Сертификация: тел. +7 (495) 175-92-77
Стр. 1
 

9 страниц

304.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на сельскохозяйственную, синантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа

Оглавление

1 Отбор проб

2 Методы исследований

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ, СИНАНТРОПНАЯ, ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА

ГОСТ 25581-9!

24 руб. БЗ 9—91/1009

Издание официальное

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР Москаа

Страница 2

УДК 636.5.001.4 : 009.354    Группа    С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ.

СИНАНТРОПНЛЯ. ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

Методы лабораторной диагностик гриппа    ГОСТ

Birds, poultry, synanthropos. game and exotic.    25681    91

Methods of Avian шПиепхя laboratory diagnostics

ОКСТУ 9209_

Дата введения 01.01.93

Настоящий стандарт распространяется на сельскохозяйственную, еннантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа.

1. ОТБОР ПРОБ

1.1.    Для проведения исследований отбирают пробы патологического материала:

головной мозг и селезенку или гортанные и клоакальные смывы от больной птицы в первые два дня заболевания или от птицы в агональном состоянии. Патологический материал помешают в термос со льдом илн раствор глицерина с массовой долей 50 %, приготовленный на физиологическом растворе с pH 7,2—7,4;

сыворотку крови больной и переболевшей птицы в количестве 1—2 см1 (не менее 20 проб).

1.2.    Пробы крови для определения антител в сыворотке берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или термостате при 37°С в течение 1—2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пинеткой по стенке пробирки и оставляют на 16—18 ч при температуре 2—4°С Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

Издание официальное

<g) Издательство стандартов. 1992

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта СССР

Страница 3

С 2 ГОСТ 25381-91

Для ретроспективной диагностики используют парные пробы сывороток кроен, полученные от больных и подозреваемых п заболевании птиц в начале заболевания и через 4—10 сут.

1.3.    Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом. К пробам прилагают сопроводительный документ, содержащий сведения о клинике, эпизоотологии заболевания, а также данные о результатах вскрытая трупов.

1.4.    До начала лабораторного исследования патологический материал хранят в рефрижераторе при температуре 2—4®С не более 24 ч.

1.5.    Сыворотку крови исследуют в течение 3 сут со дня взятия кровн. 8 случае исследования сыворотки в более позднке сроки ее замораживают или консервируют путем добавления мертиолдта натрии до концентрации 1 : 10000

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.    Метод выделения вируса

Сущность метода заключается в выделении вируса на эмбрионах кур и последующей его идентификации.

2.1.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат с температурой нагрева 37—38 °С.

Центрифуга с частотой вращения 3000-'.

Центрифужные стаканы вместимостью 50—100 см3.

Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0.1 г.

Размельчнтель тканей.

Овоскоп.

Колбы конические стеклянные вместимостью 100 см* по ГОСТ 1770.

Пробирки стеклянные вместимостью 10, 15, 20 см* по ГОСТ

25336.

Пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292.

Ступка фарфоровая.

Шприцы с иглами.

Стекло кварцевое.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, раствор с массовой долей 0.8 % или другие дезинфицирующие средства.

Натрий лимонно-кислый 3 х замещенный по ГОСТ 22280, раствор с массовой долей 5 %.

Иод по ГОСТ 4159. раствор с массовой долей 5 % на физиологическом растворе.

Антибиотики — пенициллин и стрептомицин.

Среды питательные МПБ н МПА.

Страница 4

ГОСТ 25581-91 С. 3

Парафин.

Развивающиеся эмбрионы кур 9— 10-суточного возраста.

Эритроциты кур на физиологическом растворе. 0,7 и I %-ная взвесь, которую готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше б мес из лодкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором в равных объемах с раствором лимонно-кислого натрия.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500-: в течение 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 0,7 или I %-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 °С.

2.1.2.    Подготовка к исследованию.

2.1.2.1. Обработка органов патологического материала

Патологический материал стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенаг разводят I : 10 стерильным физиологическим раствором н центрифугируют с частотой вращения 1500—2000-’ в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки, добавляют 1000 ед/см3 стрептомицина и выдерживают при комнатной температуре 60 мин.

2.1.3.    Проведение исследования

Для исследования одной пробы материала (надосадочная 10 %-лая суспензия) заражают не менее 10 эмбрионов. Перед заражением "эмбрионы предварительно овосколируют, отмечая границу пути и участок между кровеносными сосудами для прокола скорлупы и инокуляции исследуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют раствором йода и фламбируют. В центре воздушного пространства и в месте введения исследуемого материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 cms исследуемого материала на глубину 2—3 мм в аллантоисную полость. Одновременно делают его высевы по 0,2 см* на питательные среды МПБ и МПА, которые помещают в термостат при 37—38 °С. Контролем служат 5 незараженных эмбрионов. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 24—96 ч при температуре 37—38 °С и относительной влажности 60—70%. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибшие—сохраняют в холодильнике при 4°С. Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4°С в течение 10—12 ч.

Страница 5

С 4 ГОСТ 2S6B1—81

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу обрабатывают йодом и фламбируют и из каждого эмбриона отдельно собирают экстра-эмбрнональную жидкость в стерильные пробирки, которую высевают на МПБ и МПА и проверяют на гемагглютинируюшую активность вируса в капельной реакции гемагглютинацин (РГА). Реакцию ставят на стекле путем смешивания равных капель экстра эмбриональной жидкости с ! %-ной взвесью эритроцитов кур. При отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости в количестве 1—2 см3 от каждого зараженного эмбриона (не менее 5 эмбрионов) объединяют и вновь заражают не менее 10 эмбрионов.

Выделение вируса проводят в течение 3-х пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютинннов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2—3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Результат исследования пробы патологического материала считают отрицательным, если в трех дополнительных пассажах не будет обнаружено гемагглютинацин эритроцитов.

При наличии гемагглютинацин эритроцитов проводят идентификацию выделенного вируса.

2.2. Метод постановки реакции гемагглютинацин

Сущность метода заключается в способности вируса гриппа птиц агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1.    Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 2.1.1 н дополнительно:

мнкротитратор типа Такачн или аналогичный;

мнкропипетки;

панели из плексигласа.

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вирусосодсржащего материала (надосадочную жидкость, полученную после обработки патологического материала как указано в п. 2.1.2.1.) от 1 : 2 до 1 : 1024. Для этого в ряд лунок панелей из плексигласа наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см3. В первую лунку вносят 0.2 см1 вируса, трехкратно пипетнруют и переносят 0.2 см3 во вторую лунку и т. д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см1 удаляют в дезинфицирующий раствор. В каждую лунку добавляют по 0,2 см* 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах по 0.2 см3 каждого. Реакцию гемагглютинацин и реакцию торхюжения гемагглютинацин (РТГА) ставят также с использованием микротнтраторов или микропипе-

Страница 6

ГОСТ 25581—»t С. 5

ток в объеме 0,025 см3 в плексигласовых панелях с лунками с 0,7 %-кой суспензией эритроцитов.

2.2.3.    Обработка результатов

Наличие на дне и стенках лунок осадка эритроцитов в виде опрокинутого «зоктика> свидетельствует о положительной РГЛ. При отрицательной реакции в опыте и контроле эритроциты образуют на дне лунки диск с ровными краями.

Титром вируса считают предельное разведение его. при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует одной агглютинирующей единице (I ЛЕ).

2.3.    Метод идентификации вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютннируюшую активность вируса в реакции торможения гемагглютннации со специфическими гриппозными сыворотками.

2.3.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

2.3.1.1.    Аппаратура, материалы и реактивы— по п. 2.2. I и дополнительно:

набор сухих инактивированных антигенов вируса гриппа тринадцати серологических вариантов и гипериммунных сывороток для диагностики гриппа птиц;

аппарат Киппа;

баня водяная;

мел или мрамор;

кислота соляная по ГОСТ 3118 с массовой долей 30%.

2.3.2. Проведение исследования

После определения титра исследуемого вируса в количественной РГЛ по п. 2.2.1 ставят РТГА. Вначале устанавливают рабочую дозу вируса (4 АЕ), для чего вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получится от деления на 4 обратного значения гемагглютннирующего титра вируса. Например: если титр вируса 1 :256. то рабочее разведение будет 256 : 4 = “ 64, т. е. в 0.2 смА разведенного 1:64 вируса будет содержаться 4 ЛЕ. Для его приготовления в данном примере берут 63 см3 физиологического раствора и 1 см3 исходного вируса.

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 ЛЕ. Для этого на панели в четыре лунки наливают по 0,2 см3 физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0.2 см3 4 АЕ вируса и после пипетирования 0,2 см3 переносят во вторую лунку, затем в третью и т. д. Из четвертой лунки 0,2 см3 разведенного вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. Таким образом, в первой лунке должно быть 2 АЕ, во второй — 1 АЕ, в третьей 0.5 АЕ, в четвертой — 0,25 ЛЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 см* 1 %-ной суспензии эритроцитов. Панель встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. При правильном определении рабочей лозы (4 ЛЕ) в пер-

Страница 7

С. 6 ГОСТ 23581-91

вой и второй лунках должна быть полная агглютинация, в третьей — частичная агглютинация, в четвертой — четко выраженный диск («пуговица») осевших эритроцитов.

Если в третьей лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации во второй и частично в третьей лунках свидетельствует о недостаточности вируса. Увеличивают или уменьшают рабочую дозу, добавляя соответственно вирус или физиологический раствор и затем повторно проверяют правильность выбора 4 АЕ.

2.3.3.    Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см3 физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см* специфической сыворотки. По второй лунке смесь пинетируют и переносят 0.2 см1 в третью лунку и т. д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 см3 рабочего разведения вируса (4 АЕ). Панели встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см' 1 %-ной суспензии эритроцитов.

Для точности учета РТГА ставят контроль: сыворотки (0,2 см* сыворотки + 0,2 смэ физиологического раствора и 0,4 cvJ I %-ной суспензии эритроцитов);

эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0.2 см1 физиологического раствора ±0,2 см3 1 %-ной суспензии эритроцитов).

2.3.4.    Обработка результатов

РТГА считают положительной, а идентификацию вируса завершенной. если специфическая сыворотка тормозит гемагглюгиниру-ющую активность вируса не менее 1/4—1/8 титра, указанного на этикетке ампулы (флакона).

2.4.    Метод выявления специфических антител

Сущность метода заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять тем агглютинирующую активность вируса в РТГА. С этой целью исследуют в РТГА с диагностическими антигенами вируса гриппа не менее 20 проб сыворотки крови от каждой обследуемой партии птиц.

2.4.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы —по пп. 2.1.1, 2.3.1 и дополнительно: глицерин, лед сухой.

2.4.2.    Подготовка к исследованию

Исследуемые сыворотки предварительно разводят в соотношении I : 5 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотки прогревают в водяной бане при 60 °С в

Страница 8

ГОСТ 25561-9! С. 7

течение 30 мин. В ампулы (флаконы) с антигенами добавляют физиологический раствор (pH 7,2—7,4) согласно «Наставлению по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц».

2.4.3.    Приведение исследования

Вначале готовят двухкратное разведение сыворотки на физиологическом растворе, начиная с разведения ! :*г>. Далее ставят РТГА, как указано в п. 2.3. t ,

При (Фнаруженхи в сыворотке крови титров антител 1 : 10 и выше, ее освобождают от неспецифических тирмостабнльных ингибиторов с целью подтверждения наличия специфических антител к вирусу гриппа. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2—3 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием ы течение 10 мин с частотой вращения 1500-1. НадосадочИУю жидкость НсслеДун$т в РТГА.    ‘    *

2.4.4.    Обработка результатов

Титром антител в сыворотке считают ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютннации с исследуемым антигеном.

Выявление титра антител I : 10 и выше, но не менее, чем в 30 % исследованной сыворотки является основанием для постановки диагноза, который должен быть подтвержден положительным результатом вирусологических исследований.

2.5. Метод ретроспективной диагностики

Сущность метода заключается в обнаружении достоверного прироста уровня специфических антител, обусловленного естественным развитием гриппозной инфекции в организме зараженных птиц.

2.5.1.    Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы н реактивы — по п. 2.2.1.1.

2.5.2.    Проведение исследований

Исследуют парные сыворотки, полученные в первые 1—2 сут в начале заболевания и через 4—10 сут после первого взятия крови. Сыворотку крови освобождают от ингибиторов как указано я п. 2 1 РТГА ставят с выделенным виоусг>м дли с антигенами диагностического набора по пп. 2.3 и 2.4 с учетом эпизоотической обстановки по циркуляции того или иного ссрологичеекиго варианта вируса гриппа.

2.5.3.    Обработка результатов

Четырехкратное и более увеличение титров антител в.парных сыворотках является основанием для установление положительна-, го диагноза.

Страница 9

С 8 ГОСТ 25581-*!

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Московской ветеринарной академией нм. К. И. Скрябина и Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов

РАЗРАБОТЧИКИ

Н. Г. Осидзе, д-р бнол. наук; В. И. Смоленский, канд. вег. наук

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 30.09.91    1575

3.    Срок проверки— 1996 г., периодичность проверок —5 лет

4.    ВЗАМЕН ГОСТ 25581-83

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД. на который дана ссилка

llovcii пункта

ГОСТ 1770-7-1

2.1.1

ГОСТ .3118-77

2.3.1.1

ГОСТ 4159-79

2 1.1

ГОСТ 1233-77

2.1.1

ГОСТ 20292-74 ,

2.1.1

ГОСТ 22280-76

2.1.1

ГОСТ 25336 >92

2.1.1

Ргдакт >р В Af. Лианнино Технический редактор А. Тсребичкина Корректор О. Я. Чернен1***

Сдано a HtG 1C 10 Wi Поди л ш-ч. Я'1)1 Уг Ус'1- « л. ОМ'/ УСД кр отг <■.*>> Уч и«д I «*..»<

1 т.

OfitaM «Знак Почета» Издательство ста.-дартоя. Itfl»?. Мнсква, ГСП. Нопоарссигмскк* по»-. 3 К*луА«к«й шчшпа^я о »иWkiWitH. !Г*> Лян 1*и»

Заменяет ГОСТ 25581-83