Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

32 страницы

456.00 ₽

Купить ГОСТ 25386-91 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни - лептоспироза, вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans

  Скачать PDF

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Методы исследования

Показать даты введения Admin

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ стандарт СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ лабораторной диагностики ЛЕПТОСПИРОЗА

ГОСТ 25386-91

БЗ 9-91/1051


Издание официальное

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР Москва

Редактор Т. И. Василенко Технический редактор Г. А. Теребинкина Корректор А. И. Зюбан

Сдано в наб. 29.01.92. Поди, в печ. 11.03.92. Уел. п. л. 2.0. Уел. кр отг. 2.0. Уч.-ичд. л, 2.10

Тираж 464.

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123667, Москва. ГСП. Новопресненский пер.. 3.

Калужская типография стандартов, ул. Московская. 236.

УДК 636.9.001 4:006.354    Группа    С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ГОСТ

25386—91

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

Методы лабораторной диагностики лептоспироза

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of leptospirosis

ОКСТУ 9809

Дата введения 01.01.93

Настоящий стандарт распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни— лептоспироза, вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans.

Диагноз на лептоспироз устанавливают на основании эпизо-отологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным подтверждением диагноза лабораторными исследованиями.

I. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1.    Материалом для исследований служит кровь, моча, органы и ткани, а также трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паранхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым, сердце и паренхиматозные органы плода.

1.2.    Кровь для серологического исследования берут в количестве 5—10 см3 не ранее чем через 5—7 сут после проявления клинических признаков болезни или через 90 сут — для крупного рогатого скота, 60 сут — для свиней и животных других видов после введения вакцины. Кровь для бактериологического исследования берут в период лихорадки на 1—7 сут болезни.

Издание официальное

© Издательство стандартов, 1992

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта СССР

1.3.    Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чис-тые пробирки. У коров и свиноматок допускается брать мочу катетером.

Мочу микроскопируют непосредственно в хозяйствах.

1.4.    Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа заворачивают в целлофановый пакет.

1.5.    Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пинеткой в стерильные пробирки.

1.6.    Пробами для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени объемом не более 1 см3, консервированные 10 %-ным раствором формалина.

1.7.    Пробы патологического материала должны быть исследованы с момента взятия в течение 6 ч в летнее время и 10—12 ч при хранении его в охлажденном состоянии.

1.8.    Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре: 30—40 °С в течение 3 ч, 25—30 °С— 4—5 ч, 20—25 °С — 6—8 ч, 16—20 °С — 10—12 ч с момента взятия.

1.9.    Взятые пробы помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным (курьером).

В сопроводительном документе к пробам патологического материала указывают время гибели животного или время взятия проб при жизни.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.    Серологический метод

Метод основан на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинации (РМА) и реакцией иммуноадсорбцин (РИЛ).

2.1.1.    Реакция микроагглютинации

2.1.1.1.    Аппаратура, материалы, реактивы Термостат, обеспечивающий регулирование температуры на

28-30 °С.

Центрифуга со скоростью вращения не менее 10000 об/мин. Микроскоп биологический по ГОСТ 8074.

Конденсор темного поля.

Осветитель с точечной лампой.

Стекла предметные толщиной 0,8—1,1 мм и покровные (стекла, используемые для микроскопии, должны быть бесцветными, прозрачными, чистыми, без царапин и бликов) по ГОСТ 9284. Пластинки с лунками или пробирки Флоринского.

Штативы.

ГОСТ 283W—С. 3

Пипетки градуированные вместимостью 1,2, 5 я 10 см3 по ГОСТ 20292.

Аппарат Флоринского.

Петля бактериологическая.

Натрий хлористый х. ч. по ГОСТ 4233 или ч. д. а. 0,85 % -ный раствор в дистиллированной воде. Раствор разливают во флаконы или бактериологические пробирки и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С в течение 30 мин.

Антигены — живые культуры штаммов лептоспир, указаны в таблице.

Серогруппа

Ссровар

l скомснд>с%ыс штачмы*

Pomons

pomona

Pomona

Tarassovi

tarassovi

Perepelicin (Mitis Johnson)

Grippoiyphosa

grippotyphosa

Moskva V (Valbuzzi)

Hcbdomadis

kabura (borincana,

Kabura (HS—22,

hcbdomadis)

Hebdomadis)

Sejroe

polonica (sejroe,

493 Poland (M~84,

wolffi, hardjo)

3705, Hardjoprajitno)

Mini

szwajizak

Szwajizak

Iclcrohaemorrhagiae

copenhageni

M—20, Waijnberg

(icterohaemorrhagiae)

(RrA)

Canicola

canicola

Hond Utrecht IV

Bataviac

djatzi (bativiae)

HS—26 (Van Tienen)

Javanica

poi (javanica)

Poi (Veldrat ^ataviac 46)

Australis

australis

Ballico

(bratislava)

(Iez Bratislava)

Autumnalis

autumnalis

(rachmat)

ballum (castellonis)

Akijami A (Rachmat)

Ballum

Mus 127 (Castcllon 3)

Pyrogenes

pyrogenes

Salinem

Cynopteri

cynopteri

Vleermuis 3.5ГУ& (35220

Panama

panama

CZ~£I4—К

Cclledoni

cclledoni

Cclledoni

Shermani

shermani

LT—8211

Djasiman

djasiman

Djasiman

Sarmin

sarmin

Sarmin

Louisiana

louisiana

LSU—1945

Ranarum

ranarum

ISF

Manhao

manhao

L 105

* В скобках приведены штаммы-аналоги Кроме рекомендуемых могут быть использованы и другие штаммы лептоспир

2.1.1.2. Подготовки к исследованию Предметные и покровные стекла, не бывшие в употреблении, кипятят в мыльном растворе в течение 30 мин, промывают про-

точной водой, ополаскивают дистиллированной водой и насухо протирают.

Стекла после употреблепия опускают в эксикатор с I %-ным раствором соляной кислоты или другим дезинфицирующим веществом. После накопления достаточного количества использованных стекол кислоту сливают, стекла промывают в проточной водопроводной воде, кипятят в мыльном растворе, промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и протирают.

Пластины с лунками после проведения в них реакции опускают для обеззараживания в 1 %-ный раствор соляной кислоты и выдерживают не менее 1 ч. Затем их промывают в теплой мыльной воде, протирают ершиком каждую лунку, тщательно отмывают в проточной водопроводной воде, заливают дистиллированной водой и выдерживают до следующего утра. Утром воду сливают и пластины просушивают.

Перед постановкой реакции каждую лунку дополнительно протирают тампоном из ваты.

Для исследований используют свежую, замороженную, высушенную на фильтровальной бумаге, консервированную фенолом или борной кислотой сыворотку крови.

Для консервации сыворотки фенол добавляют в виде 5 %-но-го раствора при постоянном помешивании из расчета 0,05 см3 <1 капля) на каждый кубический сантиметр сыворотки. Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.

При консервации сыворотки методом высушивания на квадраты белой фильтровальной бумаги (5X5 см) наносят по 3—5 капель (0,05 см1 каждая) сыворотки Высушивание проводят лри комнатной температуре или в термостате при температуре (37 — 1) °С Высушенные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца

Гсч'-'лг-’ированную, загнившую, плесневелую и проросшую сыворотку не исследуют

Сыворотку разбавляют физиологическим раствором

1)    невакцинированных животных 1:25;

2)    вакцинированных животных 150.

После добавления антигена разведения удваиваются и составляют соответственно- 1:50 и 1 100.

При необходимости сыворотку разбавляют в соотношениях 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. до титра.

Сыворотку крови вакцинированного крупного рогатого скота исследуют в РМА через 3 мес, животных других видов — через 2 мес после вакцинации

ГОСТ 2538в—9» С. 5

При исследовании сыворотки, высушенной на фильтровальной бумаге, вырезают одну или две капли (0,05 или 0,1 см3) сыворотки, измельчают ножницами и заливают в пробирке физиологическим раствором в объеме 2,45 или 4,9 см’, экстрагируют в течение 1 ч при температуре (37±1) °С.

Полученный экстракт используют как исходное разведение сыворотки 1:25 или 1:50.

Сыворотку крови животных при ввозе их в хозяйство и вывозе из него для племенных целей и целей воспроизводства разводят 1:25 и исследуют только в одном разведении (после добавления антигена разведение сыворотки будет соответствовать 1:50).

При изучении этиологической структуры и обследовании импортируемого скота реакцию ставят со всеми приведенными в таблице антигенами, при обследовании животных в хозяйствах с известной этиологией и при перевозках внутри страны реакцию ставят с антигенами 4—7 серогрупп (Pomona, Tarassovi, Canicola, Hebdomadis, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae).

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов не реже одного раза в год.

Пригодность культуры для использования в реакции оцени-ьают просмотром в проходящем свете и микроскопией. При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в среде в проходящем свете хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии наблюдается легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании посторонней микрофлоры, полная прозрачность среды — об отсутствии роста лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5—15 сут без признаков агглютинации и лизиса с накоплением 70—100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 40Х 1,5X7 или 40X7—10.

Через каждые 3 мес лаборатории контролируют диагностические штаммы лептоспир в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми агглютинирующими сыворотками.

2.1.1.3. /7роведение исследования

Для постановки РМА разведенную сыворотку разливают мерной пипеткой или аппаратом Флоринского, начиная с большего разведения, в лунки агглютинационных пластин или пробирки по 0,1 см’ в каждую.

Сыворотку из каждого разведения разливают в отдельный ряд, состоящий из 4—23 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 см3 в 1—3 лунки в зависимости от количества раз-ведений сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при 30—37 °С в течение 1 ч.

Контрольной служит смесь 0,1 см* культуры лептоспир с 0,1 смэ физиологического раствора. Лептоспиры в контрольном варнанте должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

Реакцию учитывают микроскопией капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20x10 или 40X7X1,5. Капли из лунок наносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли наносят двумя способами: бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и просматривают их под микроскопом; бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигая столик на 2—3 мм, и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. Перед взятием каждого нового антигена петлю прокаливают и охлаждают.

Результаты реакции оценивают в крестах:

-Ь4- + + — агглютинированы 100 % лептоспир;

+ + +    —    »    75 %    »

+ +    —    »    50 %    »

+    —    »    25 %    »

—    —    агглютинация    отсутствует.

Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3—5 до нескольких десятков и сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоспир, проявляющийся в набухании и прекращении движения клеток, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

2.1.1.4. Оценка результатов

Положительной считают РМД, оцененную на два креста и более при отсутствии агглютинации в контроле.

Наличие'специфических антител в сыворотке крови животных в т;.гре 1:10 у певакцинированных — 1:100 у вакцинированных и выше свидетельствует об инфицировании данной особи лептоспи-рами и возможном лептоспироносительстве.

РМА специфична в любом разведении, а наличие антител в любом титре свидетельствует об унифицировании данной особи лептоспирами и возможном лептоспироносительстве.

По результатам серологических исследований возбудителями лептоспироза считают лептоспиры той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Необходимо учитывать, что в сыворотке крови свиней, лошадей, крупного и мелкого рогатого скота при исследовании в РМА обнаруживают в 5—15 % случаев антитела в наиболее высоком

ГОСТ 25386-61 С. 7

титре к лептослирам: Autumnalis, Cynopteri, Bataviae, Pyrogenes, Australis, которые не выделяют у сельскохозяйственных животных. Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые.

Лептоспиры названных серогрупп могут быть признали возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только после выделения в чистой культуре или подтверждения их роли исследованием пробы сыворотки в реакции иммуноадсорбции.

В случае выявления реакций с лептоспирами необычных для сельскохозяйственных животных серогрупп проводят повторное исследование сыворотки крови в РМА с интервалом 10—12 сут с целью освобождения от межгрупповых реакций без проведения иммуноадсорбции.

2.1.2. Реакция иммуноадсорбции

2.1.2.1. Аппаратура, растворы и антигены

Для проведения исследования применяют аппаратуру, растворы и антигены, указанные в п. 2.1.1.1.

2.].2.2. Проведение исследования

В реакции иммуноадсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лептоспир нескольких серологических групп в разных титрах или имеющие наиболее высокий титр по отношению к лептоспирам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных.

Для проведения адсорбции выращивают во флаконах вместимостью 0,5—1,0 дм’ все штаммы лептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации, 5—7 сут культуры лептоспир осаждают центрифугированием с частотой вращения 10000 об/мин в течение 30 мин. Сливают надосадочную жидкость, осадок подсушивают, 0,1 смг исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 смг физиологического раствора и дробно в три приема с интервалом 10 мин добавляют к осадку антигена, суспендируя его после каждой порции разведенной 1:10 сыворотки. Смесь выдерживают в течение 24 —48 ч при 1—5 °С и отделяют сыворотку центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. Адсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту, а затем при отрицательных результатах исследуют с лептоспирами всех сецо-групп, с которыми реагировала сыворотка до адсорбции.

Для сокращения объема работы сыворотку целесообразно в начале адсорбировать лептоспирами, являющимися частыми возбудителями болезни у животных данного вида.

2.1.2.3 .Оценка результатов

В процессе адсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех серологических групп, в то время как антитела и возбудителю болезни не адсорбируются из сыворотки гетерологичными типами лептоспир.

Возбудителями инфекции являются лептоспиры той серо-группы, антигены которой извлекают из сыворотки антитела к лелтоспирам всех серологических групп.

2.1.3. Учет результатов серологических исследований

2.1.3.1.    По результатам серологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство (ферму, отделение и т. д.) неблагополучным по лептоспирозу, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании в РМА в титре 1:100 у вакцинированных и 1:50 и выше у невакцинированных более чем у 20 % обследованных животных.

2.1.3.2.    Лептоспироз считают причиной абортов при обнаружении антител в сыворотке крови абортированного плода и предположительно при высоком титре антител (1:2500 и более) в группе абортированных животных и низком титре (до 1:500) или отрицательной реакции в группе здоровых животных.

2.1.3.3.    Лептоспиры серогрупп Autumnalis, Cynopteri, Bataviae, Pyrogenes, Australis, Ballum могут быть признаны возбудителями лептоспироза животных только после выделения из органов павших животных или подтверждении их роли исследованием пробы сыворотки в реакции иммуноадсорбции.

2.2. Б а ктер иологически й метод

Метод заключается в обнаружении лептоспир в исследуемом материале путем микроскопии в темном поле микроскопа, имму-пофлуоресцентным методом, выделения культур лептоспир в специальных средах, постановке биологических проб на лабораторных животных, идентификации и дифференциации выделенных культур.

2.2.1. Аппаратура, материалы, реактивы

Для проведения исследования применяют аппаратуру, материалы и растворы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно:

Колбы или бутыли вместимостью 1, 2, 3, 5 дм$.

Сифоны с резиновыми шлангами.

Фильтры Зейтца или другие аналогичного типа.

Сыворотку крови кролика или барана, не содержащую специфических противолептоспирозных антител.

Среду сывороточную на фосфатном буфере.

Среду Уленгута (водно-сывороточную среду).

Среду Ферворта-Вольфа (в модификации С. И. Тарасова).

Среду Флетчера полужидкую.

Среду Кортгофа.

Среду синтетическую безбелковую Шенберга.

Среду твин (полисорбат) альбуминовую Эллингаузена.

Среду Эллингаузена.

Среду твин-альбумин-сывороточную Эллиса.