Стр. 1
 

32 страницы

456.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни - лептоспироза, вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Методы исследования

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА

ГОСТ 25386-91

Издание официальное

37 руб. БЗ 9—91/1051



КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР М ос к пл

Страница 2

Редактор Г. И. Василенко Технический редактор Г. А. Терсбичкина Корректор Л. И. Зюбам

Сдано в Itsft П01.42 Поло, н mrs. II 03 92. Уел. п п. 2.0 Уел. кр Огг. 2.0. Уч.-им л, 2.1<*

ТирйЖ 4(А.

Орлана «Знак Поч«тя> И1Д*г«льсг*о ст*и*вр?*в. I23&.V, Москпа. ГСП. Н«и<Х1|1йсн*<*гкий пар . 3.

Калужгкан типографии стандартов. ул. Моско*скя«. ЗЖ.

Страница 3

УДК 636.9.001 4:006.354    Группа    С7*

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

гогт

Методы лабораторной диагностики лелтоспироза    *

25386—91

Agricultural animals Methods of laboratory diagnostics oi leptospirosis

ОКСТУ 9809

Дата медеиия 01.01.93

Настоящий стандарт распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни— лентоспнроза. вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans.

Диагноз на лепгоспироз устанавливают на основании эпизо-отологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным подтверждением диагноза лаборатории ми исследованиями.

I. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

I I. Материалом для исследований служит кровь, моча, органы и ткани, а также трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым, сердце и паренхиматозные органы плода.

1.2. Кровь для серологического исследования берут п количестве 5—10 см1 не ранее чем через 5—7 сут после проявления клинических признаков болезни или через 90 сут — для крупного рогатого скота, 60 сут — для свиней и животных других видов после введения вакцины. Кровь для бактериологического исследования берут в период лихорадки на 1—7 сут болезни

Издание официальное

© Издательство стандартов, 1992 Настоящий пандарт не может быть полностью мдч частично воспроизведен, тиражирован и распространен вез разрешения Госстандарта СССР

Страница 4

С. 9 ГОСТ 25386-91

1.3.    Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки. У коров н свиноматок допускается брать мочу катетером.

Мочу микроскопируют непосредственно в хозяйствах.

1.4.    Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа заворачивают в целлофановый пакет.

1.5.    Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пинеткой в стерильные пробирки.

1.6.    Пробами для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени объемом не более 1 см1, консервированные 10 %-ным раствором формалина.

1.7.    Пробы патологического материала должны быть исследованы с момента взятия в течение 6 ч в летнее время н 10—12 ч при хранении его в охлажденном состоянии.

1.8.    Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре: 30—40 °С в течение 3 ч. 25—30 °С— 4—5 ч, 20--25 °С — 6—8 ч, 16 —20 °С — 10—12 ч с момента взятия.

1.9.    Взятые пробы помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным (курьером).

В сопроводительном документе к пробам патологического материала указывают время гибели животного или время взятия проб при жизни.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

21 Серологический метод

Метод основан на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинзцни (РМА) и реакцией нммуноадсорбцин (РИД).

2.1.1.    Реакция микроагглютинации

2.1.1.1.    Аппаратура, материалы, реактивы

Термостат, обеспечивающий регулирование температуры па

28 -30 °С.

Центрифуга со скоростью вращения не менее 10000 об/мин.

Микроскоп биологический по ГОСТ 8074.

Конденсор темного поля.

Осветитель с точечной лампой.

Стекла предметные толщиной 0.8—1.1 мм и покровные (стекла, используемые для микроскопии, должны быть бесцветными, прозрачными, чистыми, без царапин и бликов) по ГОСТ 9284.

Пластинки с лунками или пробирки Флоринского.

Штативы.

Страница 5

ГОСТ гвМ-tl С 3

Пяпетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см1 по ГОСТ 20292.

Аппарат Флорииского.

Петля бактериологическая.

Натрий хлористый х. ч. по ГОСТ 4233 или ч. д. а. 0,85 %-шый раствор в дистиллированной воде. Раствор разливают во флаконы или бактериологические пробирки и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 вС в течение 30 мин.

Антигены — живые культуры штаммов лептоспир, указаны в таблице.

Cvpotpyiuia

Ccpouap

1 ском'вдусуы: ш-а<мы*

Portions

pomoiu

Pomona

Tarassovi

tirassovi

Perepelicin (Mills

Johnson)

Grippotyphosa

grippolyphosa

Moskva V (Valbuzzi)

Hebdomadis

kabura (borincana.

Kabura (HS—22,

hebdomadis)

HeMomadis)

Sejroe

polonica (sejroe,

493 Poland (M—84,

wolfff, hardjo)

3706, Hardjnprajitno)

Mini

szwajlzak

Szwajizak

Icterohaemorrhagiae

eopenhageni

M—29. Waijnberg

(ieterohaemorrhaglae)

(RrA)

Cankola

canicola

Hond Utrecht IV

Balaviae

djatzi (baliviat-)

MS—26 (Van Tienen)

Javantea

poi (javanica)

Poi (Veidrat wutaviav

Ait\

Australis

australis

40}

Ballico

(bratislava)

(lez Bratislava)

Autumnal is

autumnalis

Akijami A (Raehmat)

(raehmat)

Ballum

ballum (castellonis)

Mus ICT (Castellon 3)

Pyrogertcs

pyrogenes

Salinem

Cynopteri

cynoptcri

Vleermuis 3566 (35220

Panama

panama

CZ-2I4-K

Celledoni

celledoni

Celledoni

Sherman!

shcrmani

LT—821

Djasiman

djasiman

Djasiman

Sarmin

sarmin

Sarmin i

Louisiana

louisiana

LSU—1945 I

Ranarum

ranarum

ISF

Manhao

manhao

L 105

' В скобках приведены штаммы-гпа.«огм Кроме рекомендуемых могут 6ы«. мсподыииапы и другие штаммы летоепир

2.1.1.2. /Iодготовка к исследованию Предметные и покровные стекла, не бывшие в употреблении, кипятят в мыльном растворе в течение 30 мин, промывают про-

Страница 6

С 4 ГОСТ 2Ю8в-«1

точной водой, ополаскивают дистиллированной водой и насухо протирают^    •    ■    .    Г*

Стекла после употребления опускают в эксикатор с I %*ным раствором соляной кислоты или другим дезинфицирующим :* веществом. После накопления достаточного количества использованных стекол кислоту сливают, стекла промывают в проточной водопроводной воде, кипятят в мыльном растворе, промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой..и протирают.'    • •

Пластины с лунками после проведения в них реакции опускают для обеззараживания в 1 %-ный раствор соляной кислоты и выдерживают не менее 1 ч. Затем их промывают в теплой мыль^ ной воде; протирают ершиком каждую лунку, тщательно отмывают в проточной водопроводной воде, заливают дистиллированной водой и выдерживают до следующего утра. Утром воду сливают и пластины просушивают.

Перед постановкой реакции каждую лунку дополнительно протирают тампоном из ваты.

Для исследований используют свежую, замороженную, высушенную на фильтровальной бумаге, консервированную фенолом или борной кислотой сыворотку крови.

Для консервации сыворотки фенол добавляют в виде 5 %-но-го раствора при постоянном помешивании из расчета 0,05 см1 {! капля) .на каждый кубический сантиметр сыворотки. Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образовании на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.

При консервации сыворотки методом высушивания на квадраты белой фильтровальной бумаги (5X5 см) наносят по 3—5 капель (0,05 см‘ каждая) сыворотки. Высушивание проводят лри комнатной температуре или в термостате при температуре (37±1) °С. Высушенные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца.

Гг.чг'лг-’ированную, загнившую, плесневелую и проросшую сыворотку не исследуют.

Сыворотку разбавляют физиологическим раствором:

1)    неоакциннрованных животных 1:25;

2)    вакцинированных животных 1:50.

После добавления антигена разведения удваиваются и составляют соответственно: 1:50 н 1:100.

■ При необходимости сыворотку разбавляют в соотношениях 1:100, 1:200, 1:400 и т. д. до титра.

Сыворотку крови вакцинированного крупного рогатого скота исследуют в РМА через 3 мес, животных других видов — через 2 мес после вакцинации.    •    •*.    ■

Страница 7

ГОСТ 253М—•» С. 5

При исследовании сыворотки, высушенной на фильтровальной бумаге, вырезают одну или две капли (0,05 или 0,1 см1) сыворотки, измельчают ножницами и заливают в пробирке физиологическим раствором в объеме 2,45 или 4,9 см\ экстрагируют в течение 1 ч ори температуре (37 ± 1) °С.

-Полученный экстракт используют как исходное разведение сыворотки 1:25 или 1:50.

Сыворотку крови животных при ввозе их в хозяйство и вывозе из него для племенных целей и целей воспроизводства разводят 1:25 и исследуют только в одном разведении (после добавления антигена разведение сыворотки будет соответствовать 1:50).

При изучении этиологической структуры и обследовании импортируемого скота реакцию ставят со всеми приведенными в таблице антигенами, при обследовании животных в хозяйствах с известной этнологией и при перевозках внутри страны реакцию ставят с антигенами 4—7 серогрупп (Pomona, Tarassovi, Canicola, Hebdomadis, Sejroe, Grippolyphosa, Icierohaemorrltagiae).

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов не реже одного раза в год.

Пригодность культуры для использования в реакции оценивают просмотром в проходящем свете и мик|росколией. При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в среде в проходящем свете хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии наблюдается легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании посторонней микрофлоры, полная прозрачность среды — об отсутствии роста лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5—15 сут без признаков агглютинации и лизиса с накоплением 70—100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 40Х 1,5X7 или 40X7—10.

Через каждые 3 мес лаборатории контролируют диагностические штаммы лептоспир в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми агглютинирующими сыворотками.

2.1.1.3. Проведение исследования

Для постановки РМА разведенную сыворотку разливают мерной пипеткой или аппаратом Флоринского, начиная с большего разведения, в лунки агглютинационных пластин или пробирки по 0.1 см5 в каждую.

Сыворотку из каждого разведения разливают в отдельный ряд, состоящий из 4—23 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0.1 см’ в 1—3 лунки в зависимости от количества раз-ведений сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при 30—37 °С в течение 1 ч.

Страница 8

С в ГОСТ 25386-91

‘ Контрольной служит смесь 0,1 см’ культуры лептоснир с СМ си1 физиологического раствора. Лсптоспиры в контрольном варианте должны оставаться подвижными, не иметь признаков лнзнса и агглютинации.

Реакцию учитывают микроскопией капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20x10 или 40X7X1,5. Капли ил лунок наносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают нх без покровного стекла. Капли наносят двумя способами: бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и просматривают нх под микроскопом; бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигая столик на 2—3 мм, и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. Перед взятием каждого нового антигена петлю прокаливают и охлаждают.

Результаты реакции оценивают в крестах:

• -*-+ + + — агглютинированы 100% лептоснир;

+ + +    —    »    75 %    »

+ +    —    *    50 %    >

-f    -    *    25 %    >

—    —    агглютинация отсутствует.

Агглютинация проявляется в склеивании лептоснир и образовании паучков. Паучок включает от 3—5 до нескольких деситков и сотен лептоснир. Свободные концы лептоепнр сохраняют подвижность

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоснир, проявляющийся в набухании и прекращении движения клеток, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

2.1,14. Оц ен ка результатов

Положительной считают РМЛ, оцененную на два креста и более при отсутствии агглютинации в контроле.

Наличие специфических антител в сыворотке крови животных п т;.грс- 1:50 у иевгкцшшрованных — 1:100 у вакцинированных и выше свидетельствует об инфицировании данной особи лептоепк-рами и возможном лептоспироиоснтельстве.

РМА специфична в любом разведении, а наличие антител п любом титре свидетельствует об унифицировании данной особи лептоспирами и возможном лептоеппропосительстве.

По результатам серологических исследовании возбудителями лептоспироза считают лептоспнры той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Необходимо учитывать, что п сыворотке крови свиней, лошадей. крупного и мелкого рогатого скота при исследовании в РМА обнаруживают в 5—15 % случаев антитела в наиболее высоком

Страница 9

ГОСТ2538в-в1С. 7

титре к лептоспнрам: Autumnalis, Cynopteri, Bataviae, Pyrogenes, Australis, которые не выделяют у сельскохозяйственных животных. Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые.

Лептоспиры названных серогрупп могут быть признали возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только шсле выделения в чистой культуре или подтверждения лх роли исследованием пробы сыворотки в реакции иммуноадсорбции.

В случае выявления реакций с лептоспирами необычных для сельскохозяйственных животных серогрупп проводят повторное исследование сыворотки крови в РМА с интервалом 10—12 сут с целью освобождения от межгрупповых реакций без проведения имиуноадсорбцни.

2.1.2. Реакция иммуноадсорбции

2.1.2.1.    А ппаратура, растворы и антигены

Для проведения исследования применяют аппаратуру, растворы и антигены, указанные в п. 2.1.1.1.

2.1.2.2.    Проведен ие исследования

В реакции иммуноадсорбцин изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лелтоспир нескольких серологических групп в разных титрах или имеющие наиболее высокий титр по отношению к лептоспнрам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспирозз у сельскохозяйственных животных.

Для проведения адсорбции выращивают во флаконах вместимостью 0,5—1,0 дм5 все штаммы лептоспнр, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации, 5—7 сут культуры лептоспир осаждают центрифугированием с частотой вращения 10000 об/мин в течение 30 мин. Сливают надосадочную жидкость, осадок подсушивают, 0,1 смг исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 см' физиологического раствора и дробно в три приема с интервалом 10 мин добавляют к осадку антигена, суспендируя его после каждой порции разведенной 1:10 сыворотки. Смесь выдерживают в течение 24—48 ч при 1—5 °С и отделяют сыворотку центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. Адсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту, а затем при отрицательных результатах исследуют с лептоспирами всех 'серогрупп, с которыми реагировала сыворотка до адсорбции.

Для сокращения объема работы сыворотку целесообразно в начале адсорбировать лептоспирами, являющимися частыми возбудителями болезни у животных данного вида.

2.1.2.3.    Оценка результатов

В процессе адсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспнрам всех серологических групп, в то время как антитела н возбудителю болезни не адсорбируются из сыворотки гете-рологичнымн типами лептоспир.

Страница 10

С. в ГОСТ 25Mtt—91

Возбудителями инфекции являются лептоспиры той серо-группы, антигены которой извлекают из сыворотки антитела к лелтоспнрам всех серологических групп.

2.1.3. Учет результатов серологических исследований

2.1.3.1.    По результатам серологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство (ферму, отделение н т. д.) неблагополучным по лептоспирозу, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании в РМА в титре 1:100 у вакцинированных н 1:50 н выше у иевакцикированных более чем у 20 % обследованных животных.

2.1.3.2.    Лептоспироз считают причиной абортов при обнаружении антител в сыворотке крови абортированного плода и предположительно при высоком титре антител (1:2500 и более) в группе абортированных животных и низком титре (до 1:500) или отрицательной реакции в группе здоровых животных.

2.1.3.3.    Лептоспиры серогрупп Autumnalis, Cynopteri, Batayiae, Pyrogones, Australis, Ballum могут быть признаны возбудителями лептоспироза животных только после выделения из органов павших животных или подтверждении их роли исследованием пробы сыворотки в реакции иммуноадсорбции.

2.2. Бактериологический метод

Метод заключается в обнаружении лелтоспир в исследуемом материале путем микроскопии в темном ноле микроскопа, нмму-нофлуоресцентным методом, выделения культур лептоспир в специальных средах, постановке биологических проб на лабораторных животных, идентификации и дифференциации выделенных культур

2.2.1. Аппаратура, материалы, реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и растворы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно:

Колбы или бутыли вместимостью 1, 2, 3, 5 дм\

Сифоны с резиновыми шлангами.

Фильтры Зейтца или другие аналогичного типа.

Сыворотку крови кролика или барана, не содержащую специфических противолептоспирозных антител.

Среду сывороточную на фосфатном буфере.

Среду Уленгута (водно-сывороточную среду).

Среду Ферворта-Вольфа (в модификации С. И. Тарасова).

Среду Флетчера полужидкую.

' Среду Кортгофа.

Среду синтетическую безбелковую Шенберга.

* Среду твнн (полнеорбат) альбуминовую Эллингаузена.

Среду Эллингаузена.

Среду теин-альбумин сывороточную Эллиса.

Страница 11

ГОСТ 253М-9» С. 9

. Среду усовершенствованную элективную для выделения л.егт> тоспнр.

Среду избирательную с 5-флюороурацилом для выделения Лем» трслир.

. Среду плотную Кокса.

2.2.2. Подготовка к испытанию

2.2.2.1.    Приготовление сыворотки крови кролика или барана

Для приготовления сыворотки используют: кровь кролика или барана;

цилиндры стерильные вместимостью 100 и 200 см* по ГОСТ 1770;    Г

шприцы по ГОСТ 22967; пробирки бактериологические по ГОСТ 1770.

Сыворотку готовят следующим образом: кровь у кролика, берут из сердца » количестве 30—40 см’ в стерильные цилиндры вместимостью 100— 200 см* или шприцем, из которого кровь переливают в стерильные пробирки, у барана — из яремной вены в стерильные цилиндры вместимостью 0,5—1,0 дм3 в количестве 400—500 см3.

Цилиндры или пробирки с кровью выдерживают при (37±1)СС в течение 30—40 мин, затем кровяной сгусток обводят металлической спицей и ставят в холодильник для отстаивания сыворотки на 1—2 сут. Отстоявшуюся сьюо^отку сливают в стерильные флаконы вместимостью 100—200 см* и инактивируют в водяной бане при 56—58 °С в течение 1 ч.

Инактивированную сыворотку хранят при 1—5 °С и используют по мере необходимости для изготовления питательной среды.    ;

2.2.2.2.    Приготовление сывороточной среды на фосфатном буфере

Для приготовления среды используют; калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 10075; воду дистиллированную по ГОСТ 6709; натрий фосфорнокислый двузамешенный по ГОСТ 11773.. Среду готовят следующим образом: рабочий раствор фосфатного буфера (pH 7,2—7,4) в количестве 1.4 дм1 разливают в бутыли с сифоном, стерилизуют в автоклаве при 120°С в тсчеяно 30 мин.

Раствор фосфатно-буферный готовят следующим образом: в стеклянных колбах растворяют отдельно 9,078 г однозамещенно-го фосфорнокислого калия в 1 дм3 дистиллированной воды >н 11,879 г двузамещвнного фосфорнокислого натрия в 1 дм3 дистиллированной воды. Эти маточные растворы хранят гари 2—4 °С до 30 сут.

Для получения рабочего буферного раствора берут 79 ом*

Страница 12

С *в ГОСТ ШМ -91

маточного раствора двуэамещениого фосфорнокислого натрия. 21 см-* маточного раствора одноза мешенного фосфорнокислого калия н 900 см3 дистиллированной воды.

Буфер должен иметь pH 7,2—7,4. При отклонении pH в кислую сторону добавляют раствор двузачещенного фосфорнокислого «атрмя. При отклонении pH я щелочную сторону добавляют в раствор одноза мешенного фосфорнокислого калия. Рабочий буферный раствор стерилизуют при 120 °С в течение 30 мин.

В охлажденный буферный раствор добавляют 5—10 % инактивированной сыворотки крови кролика или барана

Смесь фильтруют через фильтр Зейтца или другой. Профильтрованную среду расфасовывают сифоном л стерильные пробирки или флаконы.

Среду для проверки на стерильность выдерживают при (37± I) °С в течение 3—5 сут.

22.2.3. Приготовление среды Уленгута (подносы во роточной среды)

Для приготовления среды используют

воду дистиллированную по ГОСТ 6709 или колодезную, или речную, или водопроводную;

пробирки бактериологические по ГОСТ 1770; сыворотку крови кроликов инактивированную,

Среду готовят следующим образом; воду дистиллированную, водопроводную, колодезную или речную разливают в пробирки по 5 см4 и стерилизуют, охлаждают, добавляют в каждую пробирку по 0,5 ом8 свежей кроличьей инактивированной сыворотки. Среду для проверки на стерильность выдерживают при (37± I) °С в течение 3—5 сут.

2.2.2.4. Приготовление среды    Ф с р по р т а-Вольфа

(в модификации С. И. Тарасова)

Для приготовления среды используют воду дистиллированную по ГОСТ 67(19; натрий хлористый по ГОСТ 4233; пептон (Дифко или Витте); бумагу фильтровальную по ГОСТ 12020; пробирки бактериологические по ГОСТ 1770; сыворотку крови кролика; баню водяную.

Среду гоговят следующим образом; к 900 см* дистиллирован-ной веды добавляют 0,5 г хлорида naipnfl, I г пептона (Дифко или Витте), 100 см’ маточного рленюра фосфатного буфера с pH 7,2--7,4. Смесь в колбе автоклавнруют при 120 X в течение 30 мин. На следующий день дважды фильтруют чср„‘. бумажный фильтр, разливают в пробирки но 5 см* и снова автоклавнруют при 120 СС в течение 30 мин. В пробирки с прозрачной сре-

Страница 13

ГОСТ 2М8в—91 С II

дой добавляют по 0,5 см' кроличьей сыворотки. Среду прогревают в водяной бане при 56—58 °С в течение 30 мин

Для проверки на стерильность пробирки со средой выдерживают при (37± 1) °С в течение 3—5 сут.

22.2.5. Приготовление полужидкой среды Флетчера

Для приготовления используют: воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

агар-агар микробиологический по ГОСТ 17206 или пищевой по ГОСТ 16280, или Дифко;

пробирки бактериологические по ГОСТ 25336; сыворотку крови кролика или барана, баню водяную.

Среду готовят следующим образом: к 1 дм3 дистиллированной воды добавляют 2 г агар-агара (лучше агар Дифко). Смесь кипятят 30 мин, расфасовывают по 5 ом3 в пробирки, автоклави-руют при 120 “С в течение 30 мин, охлаждают, добавляют в каждую пробирку по 0,5 см3 стерильной кроличьей или овечьей сыворотки, прогревают в водяной баие при 56—58 °С я течение 30 мин. Среду контролируют на стерильность выдержкой при (37±1)°С в течение 3—5 сут.

2.2.2.6.Приготовление среды Кортгофа

Для приготовления среиш используют: иолу дистиллированную по ГОСТ 6709; пептон Витте;

натрий хлористый по ГОСТ 4233; натрия гидрокарбонат по ГОСТ 199; калий хлористый по ГОСТ 4234; кальций хлористый по ГФХ;

калий фосфорнокислый одиозамешенный по ГОСТ 10075; натрий фосфорнокислый двузамещениый по ГОСТ 11773; аппарат Коха;

бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026; пробирки бактериологические по ГОСТ 1770.

Среду готовят следующим образом: к 500 см* дистиллирооал-iiofi воды добавляют 0,40 г пептона Витте, 0,70 г хлорида натрия (NaCI), 0,01 г гидрокарбоната натрия (NaHCOa), 0,02 г хлорида калия (KCI). 0,02 г хлорида кальция (СаС12). 0,09 г калия фосфорнокислого однозамешенного (КНгРО{), 0.48 г натрия фосфорнокислого двузачещенного (Ма2НР04х2Нг0). Раствор прогревают в аппарате Коха при 100 СС в течение 20 мин, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и еще раз прогревают при 100 °С в течение 30 мин. Пекле того как раствор остынет, добавляют 8 % свежей сыворотки. Среду разливают по 5—8 ом3 в пробирки и прогревают в водяной бане при 56 ° С в течение 1 ч.

Страница 14

С. 12 ГОСТ 25386-91

2.2.2.7. Пр иго тов а ен и е безбелковой среды Шенберга .

Для приготовления среды используют:

воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773;

ралий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 10075;

магний сернокислый по ГОСТ 4523;

сульфат железа (11) аммоний;

кислоту этилендиаминтетрауксусную;

твин-80;

твин-60;

глицерин по ГОСТ 6259;

L — аспарагин; витамин В|2; витамин В(;

кальция карбонат по ГОСТ 3159; кислоту соляную по ГОСТ 3118; уголь активированный древесный; фильтр мембранный.

Среду готовят следующим образом: к 1 дм’ дистиллированной воды добавляют 0,531 г натрия фосфорнокислого двузамешенно-го (Na2HPO«), 0,069 г калия фосфорнокислого однозамешенного (КН2РО«), 0,150 г сульфата магния (MgS04x7H20), 0,006 г сульфата железа (11) — аммония FeS04-(NH4)2S0v6H20, 0,004 г Ca+t, 0,010 г этиленднаминтетрауксусной кислоты, 0,050 г твина-80, 0,200 г твнна-60, 0,200 г глицерина, 0,500 г L-аспарагина, 0,01 г витамина В|2 и 0,001 г витамнна Bt. Са++ берут в виде карбоната кальция и обрабатывают раствором соляной кислоты, витамин В| добавляют в среду асептически после стерилизации. Среду нагревают до кипения,’ фильтруют, расфасовывают и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин, конечное значение pH сос тавляет 7,4—7,6.

Для детоксикации добавляют к питательной среде сыворотку крови или альбумин или соединяют твин с 0,5 частями по массе мелкого порошка древесного угля. Для этого 20 г отобранного полисорбата разводят в 200 см' дистиллированной воды при комнатной температуре и перемешивают раствор до достижения однородной консистенции. При помешивании к водному раствору медленно добавляют 40 г активированного древесного угля. Отношение твина к древесному углю может варьироваться от 1:6 до 6:1. Помешивание продолжают до 18 ч при 22—25 °С, далее отстаивают уголь в течение 18 ч при 4 “С. Раствор полисорбата осторожно отделяют от осадка древесного угля, центрифугируют в течение 1 ч при 10000 об/мни, фильтруют через мембранный фильтр для удаления оставшихся мелких частиц угля, хранят раствор полисорбата при минус 20 °С.

Страница 15

ГОСГ 253*6 -91 С 13

2.2.2.S. Приготовление теин (полисорбат) альбуминовой среды Эллингаулена Для приготовления среды используют: аммоний хлористый по ГОСТ 3773; цинк сернокислый по ГОСТ 417-1; кальций хлористый по ГВХ; магний хлористый по ГОСТ 4209; железо сернокислое по ГОСТ 4148. медь сернокислую по ГОСТ 4165; глицерин по ГОСТ 0259; твин-80; витамин Б г, витамин В|2;

воду дистиллированную но ГОСТ 6709; натрий фосфорнокислый однозамещениый; калий фосфорнокислый; натрий хлористый по ГОСТ 4233; тиамин;

альбумин бычий; натрия гидроокись.

Для приготовления среды готовит исходные водные растворы грамм на 100 см'* воды): хлорида аммония (NH<CI) — 25, сульфата цинка (ZnSO«X7HaO) — 0,4, хлорида кальция (СаС12Х x2HiO) — 1,0, хлорида магния (MgCI2X6H20) — 1,0, сульфата железа (FeS0«X7H?0)—0,5,сульфата меди (CuSO«X5HaO)—0,3. глицерина — 10, твина-80 — 10, витамина — 0,5, витамина В,* — 0,02. Растворы хранят в замороженном состоянии.

Основную среду готовят добавлением к 997 см' дистиллированной воды натрия фосфорнокислого од ноза метенного (Na2HPO«) - 1,0 г или (Na,HP0«X2H,0) — 1,2535 г, калия фосфорнокислого (КН2Р04) — 0,3 г, хлорида натрия (NaCl) —

1.0    г и исходных растворов: хлормда аммония — 1,0 см3, тнами-«а — 1,0 см*, глицерина 1,0 см\ pH доводят До 7,4, стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин.

Альбуминово-твиновая добавка представляет собой 10 %-ный бычий альбумин, фракция V, 20 г которой добавляют к 100 см' стерильного бидистиллята, при постоянном помешивании. добавляют исходные растворы: хлоридов кальция и магнии по

3.0    см’, сульфата цинка — 2,0 см3, сульфата меди — 0,2 см3, сульфата железа — 20,0 см3, витамина В12 — 2,0 см3, твнна-80 —

25.0    см\ воды до 200 см3. Доводят pH до 7.4, используя гидроксид натрия, фильтруют через фильтр мнллипор (0,22 микрон) или Зейтца (0,2—0,3 микрон). Добавку можно хранить при (4± 1) °С или замороженной при минус 20 °С.

Среду для культивирования готовят добавлением 1 части альбумнновотвиновон добавки к 9 частям основной среды в ассп-

Страница 16

С И ГОСТ 2ЮЬв-91

тических условиях, фильтруют, расфасовывают но пробиркам или флаконам.

2.2.29. Приготовление среды Э л лингаузена Для приготовления среды используют: цинк сернокислый по ГОСТ 4174; железо сернокислое по ГОСТ 4148; воду деионизированную;

L-цистин;

раствор тиамина гидрохлорида — 0,2 %-ный раствор;

полнеорбаг—80;

витамин В|2;

альбумин сывороточный;

натрий фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 245;

калий фосфорнокислый по ГОСТ 4198;

натрий хлористый по ГОСТ 4233;

аммоний хлористый по ГОСТ 3773;

медь сернокислую по ГОСТ 4165.

Готовят полную среду смешиванием 800 см* основной среды и 200 см3 буферного раствора альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота.

Основную среду готовят следующим образом. Смешивают 40 см3 фосфатного буфера, 50 см3 солевого раствора, 1 см1 0,03 %-ного раствора сульфата меди, 10 см-' 0,04 %-ного раствора сульфата цинка, 0,05 см3 сульфата железа (FeS04X7H20)r растворенного в 20—40 см3 деионизированной воды. 0.2 г цистииа, 0,1 см3 0.2 %-ного раствора тиамина гидрохлорида, 1,2 см3 поли-сорбата-80 (растворенного а 5— 10 см3 воды), 0,2 см3 раствора витамина В,а (1000 см*), доводят деионизированной водой до 1000 см5.

После добавления L-иистина среду перемешивают 20 мин, дают отстояться 20 мин. Смесь очншаюг фильтрованием. Затем добавляют остальные компоненты. Среду перемешивают, разливают в стеклянные контейнеры, авгоклавнруют.

Буферный раствор альбумина сыворотки крупного рогатого скота готовят смешиванием 40 см3 фосфатного буфера и 50 г альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота, фракция V в порошке (либо эквивалентное количество в стерильном растворе), деионизированную воду добавляют до 1000 см3. Стерилизуют фильтрованием.

Растворы готовят следующим образом:

а)    фосфатный буфер: натрий фосфорнокислый (Na2HPO«) — 16.G г, калий фосфорнокислый (KHjPO*) — 2,17 г смешивают, добавляют деионизированной воды до 1000 см3;

б)    солевой раствор: хлорид натрия (NaCI): 36,0 г, хлорид аммония (NH4CI) — 5,35 г, сульфат магния (MkS0<X6H20) — 3,8 г, деионизированная вода — до 1000 см3;

Страница 17

ГОСТ 253В6-91 С is

в I 0,03 %-ный раствор сульфата меди: сульфат меди (CuSO<X XoHjO) — 0,3 г, деионизированная вода — до 1000 см3;

г)    0,04 %-ный раствор сульфата цинка: сульфат цинка (ZnS0<x7H20) — 0,4 г, деионизированная вода — до 1000 см3;

д)    0,2 %-ный раствор тиамина гидрохлорида: тиамин гидро* хлорид 0,2 г, деионизированная вода — до 1000 см*.

Полную среду готовят путем розлива основной среды в контейнеры и последующего добавления буферного раствора альбумина. Основную среду хранят не более одного года, буферный раствор альбумина — не более 6 мес.

2.2.2.10. Приготовление твин-альбумин сывороточной среды Эллиса

Для приготовления среды используют: воду дистиллированную по ГОСТ 6709; цинк сернокислый по ГОСТ 4174; кальций хлористый по ГФХ; глицерин;

аммоний хлористый по ГОСТ 3773;

витамин В|2;

тиамин;

магний сернокислый но ГОСТ 4523; железо сернокислое по ГОСТ 4148; твин-80; твии-40;

5-флюорацнл; кислоту нилнднксовую; альбумин бычий; лактальбумнн-гидролизат Днфко; магний хлористый но ГОСТ 4209; натрия гидроокись по ГОСТ 4329: сыворотку кроличью; натрий фосфорнокислый по ГОСТ 245; калий фосфорнокислый по ГОСТ 4198; натрий хлористый по ГОСТ 4233; аммоний хлористый по ГОСТ 3773; агар-агар.

Среду готовят следующим образом:

а)    стерилизуют дистиллированную воду по 100 см* н готовят исходные растворы каждый отдельно: сульфат цинка (ZnS04X Х7НгО) — 0.4 г, хлорси кальция (СаС1Х2НгО — 1,0 г, глицерин — 10,0 см3, хлорнд аммония (N'K,Cl) — 25,0 г, витамин В>2--— 0,02 г. тиамин — 0,5 г. сульфат магнии (MgS04) — 0,3 г. Растворы хранят при (4± 1) °С до 30 сут;

б)    перед употреблением готовят следующие растворы в дистиллированной воде: сульфат железа (FeS0«x7H20) — 0.5 г на 100 см3, твин-80 — 20 см' на 180 см3, твнн-40 20 см5 на 180 см3,

Страница 18

С 16 ГОСТ 25386 91

5-флюорацил — 1,0 г на 100 см3, нилидиксовая кислота — 1,0 г на 100 см3;

в) основную часть среды готовят растворением 10,0 г бычьего альбумина, 1,0 г лактальбуминагидролизата Днфко в 50 см3 стерильной дистиллированной воды. Размешивают до полного растворения и добавляют исходные растворы: тиамина — 1 см*, хлорида кальция — 1 см', хлорида магния — 1 см3, сульфата цинка — 1 см3, сульфата магния — 0,1 см3, сульфата железа — ~ 10 см3, витамина В!2 — 1 см3; твина-80 — 9 см3, твина-40 — — 3—5 см3. Перемешивают в течение 1 ч до полного растворения компонентов, устанавливают pH — 7,4 добавлением 10 %-ного раствора гидроокиси натрия. Добавляют дистиллированную воду до 96 смэ и 4 см3 кроличьей сыворотки свежевзятой и инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 20 смэ флюорацила и 20 см5 раствора нилидиксовой кислоты.

Для получения 1 дм3 готовой к использованию среды в 988 см3 дистиллированной воды растворяют гидроортофосфат натрия (NarI 1Р04 — 1 г. дигидроортофосфат калия (КН2РО«) — 0.3 г, хлорид натрия (NaCl) — 1 г, хлорид аммония (NH4C1) — 1 см5, глицерин — 1 см3. Размешивают до полного растворения, устанавливают pH — 7,4. Удаляют 140 см3 среды, добавляют 1,5 г очищенного агара и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин. охлаждают до 55 °С и вносят 140 см3 основной среды. Фильтруют через мембранные фильтры под давлением (0,22 микрон) и разливают в пробирки.

2.2.2.11. Приготовление усовершенствованной элективной среды для выделения лепт ос пир из контаминированного материала Для приготовления среды используют: глицерин по ГОСТ 6259; кальций хлористый по ГФ X; магний хлористый по ГОСТ 4209; цинк сернокислый по ГОСТ 4174; среду жидкую основную твин-альбуминовую; натрий уксуснокислый по ГОСТ 199; альбумин сывороточный; витамин Bt2 по ГФ X; магний сернокислый по ГОСТ 4523; медь сернокислую по ГОСТ 4165; твни-80;

пируват натрия; агар-агар;

железо сернокислое по ГОСТ 4148;

актибион;

бацитрацин;

5-флюорацил;

Страница 19

ГОСТ 25386-91 С. 17

неомнцннсульфат;

полимиксин В;    ,

рифампицин;

. сыворотку крови кролика.

Состав среды следующий: (грамм на 100 см’): глицерин — 0,10, хлор-ад кальция (СаС!гХ2НгО) —0,016, хлорид .магния (MgCl2X XGHjO — 0,016, сульфат цинка (ZnSO«X7HaO) — 0,004, основ-ная жидкая твнн-альбумнновая среда — 2,3, В|2 — 0,00002, сульг фат магния (MrS04X4H20) — 0,001, сульфат меди (CuSO«X Х5Н20) — 0,00015, твин-80 — 1,5, пируват натрия — 0,20, ацетат натрия — 0,10, сывороточный альбумин — 10,0, агар-агар — — 1,0, свежеприготовленный сульфат железа (FeSO«X7H20) — 0,01, актибион — 0,10, бацнтрацин — 0,04, 5-флюороурацил — 0,25, неомицин сульфат — 0,002, полимиксин В •— 0,0002, рнфампи-цин — 0,01 (антибиотики взяты в виде 10 %-ных растворов в 1 %-ном водном этаноле).

Смеси антибиотиков добавляют к питательной среде, содержащей 0,5—2 % сыворотки крови кролика и 0,1—0,3 % агара.

2.2.2.12.    Приготовление избирательной среды с 5-флюорацилом для выделения лептоспир

К плотной, полужидкой или жидкой среде добавляют 100—400 мг/см3 5-флюорацнла.

2.2.2.13.    Приготовление плотной среды Кокса Для приготовления питательной среды используют: дистиллированную воду по ГОСТ 6709;

агар-агар по ГОСТ 17206;

пептон по ГОСТ 13805;

сыворотку кровн кролика или барана;

гемоглобин.

Среду готовят следующим образом: к 900 см3 дистиллированной воды добавляют 100 см3 фосфатной буферной смеси Зорен-сена, тщательно перемешивают, добавляют 10 г агар-агара и 1 г пептона и нагревают в водяной бане до их расплавления, разливают во флаконы н стерилизуют при 120 °С в течение 15 мин, охлаждают до 50- 45 °С, добавляют 10 % инактивированной сыворотки кровн кролика или барака и 1 % гемоглобина (гемоглобин готовят растворением 1 объема эритроцитов в 20 объемах дистиллированной воды с последующим фильтрованием через фильтр Зейтца), разливают в чашки Петри по 40 см5, выдерживают для проверки на стерильность 24 ч при комнатной температуре.

Допускается применение других питательных сред, обеспечивающих хороший рост и сохранение свойств лептоспир.

Сывороточные питательные среды .предназначены для культивирования штаммов лептоспир, используемых в диагностических исследованиях и при изготовлении биопрепаратов, синтетиче-

Страница 20

€. Ifl ГОСТ 2S3M-9I

ские — для выделения лептоспир, в основном серогрупп Sejroc. Hebdomadis, Mini из патологического материала и для разового получения расплодок при изготовлении вакцины, полужидкие — для сохранения штаммов лептоспир, длительного культивирования посевов из первичного материала, плотные — для очистки коитаминнрованиых штаммов, изучения диссоциации лептоспир.

2.2.2.14.    Обработка стеклянной посуды, резиновых изделий

Пробирки, колбы, флаконы, бутыли, сифоны из обычного стекла, не бывшие в употреблении, обрабатывают по следующей схеме:

промывают проточной водопроводной водой;

выдерживают в течение суток в 1 %-ном растворе соляной кислоты в стеклянной или эмалированной посуде;

промывают проточной водопроводной водой и помешают на 1 — 2 ч в мыльный раствор;

тщательно промывают проточной водой и ополаскивают дистиллированной водой;

заливают вымытую посуду дистиллированной водой и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 1 ч или выдерживают двое суток при комнатной температуре, ежедневно меняя воду;

слипают воду и посуду высушивают в сушильном шкафу;

закрывают ватно-марлевыми пробками н стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин.

Посуду из лейтралыюго стекла моют в мыльном растворе, промывают водопроводной и дистиллированной водой, сушат, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют.

Посуду, в которой уже выращивали лептоспнры, помещают для дезинфекции на сутки в 1 %-ный раствор соляной кислоты, моют в мыльном растворе, .затем в водопроводной и дистиллированной воде.

Стерильную посуду используют для расфасовки питательной среды в течение 10 сут. При более длительном хранении ее повторно стерилизуют.

Новы?, не бывшие в употреблении, резиновые и'чалги промывают г. проточной иоде, кипятят в течение 30—45 ы:ш в 2 %-иом раствспг питьевоЛ соды, промывают водопровод^ водой и снова кчп»~ят в дистиллированно:": воде 30—4и мни, затем просушивают.

Рс-ниовые пробки обрабатывают по этой же мстоднье.

2.2.2.15.    Приготовление препаратов для микроскопических исследований

Г1 реп?рты для микроскопических исследований готовят в виде раздавленной капли. Исследуемый материал наносит пипеткой или бактериологической петлей на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воз-

Страница 21

ГОСТ 253*8 - 9» С I»

духа. На одном предметном стекле готовят две-трн раздавленных

капли.

Мочу исследуют непосредственно после взятия или после центрифугирования. Прозрачную мочу, не содержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц, центрифугируют при 10000—12000 об/ман в течение 30 мин, сливают над-осадочиую жидкость, осадок ресуспенди-руют в оставшейся капле мочи и мнкроскопируют.

Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, очищают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, затем сливают надосадочную жидкость и центрифуги-руют ее для осаждения лелтоспир при 10000—12000 об/мин в'течение 30 мин.

При бессимптомном течении лептоспнроза суспензию ткани готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении, кроме того, из печени н других органов. У абортированного плода микроскопнруют суспензию из всех органов.

Кусочки исследуемого органа массой 2—3 г растирают в ступке с 5—7 см3 питательной среды, физиологического раствора или стерильной воды до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 1—2 ч или центрифугируют при 3000 об'мин в течение 10 мин и мнкроскопируют надосадочную жидкость.

2.2.3. Проведение исследований

2.2.3.1. При проведении микроскопических исследований не-следуемый материал мнкроскопируют в темном ноле микроскопа при увеличении 40X7—10 или 20x1,5x7, а для более детального рассмотрения препарата — при увеличении 40X10—15 или 40X1.5X10.

В каждой капле просматривают не менее 50 полей зрения.

Наличие лептоспир устанавливают по следующим признакам:

Типичные лептоспиры представляют собой спирале.’одобные .онкие серебристые нити, концы которых, оба или один, загнуты и булавовидно утолщены. Встречаются и бсскрючковыс формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. В жидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейное поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговое.

В к::слой моче с pH 5.0—6,0 лептоспиры быстро утрачивают подвижность и погибают. Некоторые мертвые клетки сохраняют Форму, типичную для лептоспир, но у них по длине те.га бывает иициа зернистость, концевые крючки довольно часто распрямлены.

Лептоспиры дифференцируют от нитей фибрина» обломков хвостовых частей спермнев, разрушенных эритроцитов, спирилле-

Страница 22

С. 20 ГОСТ 25366-91

вибриоподобных и других микроорганизмов, а у хряков н от ин-терспнр.

2.2.3.2.    Методом посева в питательные среды лептоспиры из крови животных выделяют в первые 5—7 сут болезни в период лихорадки. Для этой цели кровь из яремной вены или ушной вены вносят через стерильную иглу по 3—5 капель в 5—7 пробирок с питательной средой или высевают из пробы крови, присланной в лабораторию.

От трупа пр-и диагностическом убое высевают пастеровской пипеткой кровь из сердца, ткани печени и почки, а от абортированного плода, кроме того, и из содержимого желудка. При убое клинически здоровых животных высевы делают из почки и мочевого пузыря. Из каждого органа засевают 3—5 пробирок с питательной средой.

Для выделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают, пипетку вводят параллельно поверхности в корковый слой. Высев делают у крупного рогатого скота из 2—3 долей, у свиней — из нескольких участков почки.

Высевы из других органов делают пастеровской пипеткой, которой насасывают материал, предварительно прижигая поверхность органа шпателем.

Мочу, ликвор, околосердечный и брюшной транссудат и другие жидкие биосубстраты засевают по 1—3 капли в 3 -5 пробирок с питательной средой.

Посевы культивируют при 28—30 °С в течение 3 мес. Лептоспиры, размножаясь в питательной среде, не изменяют ее внешнего вила. Поэтому для выявления роста лептоспнр через 3, 5, 7, 10 и далее каждые 5 сут культивирования из всех пробирок мнк-роскопируют капли, которые наносят на предметное стекло бактериологической петлей. Большинство культур вырастает через 7—20 сут.

Иногда лептоспиры обнаруживают в среде на 3—5-е сутки или через I—2 .мес и очень редко —через 2 -3 мес культивирования.

Содержимое каждой пробирки, в которой обнаружены леп-тоспнры, пересевают в 3—5 пробирок со свежей питательной средой. Пробирки с обильным ростом посторонней микрофлоры выбраковывают. остальные пересевают на питательные среды с антибиотиками или лептоспиры подвергают очистке.

2.2.3.3.    Выделенные культуры лептоспнр идентифицируют с помощью леитоспирозных групповых агглютинирующих сывороток в перекрестной реакции мнкроагглютинации в соответствии с п. 2.1.1.2 и наставлением по применению агглютинирующих лептоспирозных сывороток, при необходимости в реакции иммуноадсорбции или методом моноклональных антител.

Пересевы культур лептоспнр проводят пастеровскими пипетками.

Страница 23

ГОСТ 25386-91 С 21

В пробирку с 5—10 см* питательной среды вносят 0,5—1,0 см* культуры. Максимальное накопление лептоспир наблюдается через 4—7 сут культивирования при 28 -30°С.

Рост и чистоту культур лептоспнр в жидких питательных средах контролируют микроскопически в темном поле микроскопа и макроскопически — просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При этом после встряхивания в питательной среде четко просматриваются муаровые волны, образуемые выросшей культурой.

Культуру лептоспнр пересевают через каждые 12—15 сут не менее чем в три пробирки.

Штаммы лептоспнр, постоянно поддерживаемые в лаборатории, хранят в пробирках под вазелиновым маслом, в запаянных ампулах, в морозильной камере при минус 60—70 ЭС или при температуре жидкого азота минус 1% “С. Лептоспиры консервируют любым из этих методов после выращивания и сывороточной среде до максимального накопления.

В пробирку на культуру «наслаивают I—1,5 см1 стерильного вазелинового масла или культуру расфасовывают в стерилыше ампулы из нейтрального стекла вместимостью 1—5 см* и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре без пересевов в течение 3 мес.

Для хранения в замороженном состоянии культуры расфасовывают в ампулы, запаивают, охлаждают до 0—4 и помещают в сосуды Дьюара, заполненные азотом, или в морозильную камеру. В жидком азоте лептоспиры хранят без пересевов в течение года, при этом они заметно не изменяют биологических свойств.

Культуры лептоспнр, контамннированные другими микроорганизмами, очищают биологическим методом, фильтрацией через бактерийные фильтры или пересевом на плотные питательные среды.

Для очистки биологическим методом загрязненную культуру вводят виутрибрюшинно морской свинке или крольчонку в дозе 1—2 см8, хомяку или мыши — 0,5 см1. Через 30—60 мин кровь из сердца зараженного животного высевают в пробирки с питательной средой, культивируют и ведут наблюдение, как указано выше.

Для очистки методом фильтрации загрязненную культуру фильтруют через асбестовые стерилизующие пластины марки СФ или свечи Шамберляна Л-5. Фильтрат рассеивают в 5—10 пробирок с питательной средой. В высевах из фильтрата получают чистую культуру лептоспир.

Очистку культур лептоспир на плотной питательной среде проводят рассевом исследуемого материала шпателем в несколько чашек Петри. Культуры лептоспир, обильно контамннированные

Страница 24

С 22 ГОСТ 2538ft—91

посторонней микрофлорой, разводят физиологическим раствором к из каждого разведения делают высев в чашки Петри на плотную питательную среду. Чашки заклеивают лейкопластырем и посевы культивируют при (28±1) °С. Колонии лептоспир появляются на 7—20-е сут культивирования в толще или у поверхности среды и имеют вид прозрачных мелких дисков с хорошо очерченными или размытыми краями, увеличивающихся в размере до 1—2 см или в виде матовых точек диаметром 1—2 мм Колонии переносят пастеровской пипеткой или бактериологической петлей в жидкую среду и культивируют в термостате до появления роста.

2.2.3.4. Серовариантную принадлежность изоляторов лептоспир изучают в реакции иммуноадсорбции, для чего после установления серогрупповой принадлежности в перекрестной РМА определяют степень антигенного родства каждого испытуемого штамма со всеми штаммами-эталонами, входящими в состав данной серогруппы. Для этого с одной стороны исследуют испытуемый штамм со всеми агглютинирующими эталонными сыворотками данной серогруппы, с другой — антисыворотку к штамму* изоляту исследуют со всеми эталонными штаммами этой же серогруппы. Отбирают для сравнения с изучаемым штаммом в перекрестной реакции иммуноадсорбции штаммы-эталоны и антнсывороткн с ним, реагирующие хотя бы с одной стороны на 10 % гомологичного титра.

Для проведения адсорбции штаммы выращивают во флаконах в течение 7—15 сут при 28 —30 °С до накопления 80—150 лептоспир в поле зрения при увеличении микроскопа 40X1,5X10. Культуру осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин Надосадочную жидкость сливают, осадок в каждом центрифужном стакане тщательно подсушивают и к осадку трехкратно с интервалом 10 мин добавляют 1 см3 исследуемой сыворотки, предварительно разведенной физиологическим раствором 1:10. после чего пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают при 3—5 °С в течение 24 или 48 ч. Для использования в реакции иммуноадсорбции испытуемые сыворотки подводят к стандартному титру 1:3000 по отношению к гомологичной культуре. После выдерживания смеси в условиях рефрижератора лептоспнры осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мни, получают истощенную сыворотку, которую исследуют на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту (контроль). При положительных результатах контроля в разведении 1:30 и выше проводят дополнительную адсорбцию сыворотки штаммом адсорбентом с последующим повторным контролем на полноту истощения сыворотки. Сыворотку истощают до получения отрицательных результатов контроля. При отрицательных результатах реакции сыворотку не-

Страница 25

ГОСТ 25386-91 С. 23

следуют с гомологичным и гетерологичным антигенами. Разведения исследуемой сыворотки с каждым антигеном составляют 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000, последний принимают за 100 %, а каждое разведение соответственно составляет I, 3, 10, 33 и 100 % титра испытуемой сыворотки. Наряду с трехкратным разведением сыворотки используют двукратные разведения.

Испытуемую культуру лептоспнр относят к тому серовару, адсорбция которым позволяет добиться полного истощения исследуемой сыворотки.

Два штамма относит к разным сероварам, если после перекрестной адсорбции адекватным количеством гетсрологнчного антигена 10 % нлн более гомологичного титра постоянно остается при повторных исследованиях хотя бы н одной из двух сывороток.

Серогрупповую или серовариантную принадлежность культур лептоспнр также устанавливают методом моноклональных ан* тител. Для чего моноклональные антитела с серогрупповой или серорариаптной специфичностью соединяют с адекватным количеством испытуемого антигена, пластины инкубируют при (37±1) вС о течение 30 мин. Учет реакции проводят под микроскопом с конденсором «темное поле». Положительные результаты реакции позволяют отнести испытуемый изолятор к тому мо-поклону, с которым получена данная реакция. Использование моноклональных антител позволяет быстро (до I ч) и точно установить серовариантную принадлежность лептоспнр.

2.2.3.5. При постановке биологической пробы используют золотистых хомяков в возрасте 20—30 сут. крольчат соеунов в возрасте 10—20 сут и морских свинок в возрасте 21—35 сут.

Морские свинки наиболее чувствительны к лептоспирам Ictero-haemorrhagiae, r меньшей степени — к Pomona и мало чувствительны к лептоспирам других серологических групп.

Лабораторных животных заражают кровью, мочой, суспензией из паренхиматозных органов животных (абортированного плода) или спермой. Исследуемый материал вводят подкожно или .мутрибрюшинио хомякам от 0,3--0,5 до I cms, крольчатам — от 2 до 3 см1.

На каждую пробу исследуемого материала берут по два зверьки: одного из них убивают на 4-5 сут, период подъема температуры, другого, если он не погибнет, на 14—16-е сут после заражения. Кронь последнего исследуют в РМА, начиная с раз-ведения 1:10 с лептоспираии 15 серологических групп. Положительная РМЛ свидетельствует о наличии лептоспнр в исследуемом материале.

Высевы из убитых и павших зверьков делают из сердца, печени и почки в 2—3 пробирки из каждого органа. Вторую ночку, кусочки печени, транссудат из грудной и брюшной полостей, око-

Страница 26

С 24 ГОСТ 25386- 91

лосердсчную жидкость и содержимое мочевого пузыря микрос-копируют.

Культуры лептоспир чаще удается выделить из органов зверьков, имеющих клинические признаки болезни, проявляющиеся лихорадкой, отказом от корма, вялостью, дрожью, взъерошен-ностью шерсти, коньюктивитом, желтушностью видимых слизистых оболочек и т. д.

У крольчат и морских свинок после заражения проводят термометрию. В период лихорадки кровь для микроскопии и посева берут из уха или сердца.

В качестве биологической модели для обнаружения леитоспир используют также взрослых кроликов и морских свинок. Предварительно кровь животных исследуют в РМА на наличие специфических антител. Животных, в сыворотке крови которых не обнаружены специфические антитела, заражают исследуемым материалом. Кровь зараженных животных исследуют 2—3 раза через каждые 7 сут в РМА, начиная с разведения 1:10 с лептос-пирами 15 серологических групп. Обнаружение в сыворотке крови зараженных животных специфических антител свидетельствует о наличия лептоспир в исследуемом материале и позволяет ориентировочно судить об их серогрупповой принадлежности.

Вирулентность выделенной культуры изучают на золотистых хомяках нли крольчатах, которых заражают внутрибрюшинно 5—7-дневиой культурой, содержащей 70—100 леитоспир в поле зрения микроскопа. Высоковирулентные культуры лептоспир вызывают гибель золотистых хомяков в дозе менее 0,1 см1, средней вирулентности — 0,2—0,4 см3 и слабовирулентные — 0,5-1,0 см1.

2.2.3.6. Диагностика лептоспироза может проводиться с помощью флуоресцирующего глобулина, предназначенного для выявления лептоспир независимо от серогрупповой принадлежности в крови, паренхиматозных органах, транссудате из грудной м брюшной полостей, перикардиальной и спинномозговой жидкостях, моче больных и павших животных, органах и тканях абортированного плода, в ноде н почве.

Сухой глобулин разводят стерильной дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Растворенный глобулин дополнительно разводят физиологическим раствором с pH=7,4—7,6 до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы, переносят в стерильную пробирку, консервируют мертиолятом в соотношении 1:10000    (0,1 см'

1 %-ного раствора мертиолята на 10 см1 глобулина), закрывают резиновой пробкой и хранят при температуре 2—10 °С. Такой глобулин можно использовать в течение месяца при соблюдении условий хранения. Рабочий раствор глобулина без кон-

Страница 27

ГОСТ 25386-91 С. 25

серванта можно использовать в течение 5 сут. храня его при температуре 2—5 °С.

Препараты из исследуемого материала готовят на тщательно обезжиренных и хорошо промытых предметных стеклах. Новые предметные стекла заливают раствором нашатырного спирта (на 1000 см1 дистиллированной воды 10 см’ нашатырного спирта) на 10 мин, протирают марлевым тампоном, не касаясь поверхности стекол пальцами и два-трн раза перекладывают в свежий раствор. Перед использованием стекла вынимают из раствора и высушивают на воздухе.

Использованные стекла кипятят 2 ч в дистиллированной воде с добавлением двух столовых ложек стирального порошка на 5 дм* воды. Многократно промывают дистиллированной водой, не касаясь поверхности стекол пальцами, затем отмывают в растворе нашатырного спирта так же, как при обработке новых стекол.

Мазки из мочи, крови, суспензии органов, полосных жидкостей, воды, культуры и т. п. на предметном стекле делают на площади около 2,0Х2,5 смг, обводят восковым карандашом на обратной стороне стекла, высушивают при комнатной температуре.

Прозрачную мочу (не содержащую кристаллов соли, спер* миев и других посторонних частиц) центрифугируют при 8000—10000 об/мин d течение 30 мин (для осаждения лептоспнр), сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в оставшейся капле мочи и наносят на предметное стекло для последующего высушивания и окраски.

Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, сначала очищают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, сливают надосадочную жидкость н центрифугируют ее для осаждения лептоспнр при 800О—10000 об/мин в течение 30 мин, сливают надосадочную жидкость и делают мазок из ресугпендированного осадка. Для исследования пригодна только свежая моча, хранившаяся не более 10—12 ч при температуре не выше 20 °С. При более высокой температуре допускается хранение мечи до б—8 ч.

Кровь, взятую от больного, подозрительного по заболеванию или подозреваемого в заражении животного, смешивают с двойным количеством 1,5 %-ного раствора л и мои но-кислого натрия, центрифугируют при 3000 об/мин п течение 10 мин или отстаивают в течение 1 ч. Препараты готовят из прозрачного ладосадоч-ного слоя жидкости. Целесообразно осаждение лептоспир из иадосадочиоП жидкости проводить центрифугированием при 8000—10000 об/мин в течение 30 мин.

Суспензию из органов павших (убитых) животных при бессимптомном течении лептоспнроза готовят из коркового слоя

Страница 28

С. *6 f ОСТ 2S3M—81

почек, при остром течении -- из ткани почек и печени. У абортированного плода готовят и исследуют суспензию из всех органов. Патологический материал должен быть взят и исследо-нан в течение 6 ч в летнее время и 10—12 ч при условии хранения его в охлажденном состоянии. Вероятность выделении леп-тоспир в более поздние сроки снижается.

Кусочки исследуемого органа массой 2—3 г растирают в ступке с 5—7 см3 питательной среды или физиологического раствора, или стерильной воды до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 1—2 ч или центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин и делают мазки из надосадоч-ной жидкости.

Препараты из транссудата из грудной и брюшной полостей, содержимого желудка плода и других жидких субстратов готовят по той же методике, что и из мочи. Препараты из культур лептоспир готовят без предварительной обработки путем нанесения на стекло капли культуры.

Пробы воды для исследования центрифугируют при 8000—10000 об/мни в течение 30 мин, сливают    и а досад очную

жидкость, а осадок ресуспенднруют в капле надосадочной жидкости и наносят на предметное стекло.

Мазки высушивают при комнатной температуре, фиксируют ацетоном 5 мин или этиловым спиртом 15 мин и снова высушивают на воздухе

Лля окрашивания препараты размешают горизонтально на мостике. На каждый мазок наносят 3—5 капель разведенного флуоресцирующего глобулина, распределяют его по всей поверхности мазка и выдерживают его при комнатной температуре 20 мин. Для лучшего окрашивания препараты следует периодически покачивать. Затем глобулин сливают.

Препараты промывают водопроводной водой и физиологическим раствором (рН*=7,4—7,6) по 5 мни, меняя за это время раствор 4—5 раз. Затем препараты промывают в таком же порядке дистиллированной водой, воду стряхивают и мазки подсушивают на воздухе или используя обогреватель с вентилятором. После этого на мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и 1 части 0,б5 М фосфатного буфера (pH = 8,0, накрывают покровным стеклом, плотно прижимают его к предметному стеклу, удаляя излишки забуферен-ного глицерина).

Для контроля готовят 2—3 мазка одного из диагностических штаммов лептоспир и окрашивают их параллельно с мазками из патологического материала.

Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом или биологическим микроскопом.

Увеличение 7X90, сила тока 4.1 А. Микроскопнруют через

Страница 29

ГОСТ2М86—91 С. 27

нефлюоресцирующее масло или его заменитель, приготовленный из химически чистого диметилфталата (100 см1) н нафталина сублимированного (1,75 г) или тимола чистого (5,0 г).

Окрашенные флуоресцирующим глобулином лептоспиры имеют зеленоватое, несияющее свечение всей поверхности микроба (в отличие от контурного сияющего свечения микробов других видов). В препарате лептоспиры сохраняют свою форму, просматриваются отдельные вторичные (первичные не видны) завитки спирали, но, как правило, не видны характерные для яшвых лептоспир булавовидные утолщения на концах, наблюдаемые при темнополыюй микроскопии.

Диагноз устанавливают по морфологии лентоснир и интенсивности их свечения, оцениваемой в крестах:

4-++ — четкое зеленоватое свечение;

+    умеренное    зеленоватое    свечение;

+    —    зеленоватые    «тени»;

— «ет форм, характерных -для лептоспир.

2.2.4. Оценка результатов

2.2.4.1.    По результатам бактериологических исследований диагноз на леитосиироз считают установленным, а хозяйство неблагополучным но лсптоспирозу н любом из следующих случаев:

лептоспиры обнаружены при микроскопическом исследовании в крови или суспензии из органов животных, абортированном плоде, моче или органах лабораторного животного;

при обнаружении метолом флуоресцирующих антител в патологическом материале микробов с морфологией, типичной для лептоспир с интенсивностью свечения не менее чем в два креста ( + + );

культура лептоснир выделена из патологического материала или из органа лабораторного животного, зараженного исследуемым материалом.

Лелтоспироз считают причиной гибели животных при наличии клинических ир»изнаков и патологических изменений, характерных для лептоспирозэ, специфичность которых подтверждена обнаружением лентоснир в крови или паренхиматозных органах.

Лептоепнроз считают причиной абортов при обнаружении лептоспир в органах (тканях) абортированного (мертворожденного) плода.

2.3. Гистологический метод

Метод основан на обнаружении лептоспир в гистологических срезах, импрегнированнмх серебром.

2.3.1.    Апг.аригура. реактивы, материалы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, реактивы и растворы по и. 2.2.1 со следующими дополнениями:

Страница 30

С 28 ГОСТ 2538ft- 91

Кислота пирогалловая.

Серебро азотнокислое, 1—3 %-ный раствор.

Формалин, 40 %-ный.

Спирт этиловый ректификованный % %-ный по ГОСТ 18300!

Спирт метнлсалнцнловыА.

Ксилол.

Парафин.

2.3.2. Проведение исследований (метод Левадити)

Кусочки органов фиксируют в 10 %-ном водном растворе нейтрального формалина в течение 24—48 ч. После фиксации кусочки переносят в 96 %-ный этиловый спирт на 24 ч. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, пока кусочки не осядут на дно бюксы (не менее 2—3 ч). Воду меняют три раза. Затем кусочки помешают в 1—3 %-ный раствор азотнокислого серебра на 3—б ч. Процесс серебрения ведут при (37*1) °С. Раствор азотнокислого серебра готовят на свежей дистиллированной воде и используют из расчета 15 см* раствора на один кусочек.

Промывку проводят в дистиллированной воде в течение 2—5 мин. После промывки кусочки переносят в небольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 мин (раствор быстро темнеет) и затем помешают их в приготовленный перед употреблением основной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота — 4 г, дистиллированная вода — 100 см3, формалин чистый — 5 см1. Раствор готовят из расчета 20—25 см3 на один кусочек ткани. Восстановление обязательно проводят в банке из темного стекла.

Пробы выдерживают в редуцирующей смеси 24—48 ч при комнатном температуре в темном месте или банке из темного стекла. Затем их промывают и дистиллированной воде 1—2 ч.

Ирепараты обрабатывают последовательно. выдерживая в спиртах по следующей схеме:

96 %-ный этиловый спирт (спирт 1)    1 сут;

96 % ный    »    *    (спирт 2) — 1 сут;

% %-ный    »    »    (спирт 3) - 1 сут;

смесь этилового и метнлсалинилсвого спиртов в равных объемах до опускания кусочков на дно посуды:

метнлеялициловый спирт — 12 ч.

После спиртовой проводки кусочки ткани выдерживают при (57±1) °С в смеси ксилола с парафином (1:1) — 30 мин, затем в парафине 1—60 мил и парафине 2 — 60 мин. Из быстро остуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянный кубик. Готовят тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают на предметное стекло, лена рафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10- 15 мин в каждом и заключают иод микроскопом <м светлопольным конденсором при увеличе-

Страница 31

ГОСТ 253W-9I С. 29

мни 90x7—10. При неудовлетворительных результатах ипрегна-цни лептоспнр готовят препараты из других одновременно приготовленных блоков.

2.3.3. Оценка результатов

При микроскопии гистосрезов лептоспиры обнаруживают чаще на поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже — цитоплазме эпителия, преимущественно группами.

Типичные лептоспиры всегда окрашены в черный цвет, имеют S образную форму с 1—2 изгибами или змеевидную форму с грубыми толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Окружающая ткань окрашивается в буровато-желтый цвет.

По результатам гистологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство неблагополучным по лептоспирозу, если лептоспиры обнаружены в гистологических срезах импрегнированных серебром, приготовленных из почек или печени животных.

Лептоспироз считают причиной абортов, если лептоспиры обнаружены в гистосрезе из органов абортированного (мертворожденного плода).

Страница 32

С. 30 ГОСТ 253*6—91

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия

РАЗРАБОТЧИКИ

Ю. А. Малахов, Г. J1. Соболева

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Ко митета стандартизации и метрологии СССР от 27.12.91 Л 2240

3.    СРОК ПРОВЕРКИ - 1996 г.

4.    ВЗАМЕН ГОСТ 25386-82

5.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

О&эзкачяне НТД. ' м который ДА * ссылка

НОМСр nv.IKTi

1

06э>и»ч.ик<- IIIД.

Ilk KOI ОДОЙ *»..«

сема»*

ny.au?л

ГОСТ 199-78

2.2 2.6; 2.22.1

ГССТ 4523 -77

2.2.2 7; 2 2.2.10:

ГОСТ 245-76

22.2.9: 2 2.2.1

2.2.2.11

ГОСТ 1770-74

2.2 2 1; 22.2.3,

ГОСТ 6259 -75

22.2 7; 2.2.2 8.

2.2.2 4; 2.2.26

2 2.2. Ш; 2.22.11

ГОСТ 3118-77

2.22 7

ГОСТ 6709-72

2 2.2.2.; 222 3;

ГОСТ 3159 76

2.2.27

2.2.2.4-: 2.2 2.5;

ГОСТ 3773-72

2.2 2.8; 22.2.9;

•J.2.2.6; 2 2 27:

2.2.2.10

2.2 2.8; 2.2.2. Я;

ГОСТ 4165-78

2 22.8; 22.29.

2.2 2 13

2.22.11

ГОСТ 8074- 82

2 1.1.1

ГОСТ 4174-77

2.2 2.8: 2.2.2 9;

ГОСТ 9281 75

21.1.1

2.2.2.10; 2 2.2.11

ГОСТ 10075-75

2 2.2.2. 2.2,2 6;

ГССТ 4М8—ТВ

2 2.28; 2.2.29;

1

2 2 2.7

С.12.10; 2.2 2.11

. ГОСТ 11773-76

2 2.2.2. 2 2.2 6;

ГОСТ 4198-75

„ 22 2.9; 222.10

2 22.7

ГОСТ 4209 -77

■ 2.2.2 А 2.3.2.10.

ГССТ 12026- 76

22.2.4 2 2.2 6

2.22.11

1 ГОСТ I380S 76

222.13

ГССТ 4233-77

2.1.1 1; 2.22.1;

I [ ОСТ 16280-88

2?.2.5

2 2.2 6. 22 2 8:

ГОСТ 17206 84

2.22.5; 2.2 213

2.22.9; 2.2.2.10

ГОСТ 18300-87

2.3.J

ГОСТ 4234-77

2.2.26

ГОСТ 20292 74

2 1.1.1

ГОСТ 4329-77

222.10

i ГОСТ 22967- 82

2 2 2.1

I ГОСТ 25336 82

22.2 5

Заменяет ГОСТ 25386-82