета на 100 см³ основы 5 см³ раствора солей, приготовленных по и. 3.1.7. и 5 см³ раствора дезоксихолата натрия, приготовленного по п. 3.1.8. Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри по ГОСТ 26670. Среду используют в день ее приготовления.

3.2.5.    Агар тройной сахарный с цитратом железа: в I дм¹ мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 растворяют при нагревании 15 см¹ дрожжевого экстракта, 10,0 г пептона. 10.0 г лактозы. 10.0 г сахарозы. 1,0 г глюкозы. 0.3 г железа (III) цитрата. 0.3 г натрия тиосульфата. 0.024 г фенолового красного. 15.0 гагара. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 *С (7.4 ±0.1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121 ± 1)*Свтсченис 10 мин. дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2.5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2.6.    Среда для расщепления фенилаланина: 15 см³ дрожжевого экстракта, 2.0 г Ш.-фенилаланина или 1.0 г /.-фенилаланина, 1.0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного. 5,0 г натрия хлорида. 12.0 гагара растворяют в 1 дм³ кипящей дистиллированной воды. По 5 см³ среды рахшвают в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) *С 10 мин. дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4 ± 2) 'С не более 7 сут.

3.2.7.    Агар с цитратом: 0.2 г магния сульфата. 1.0 г однохтмешеиного фосфорнокислого аммония,

1.0    г натрия аммония фосфата. 2,0 г трехосновного натрия лимоннокислого, 5,0 г натрия хлорида,

0.08 г бромтимолового синего, 15,0 г агара растворяют в I дм³ кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилихшии он составлял при 25 *С (7.0 ± 0.1). Стерилизуют при (121 ± I) 'С в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зеленую окраску, ее хранят при комнатной температуре не батее 7 сут.

3.2.8.    Aiap дифференциально-диагностический: к 1 дм³ расплавленного мясо-пептонного агара по п. 3.2.1 добавляют 15.0 см¹ дрожжевого экстракта. 10,0 г маннита. 10,0 г мальтозы, 80.0 см³ натурать-ной бычьей желчи или эквива1енгное количество сухой желчи. 2.0 г железа (III) цитрата. 0.5 г натрия тиосульфата, 0.5 см³ раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6. 2.0 ем³ щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п. 3.1.3. раствор антибиотика, приготовленного по н. 3.1.9 и содержащего 120 000 ЕД полимиксина М сульфата или 100 000 ЕД полимик-син В сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 ’С) в течение 15 мин и разливают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.

3.2.9.    Трипгон- гриптофановая среда (Ljutov): 10.0 г тритона или пептона. 5.0 г натрия хлорида,

1.0    г /)/.-триптофана или 0.5 г /.-триптофана растворяют в 1 дм³ кипящей дистиллированной воды и фильтруют, устанавливают pH так. чтобы после стерилихшии он составлял при 25 ’С (7.5 ±0.1). Среду рахшвают по 5 см³ в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.

79

С. 4 ГОСТ 28560-90

3.2.10. Среда для определения декарбоксилазы орнитина:

в I дм³ дистиллированной воды растворяют при ншреванип 5.0 г /.-орнитина или 10.0 г /)/.-орнитина. 15,0 см³ дрожжевого экстракта. 1.0 г глюкозы. 1.2 см³ раствора бром к ре зол о во го пурпурного, приготовленного по и. 3.1.12. Устанавливают pH таким образом, чтобы ноете стерилизации он составлял при 25 *С (6,8 ± 0.1). Среду рахшвают в пробирки но 5 см’ и стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 10 мин. Хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.

4. ПРОВИДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.

4.2.    Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1.0 см ’ в жидкую селективную среду по и. 3.2.3. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч.

4.3.    Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бакзерий. расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выя&шемых бактерий.

4.4.    Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помугненне среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п. 3.2.4 или но и. 3.2.8. таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.

Посевы инкубируют при (36 ± 1) *С в течение 48 ч.

4.5.    На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой (]юрмы диаметром 1—3 мм. Бактерии рода Proteus обладают свойовом роения (ползучим ростом).

4.6.    Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний дли выделения чистых культур и дальнейшего изучении.

Д|и получения чистых культур используют скошенный в пробирке мисо-петонный агар по п. 3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 24 ч.

4.7.    Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia.

4.7.1.    Для определения наличия дезаминазы фенилаланина из 24-часовой культуры но п. 4.6 делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара, приготовленного по п. 3.2.6. и культивируют при (36 ± I) ’С в течение 48 ч. после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3—5 капель раствора хлорного железа, приготовленного но п. 3.1.4. При этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.

Бактерии родов Proteus, Morganella. Providencia дают положительную реакцию.

4.7.2.    Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности аглризо ванной среды, приготовленной по п.3.2.5.

Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.

Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут. так как P.niyxofaciens может образовывать сероводород на 3-и — 4-е сутки. Бактерии рода Morganella и Providencia сероводорода не образуют.

4.7.3.    Для определения способности утилизировать цитрат культуры, не образующие сероводород по н. 4.7.2, пересевают на поверхность скошенного агара, приготовлеиного но и. 3.2.7. Посевы инкубируют при (36 ± I) 'С в течение 48 ч. Окрашивание среды в синий цвет — положительная реакция, отсутствие изменения— отрицательная реакция.

Бактерии рода Providencia утилизируют цитрат, бактерии рода Morganella не утилизируют цитрат.

80

ГОСТ 28560-90 С. 5

4.8. Для дифференцирования видов P.vulgaris и P.mirabilis у культур, образующих серо!юдород по и. 4.7.2. проводят определение наличия декарбоксилазы орнитнна и способности образовывать индол.

4.8.1.    Для определения способности образовывать индол выделенные культуры высевают в триптон-триптофановую среду, приготовленную но и. 3.2.9. Посевы инкубируют при (36 ± 1) 'С в течение 48 ч. После инкубирования добавляют 1 см’ реактива Ковача или Эрлиха, приготовленных по н. 3.1.10. Темно-красное кольцо свидетельствует о положительной реакции.

P.vulgaris образует индол. P.mirabilis и P.myxofaciens индола не образуют.

4.8.2.    Для определения наличия декарбоксилазы орнитнна выделенные культуры высевают в среду, приготовленную по и. 3.2.10. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. Положительной реакцией считают помутнение среды и изменение ее цвета в фиолетовый.

P.mirabilis дает положительную реакцию. P.vulgaris P.myxofaciens — отрицательную.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1.    Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, то их относят к бактериям родов Proteus. Morganella. Providencia.

5.2.1.    Результаты испытания записывают следующим образом: фенилдезаминируюшие бактерии родов Proteus. Morganella. Providencia обнаружены или не обнаружены.

5.3.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин и образующие сероводород, то их относят к бактериям рода Proteus.

Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Providencia.

Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, не утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Morganella.

5.3.1.    Результаты испытания записывают следующим образом: бактерии родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia обнаружены или не обнаружены.

5.4.    Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород и индол, не декарбоксилизируюшие орни-тин. то их относят к бактериям вида P.vulgaris.

Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород, не образующие индол, декарбоксилируюшие орнитин. то их относят к бактериям вида P.mirabilis.

5.4.1.    Результаты испытания записывают следующим образом:

бактерии видов P.vulgaris и (или) P.mirabilis обнаружены или нс обнаружены.

5.5.    При записи результатов испытания указывают навеску продукта, в котором обнаружены или не обнаружены выявляемые микроорганизмы.

81

С. 6 ГОСТ 28560-90

ИНФОРМАЦИОННЫ К ДАННЫ К

I. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощееушильной промышленное!и

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР но управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 № 1277

3.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУ МЕНТЫ

Обозначение НТД. на который дана ссылка	Номер раздела, пункта
ГОСТ 10444.1-84	2. 3.1.11, 3.2.1. 3.2.2
ГОСТ 24104 - 88	2
ГОСТ 26668 -85	1
ГОСТ 26669 - 85	1. 5.1
ГОСТ 26670-91	3.2.4. 3.2.8

5.    Ограничение срока действия снято по протокату № 5—94 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (МУС 11-12—94)

6.    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

82