ГОСТ 25723-83
Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики контагиозного пустулезного дерматита

&5МЗ-ЛЗ

-f

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КОНТАГИОЗНОГО ПУСТУЛЕЗНОГО ДЕРМАТИТА

ГОСТ 25723-83 (СТ СЭВ 3455-81)

Издание официальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ Москва

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

В в. Гумриков. 6. И. Скапииекмй, Б. Г. Степаиям. Н. Д. Нвсокима

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии А. Д. Третьяков

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 14 апреля 1983 г. № 1840

УДК 63«:576.8.07:00«.3S4    Группа    С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики контагиозного    I    Uv    I

пустулезного дерматита

Agricultural animals. Methods of laboratory    аЭ/Z О О О

diagnostics for contagions pustulosious dermatitis

ICT СЭВ 3455—81)

ОКСТУ Ш9

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 14 апреля 1983 г. М? 1840 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07.89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется ка овец и коз и устанавливает методы лабораторной диагностики контагиозного пустулезного дерматита, вызванного вирусом из группы оспы (семейства Poxviridae), который по структуре вирионов, антигенным и иммуногенкым свойствам отличается от вирусов оспы овец и коз.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3455- -81.

1. МЕТОД ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в идентификации вируса контагиозного пустулезного депмятита овец и коз в электронном микроскопе по ультраструктуре вирнонов. выявляемой при негативном контрастировании диагностических препаратов.

1.1. Метод отбора проб

1.1.1 Для электронномикроскопическнх исследований берут в стерильные пробирки от 3—4 больных овец или коз корочки г оспоподобных поражений уголков губ. вымени, пахз.

Перепечатка яоспрещена

@ Издательство станяартоп, 1983

Стр. 2 ГОСТ 25723-83

У убитых на б— 9-й день болезни животных срезают острым лезвием участки кожи размером 2x2 см со свежими оспоподобными поражениями и консервируют в 50%-ном растворе стерильного глицерина.

Взятый материал отправляют в лабораторию электронной микроскопии, вирусологии, патологической анатомии.

1.2.    Аппаратура, материалы и реактивы

1.2.1.    Для проведения исследования применяют:

микроскоп электронный с разрешающей способностью

<5±1) А;

устройство напыляющее;

сеточки электронно-микроскопические, покрытые нитроцеллюлозной пленкой, укрепленной углеродом; пинцет глазной с заостренными концами; пенал для сеточек

скальпели и ножи медицинские по ГОСТ 21240-77; ножницы изогнутые;

пинцеты медицинские по ГОСТ 21241-77; пробирки бактериологические стеклянные вместимостью 20 см³ по ГОСТ 10515-75;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72; натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77;

кислоту фосфорно-вольфрамовую по ГОСТ 18290-72, 2%-ный раствор, нейтрализованный раствором гидроокиси натрия до pH 7,2;

глицерин по ГОСТ 6259-75. 50%-ный стерильный раствор.

1.3.    Подготовка к исследованию

1.3.1.    Кусочки корочек и участков пораженной кожи помещают на предметное стекло в 2—3 капли дистиллированной воды и размельчают в течение 3—20 мин острым, затем тупым концом глазного скальпеля. На поверхность мениска опалес-цирующей суспензии накладывают пленкой на 2 мин пять сеточек, которые промывают 2—3 каплями дистиллированной воды.

1.3.2.    Для негативного контрастирования на свежеприготовленные препараты наносят несколько капель 2%-ного раствора фосфорно-вольфрамового натрия, который затем осторожно отсасывают фильтровальной бумагой.

1.4.    Проведение исследования

1.4.1.    Подготовленные по п. 1.3 сеточки с препаратом просматривают в электронном микроскопе.

1.5.    Обработка результатов

1.5.1.    Диагноз на контагиозный пустулезный дерматит овец и коз считается положительным при наличии в препаратах характерных вирионов коконовндной формы размером 150Х200--

ГОСТ 2572Э—8J Стр. 3

224X380 jim, белковая оболочка которых образована непрерыв-нымн, идущими наискось трубчатыми фнламентамн диаметром

о

90 А .укладывающимися подлине вириоков 10—14 раз.

1.5.2. При отсутствии в препаратах вирионов ставят биопробу на восприимчивых животных по п. 4.3, используя оставшийся патологический материал, и проводят повторные электронно-микроскопические исследования.

2. МЕТОД ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается п обнаружении под микроскопом изменений ткани кожи и слизистых оболочек, характерных для контагиозного пустулезного дерматита.

2.1.    Метод отбора проб

2.1.1.    Для гистологических исследований берут корочки к пораженные участки кожи и слизистых оболочек. Пробы, фиксированные в 10%-ном растворе фор-малнна, доставляют в ла* бораторню патологической анатомии.

2.2. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.    Для проведения исследования применяют: микротом санный;

микроскоп биологический; термостат;

ванну стеклянную для окрашивания срезов; стунку;

иглу препаровальную металлическую или стеклянную; стекла предметные по ГОСТ 9284-75; стекла покровные по ГОСТ 6672-75; чашки Петрн по ГОСТ 25336-82;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 6259-75, абсолютный, 96%-нын и 70%-ный; белок яичный; эозин водорастворимый; эозин спирторастворимый;

калий йодистый по ГОСТ 4232-74 или натрий йодистый по ГОСТ 8422-76;

квасцы калийные по ГОСТ 15028-77, х. ч.; хлоралгидрат;

кислоту лимонную кристаллическую по ГОСТ 3652-69; гематокенлни кристаллический; бальзам канадский или другие заливочные смеси; парафин по ГОСТ 23683-79, точка плавления 58 °С; раствор гематоксилина красящий (кислый гематенп по прописи Майера); готовят следующим образом: 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в I дм¹ дистиллированной воны, прибавляют 0,2 г йодистого калия или йодистого натрня, 50 г ка-

Стр. 4 ГОСТ 2S7JJ-83

лийных квасцов, 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лныошюй кислоты, раствор фильтруют;

эозин, водно-спиртовой ряствор, готовят следующим образом: 1 г водорастворимого эозина растворяют в 100 см³ дистиллированной воли Затем I г спирторастворимого эозина растворяют в 100 см³ 96%-ного этилового спирта; красящий раствор составляют, смешивая 3 части водного раствора эозина с I частью спиртового раствора эозина;

карбол-ксилол; готовят из расчета:    одна часть химически

чистой кристаллической карболовой кислоты на 4—5 частей ксилола. Карболовую кислоту предварительно расплавляют в термостате (для парафиновой заливки) при температуре 4*2°С и смешивают с ксилолом в теплой посуде; смесь спирто-эфирная (1:1); формалин по ГОСТ 1625-75, 10%-ный раствор; глицерин по ГОСТ 6259-75.

2.3.    Подготовка к исследованию

2.3.1. Отобранные пробы пораженных тканей размером IXI см фиксируют в 10-кратном количестве 10%-ного раствора формалина при комнатной температуре в течение 18—20 ч.

Для сокращения времени исследования выдерживают пробы в термостате при температуре 56 °С.

2.3.2 Приготовляют на микротоме из фиксированных кусочков пробы срезы толщиной примерно 5—10 мк, которые помещают в чашки Петри с дистиллированной водой. Затем срезы из дистиллированной воды переносят препаровальной иглой в 70%-ный этиловый спирт на 2—5 мни, далее на предметные стекла, покрытые смесью глицерина н яичного белка (1:2). и высушивают. Для окраски срезов высушенные предметные стекла со срезами помещают последовательно на 3 мни в 96%-ный этиловый спирт, на 3 мин в 70%-ный спирт, на 3 мин в дистиллированную воду, на Ю мин в красящий раствор гематоксилина. на 3—5 мин в водопроводную воду, на I мин в дистиллированную воду, на 4 мин в красящий раствор эозина, на I мин в 70%-ный этиловый спирт, на I мин в 96%-ный спирт, на 1 мин в абсолютный спирт, осветляют карбол-кенло-лом, затем ксилолом, наносят каплю канадского бальзама, разведенного ацетоном до вязкости меда, и покрывают покровным стеклом. Покровное стекло опускают осторожно, придерживая правое его ребро препаровальной иглой, так как при быстром накладывании под стекло могут попасть пузырьки воздуха.

2.4.    П ров еден не исследования”

2.4.1. Подготовленные срезы просматривают под микроскопом, определяя общую структуру исследуемых проб ткани, характер и интенсивность (выраженность) патогнстологнчес-ких изменении.

ГОСТ JJ72J—83 Стр. 5

2.5. Обработка результатов

2.5.1.    При острой форме заболевания в измененных участках кожи и эпителия отмечают ретикулярную и баллотирующую дистрофию клеток; позже в межклеточных пространствах развиваются небольшие полости. В субэпнтелиальной соединительной ткани обнаруживают дилатаиню сосудов и лнмфогне-тиоиитзрную клеточную инфнльтраиию. Иногда в этой стадии заболевания в клетках измененных участков эпителия обнаруживают цитоплазматические ацидофильные включения.

При подострых и хронических формах заболевания пораженные кожные покровы или участки слизистых оболочек слу-щиваются. Во внутриэлителиальных пузырьках, а позже и в субэпнтелиальной ткани накапливается серозно-клеточный эксудат, который на поверхности эпителия образует корочки.

В случае вторичной инфекции некротн.чирующимн бактериями развивается картина глубоко распространенного некроза, а при попадании гноеродной микрофлоры развиваются гнойные процессы.

3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСА

Сущность метода заключается в выделении вируса в однослойных тканевых культурах и последующей его идентификации методом внруснейтрализацин. Метод применяют при копытной и генитальной формах заболевания.

3.1.    Метод отбора проб

3.1.1.    Для вирусологических исследований берут корочки и пораженные участки кожи и слизистых оболочек.

Пробы помещают в стерильные пробирки (флаконы) без консервирующего раствора и доставляют в лабораторию вирусологии.

3.2. Аппаратура, материалы и реактивы

3.2.1.    Для проведения исследования применяют:

термостат на 37 °С;

центрифугу рефрижераторную с частотой вращения 5000 об/мин;

цилиндры мерные вместимостью 100 и 1000 см³ по ГОСТ 1770- 74;

карандаш восковой;

антибиотики (пенициллин,стрептомицин, нистатин);

сыворотку крови крупного рогатого скота;

среду питательную для культивирования клеток:    0,5%    лак-

тальбумнна на растворе Хэнкса и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота;

Стр. 6 ГОСТ 257JJ—И

среду поддерживающую: 0,5% лактальбумина на растворе Эрла с 3%-ной сывороткой крупного рогатого скота;

раствор фосфатно-буферный.

3.3.    Подготовка к исследованию

3.3.1.    Из взятых проб (корочек) готовят 10%-ную суспензию в фосфатно-буферном растворе, содержащем 500 ЕД пенициллина, 250 мкг стрептомицина и 50 ЕД нистатина на 1 см¹.

Полученную суспензию центрифугируют в течение 30 мин с частотой вращения 2000—3000 об/мин. Для проведения исследования берут надосадочную жидкость,

3.4.    Проведен не исследования

3.4.1.    Порциями налосадочной жидкости по 0,2 см* из каждой пробы инфицируют по 4—5 пробирок с культурой клеток, полученной из почек, семенников или щитовидной железы ягнят. Адсорбция длится 60 мин при температуре 37°С, жидкость удаляется и заменяется поддерживающей средой.

3.4.2.    Проводят инкубацию культуры тканей в термостате при температуре 37 °С. В культуре ткани, в отличие от контрольных незараженных проб, вирус вызывает цитопатнческнй эффект в период между 4 и 14 сут.

Вирус сначала размножается только в клетках тканей ягнят, но после его изоляции может размножаться н в тканевых культурах почек и семенников телят.

3.4.3.    Идентификацию вируса проводят методом вируснейт-рализацни с применением специфической сыворотки. Реакцию нейтрализации ставят в культуре клеток путем заражения их смесями испытуемого вируса, взятого в дозе 100 ТЦД» с двукратными разведениями специфической сыворотки по методу, утвержденному в установленном порядке.

3.5.    Обработка результатов

3.5.1.    Вирус контагиозного пустулезного дерматита считают идентифицированным, если он нейтрализуется специфической сывороткой в разведении, равном ее титру.

4. МЕТОД ПОСТАНОВИ 6ИОЛРОБЫ

Сущность метода заключается в воспроизведении заболевания у здоровых ягнят, козлят в возрасте 3—6 мес или котят.

4.1.    Метод отбора проб

4.1.1.    Отбор проб — по п. 3.1.

4.2.    Подготовка к исследованию

4.2.1.    Суспензию для проведения исследования готовят в соответствии с п. 3.3.

4.3.    Проведение исследования

ГОСТ 25723—>3 Стр. 7

4.3.1.    Заражение животных испытуемой суспензией проводят методом скарификации кожи в области губ, внутренней поверхности бедра.

4.4. Обработка результатов

4.4.1.    Биопробу считают положительной, если у подопытных животных через 2—5 сут на месте заражения появились характерные изменения в виде быстро подсыхающих с образованием корочек оспоподобных поражений кожи (пустул, папул).

Редактор N. Е. Шестакова Техннчссхпй редактор J1. Я. Митрофанова Корректор О. Я. Чернецоеа

Сдкио в наб. 22.0t.83 Подо- в пгч 77 05ЛЗ 0.6IS П. а. 0.42 jtv-hm, л. Тар 6009 Цгн 3 коп.

Орлма «Знак Почета» Иадамикстао стандартов. J23M7. Москаа. Нояиерсскенсхий пер 3. Калужская т*яо(уафм« стандартов. у*. Москоаскаи, 256. Зак. IJS9