Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

19 страниц

396.00 ₽

Купить ГОСТ 25385-91 — официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на методы диагностики бруцеллеза животных.

  Скачать PDF

Заменен на ГОСТ 34105-2017 «Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Серологические методы» в части серологических методов диагностики; ИУС 11-2017
Действие завершено 01.07.2018

Оглавление

1 Методы отбора проб

2 Методы исследований

Показать даты введения Admin

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

ГОСТ 25385-91

БЗ 9—91/1046


Издание официальное

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР Москва

УДК 636.9.001.4:006.354    Группа    С7в

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ стандарт СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

Методы диагностики бруцеллеза    ГОСТ

Agricultural animals. Methods of diagnostics    25385_91

of brucellosis

ОКСТУ 9809

Дата введения 01.01.9S

Настоящий стандарт распространяется на методы диагностики бруцеллеза животных.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1.    Для бактериологического исследования берут абортированные плоды (от свиноматки не менее трех плодов) или их части (перевязанный желудок с содержимым, печень, селезенка), околоплодную жидкость, плодовые оболочки, молоко, содержимое гигром (бурситов), абсцессов, а от животных, убитых с диагностической целью — паренхиматозные и половые органы и лимфатические узлы.

Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют: от баранов — семенники с придатками; от овцематок — абортированные плоды с плодовыми оболочками.

Отобранные для бактериологических исследований пробы упаковывают в полиэтилен, целлофан или пергаментную бумагу, помещают в общую тару (ящик, пакет) и в тот же день отправляют в лабораторию.

Одновременно с материалом в лабораторию направляют кровь животного для серологического исследования и акт с анамнестическими данными.

1.2.    Для серологического исследования берут кровь из яремной вены (у свиней из ушной или хвостовой) в стерильные про-

Издапие официальное

(С) Издательство стандартов, 1992

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта СССР

бирки по 5—10 см5 от каждого животного или используют кровь, полученную при убое.

Пробирки маркируют, составляют опись проб и направляют в лабораторию.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

2.1.    Метод бактериологического исследования Сущность метода заключается в выявлении бруцелл в исследуемом материале путем определения характера роста выделенных культур микробов на питательных средах, их морфологии, тинкто-риальных, антигенных и патогенных свойств для морских свинок.

2.1.1.    Аппаратура, материалы и реактивы Гомогенизатор электрический бактериологический.

Инкубатор вакуумный.

Микроскоп иммерсионный с контрастным приспособлением или стереоскопический.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5, 10 и 100 см3 по ГОСТ 20292.

Прибор для получения С02.

Потенциометр или рН-метр.

Центрифуга лабораторная.

Эксикатор по ГОСТ 25336.

Чашки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пипетки пастеровские по ГОСТ 20292.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Масло иммерсионное для микроскопии.

Ножницы Купера (изогнутые).

Перчатки анатомические.

Пинцеты анатомические.

Шпатели.

Спиртовка.

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16280.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Глицерин по ГОСТ 6259.

D-глюкоза по ГОСТ 6038.

Спирт этиловый 96%-ный по ГОСТ 5962.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Генциан фиолетовый (генцианвиолет).

Йод металлический (кристаллический).

Калий йодистый.

Зелень малахитовая.

Кристаллический фиолетовый.

ГОСТ 25385-91 С. 3

Метиленовый синий.

Сафранин.

Фуксин основной.

Фильтр бумажный.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Кислота карболовая кристаллическая.

Кислота лимонная по ГОСТ 908.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Кислота серная по ГОСТ 4204.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрий уксуснокислый по ГОСТ 2080.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.

Паранитрофенилглицерин.

Сыворотка крови бычья или лошадиная (нормальная).

Набор компонентов для серологической дифференциации куль тур бруцелл.

Свинки морские массой 300—400 г.

2.1.2 Подготовка к исследованию

2.1.2.1.    Для приготовления карболового кристаллического фиолетового или генциан фиолетового для окраски по Граму берут 1 г кристалл- или генцианфиолетового, растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 96%-ного этилового спирта. После того как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

2.1.2.2.    Для приготовления раствора Люголя в 10 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают от 5 до 6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 смдистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.

2.1.2.3.    Для приготовления карболового фуксина Циля берут 1 г основного кристаллического фуксина, растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см3 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 смэтилового 96%-ного спирта. После того как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Перед работой к одной части карболового фуксина Циля прибавляют девять частей дистиллированной воды.

2.1.2.4.    Для проведения исследований используют также готовые стандартные растворы генциана фиолетового, Люголя, фуксина Циля, зелени малахитовой.

2.1.2.5.    Для приготовления сывороточно-декстрозного и кровяного агара на мясном экстракте вначале готовят питательный агар. К 1000 см3 дистиллированной воды прибавляют 15 г агара, 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 5 г мясного экстракта. Все ингредиенты помещают в сосуд и подвергают обработке текучим паром в течение 1 ч. Устанавливают pH 6,8. Затем автоклавируют при 127°С для выпадения фосфатов. Среду фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 7,4 и стерилизуют при 115°С в течение 15 мин.

Для приготовления сыворочно-декстрозной среды питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют 5% нормальной инактивированной лошадиной или бычьей сыворотки и 1% раствора декстрозы.

Для приготовления кровяной среды питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют от 10 до 20% дефибринированной крови нормальных телят, лошадей или овец. Смешивают и разливают в стерильные пробирки или бактериологические чашку.

2.1.2.6.    Для исследования на Brucella ovis приготовляют сы-вороточно-глицериново-декстрозный агар.

Расплавленный питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют к нему глицерина 2%, декстрозы 1% и сыворотки инактивированной 10—20%. Смешивают и разливают в стерильные пробирки или бактериологические чашки.

2.1.2.7.    Для приготовления печеночного настоя свежую говяжью печень освобождают от жира и пленок и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой (на 1 кг фарша — 1 дм3 воды) и настаивают при 25—30°С в течение 3 ч или при 4—10°С в течение 6—10 ч. Затем смесь подвергают обработке текучим паром в течение 20 мин или варят в котле 2 ч, постоянно помешивая и снимая накипь. После варки настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по бутылям и стерилизуют 30 мин при 112—115°С.

2.1.2.8.    Для приготовления печеночного бульона к 500 см3 печеночного настоя, приготовленного по п. 2.1.2.7, добавляют 500 смводопроводной воды, 10 г сухого пептона и 5 г хлористого натрия. Смесь кипятят, устанавливают pH 7,4 и фильтруют через фильтровальную бумагу, затем разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют 20 мин при 115—120°С. После стерилизации pH бульона должен быть 7,1—7,2.

2.1.2.9.    Для приготовления печеночного агара к 500 см3 печеночного настоя, приготовленного по п. 2.1.2.7, добавляют 500 смводопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г хлористого натрия

ГОСТ 25385-91 С. 5

и 25 г агара. Устанавливают pH 7,4 и варят до растворения агара. Затем автоклавируют при 115°С в течение 20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой). Устанавливают pH 7,1—7,2. Разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 мин.

2.1.2.10.    Для приготовления мазков из патологического материала требуются чистые обезжиренные предметные стекла. Абортированный плод вскрывают, поверхность паренхиматозных органов стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая тампоном, смоченным в спирте. Затем вырезают стерильными ножницами кусочки размером 1,5x1,0X1,5 см3 и прикладывают поверхностями срезов к предметному стеклу по три отпечатка на двух предметных стеклах. В таком же порядке готовят мазки нз котиледонов последа, лимфатических узлов и другого материала. Содержимое желудка плода и другой жидкий материал набирают пастеровской пипеткой и также готовят мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки. Один мазок из каждого объекта окрашивают по Козловскому или Stamp, другой — по Граму. Мазки микроскопируют.

2.1.2.11.    Для окраски мазков по Граму на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают карболовый генциан фиолетовый на 2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску и промывают водой, наливают на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают, наливают этиловый спирт на 0,5—1 мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным 1:10 фуксином Циля в течение 1—2 мин. Краску сливают, промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.12.    Для окраски мазков по Козловскому фиксированный мазок окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием до появления пузырьков. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают 0,75—1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 0,5—1 мин. Краску сливают, промывают водой, просушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.13.    Для окраски мазков по Stamp фиксированный мазок скрашивают в течение 10 мин раствором карболового фуксина Циля в разведении 1:10. Затем мазок промывают водой и дифференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают и докрашивают 1%-ным раствором метиленового синего в течение 20—30 с. Краску сливают, промывают водой, подсушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.14.    Для проведения посева из патологического материала кожу абортированного плода обжигают с поверхности по белой линии тампонами, смоченными спиртом, стерильными ножницами вскрывают брюшину и грудную клетку и пипеткой Пастера высе-

вают жидкое содержимое грудной, брюшной полостей и желудка плода, а также вырезают кусочки печени и селезенки размером не менее 2,0Х1,5Х2,5 см. Каждую пробу погружают в спирт и обжигают с поверхности, а затем помещают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан добавляют стерильный физиологический раствор в количестве, равном массе жидкой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Взвесь пипеткой Пастера по 0,1—0,2 см3 втирают в поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается предварительный высев материала в жидкие питательные среды (в пробирках).

При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы путем внесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках.

Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки менее загрязненный и без некротических участков, обрабатывают стерильным физиологическим раствором, подсушивают стерильным тампоном, обжигают на пламени и готовят из этого материала суспензию в электрическом гомогенизаторе. Суспензию засевают на чашки Петри со средой, содержащей препараты, задерживающие рост посторонней микрофлоры: генцианвиолет 1 :2000 000 или кристаллический фиолетовый 1 : 100 000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 см3 или паранитрофенилглицерин (0,005— 0,007%).

2.1.2.15. Для выращивания посевы помещают в термостат при температуре 37—38°С. При исследовании материала от крупного рогатого скота и баранов половину засеянных пробирок и чашек помещают в эксикатор с содержанием 10—20% С02 и выдерживают их в термостате при 37—38°С. Через каждые 3—4 сут пробирки с посевами просматривают визуально, при необходимости через лупу или под малым увеличением микроскопа в отношении роста бруцелл. При отсутствии роста бруцелл все посевы выдерживают в термостате до 20 сут.

2.1.3. Проведение исследования

2.1.3.1.    Бруцелл обнаруживают тремя методами исследований: бактериоскопией мазков из патологического материала; получением культуры бруцелл на питательных средах и постановкой биологической пробы на морских свинках.

2.1.3.2.    При бактериоскопии мазков из патологического материала, приготовленных по п. 2.1.2.10, обращают внимание на форму, размеры и расположение отдельных микробов и способность к элективным окраскам. Характерный вид бруцелл — мелких грамотрицательных, отдельно расположенных, не образующих спор кокко-бактсрий, окрашивающихся по Козловскому или Stamp в красный цвет, дает основание к предварительному заключению об обнаружении возбудителя бруцеллеза или инфекционного эпи-

ГОСТ *5385—81 С. Т

дидимита, которое требует подтверждение выделением чистой культуры или положительной биопробой.

2.1.3.3. При осмотре посевов, проведенных по п. 2.1.2.14, обращают внимание на характер роста микробов. В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение, а в дальнейшем пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

Из бульонной культуры делают посев в пробирку с плотной средой и готовят мазки. При микроскопировании препарата обнаруживают характерные для бруцелл кокко-бактерии.

На поверхности плотных питательных сред бруцеллы образуют прозрачные, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок. С возрастом колонии приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

Подозрительные колонии пересевают на скошенный агар в пробирках и двухсуточные культуры идентифицируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму, Козловскому или Stamp, агглютинации на предметном стекле с помощью набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл. В набор компонентов входят: R—сыворотка агглютинирующая бруцеллезная; S—сыворотка агглютинирующая бруцеллезная; R—антиген бруцеллезный цветной; антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы (РБП).

Для проведения пластинчатой реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл R и S—сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным карболизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке. Разведенные сыворотки можно использовать в течение месяца. R—антиген бруцеллезный цветной и антиген бруцеллезный для РБП в пластинчатой РА применяют неразведенными.

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R и S—сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру эмульгируют в каплях R и S— сывороток и в капле физиологического раствора. Параллельно в каждом опыте ставят контроль: R—сыворотки в рабочем разведении с антигенами цветными и для роз бенгал пробы;

S—сыворотки в рабочем разведении с цветным бруцеллезным антигеном и с антигеном для РБП.

При положительной РА в течение 1—3 мин в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе (контрольном) наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

С. 8 ГОСТ 26385-91

Следует учитывать, что реакция с R—сывороткой бруцеллезной проходит замедленно, агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты дифференциации испытуемых культур считают достоверными, если в контролях R и S—бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами наблюдается четко выраженная агглютинация и отсутствует с гетерологичными. Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии 50—100%-ной агглютинации.

При отрицательной реакции агглютинации с культурой из одной колонии дополнительно исследуют еще не менее трех-четырех подозрительных колоний.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов постоянно агглютинируется только R—бруцеллезной сывороткой.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с S или R—бруцеллезными сыворотками одновременно или с одной из них в отдельности при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе относят к бруцеллам.

2.1.3.4.    Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Заражение морских свинок (не менее двух), предварительно проверенных на бруцеллез исследованием сыворотки их крови в реакции агглютинации, проводят подкожно в области паха в дозе 1 см3.

Через 15—30 сут у свинок берут кровь и сыворотку, исследуют на бруцеллез в реакции агглютинации в разведениях 1 : 10—1 :80.

При положительной РА морских свинок убивают, отмечают па-тологоанатомические изменения в селезенке, печени и лимфатических узлах и при необходимости исследуют их бактериологочес-ки. При отрицательной РА свинку выдерживают до 60 сут, а затем исслстуют серологически и бактериологически.

2.1.4.    Оценка результатов

2.1.4.1.    Заболевание бруцеллезом или инфекционным эпидиди-митом считают установленным при выделении культуры возбудителя из исследуемого материала или от морской свинки (биопроба), а также при получении у свинки положительной РА 1:10 и выше.

2.1.4.2.    При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах биологического исследования и биопробы материал считают подозрительным в заражении бруцеллами и проводят серологическое и аллергическое исследования животных данной группы.

2.2.    Метод серологического исследования

Сущность метода заключается в выявлении в сыворотке крови

животного специфических антител к бруцеллезному или овисно-му антигенам.

ГОСТ 25385-91 С. *

Применяют реакции:

роз бенгал проба (РБП) rose Bengal test, реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК) или реакция длительного связывания комплемента (РДСК).

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Баня водяная с терморегулятором.

Комплект инструментов и приспособлений для проведения серологических исследований на бруцеллез крови животных (КИ).

Пластины с лунками полистироловые.

Штативы для пробирок.

Потенциометр или рН-метр.

Центрифуга лабораторная.

Фильтр Зейтца, пластины стерилизующие.

Стекла предметные чистые по ГОСТ 9284.

Пробирки серологические по ГОСТ 25336.

Микропипетки.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292.

Кальций хлористый.

Кислота карболовая кристаллическая.

Кислота лимонная.

Кислота борная.

Кислота соляная.

Магний хлористый.

Натрий хлористый.

Натрий гидроокись.

Натрий лимоннокислый.

Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК.

Антиген бруцеллезный цветной для роз бенгал пробы (РБП).

Набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой бруцеллой овис (антиген овисный для РДСК, позитивная овисная и негативные сыворотки).

Сыворотка бруцеллезная позитивная.

Сыворотка овисная позитивная .

Гемолизин (гемолитическая сыворотка) по ГОСТ 16445.

Комплемент сухой, консервированный или нативный по ГОСТ 16446.

Эритроциты барана.

D-глюкоза по ГОСТ 6038.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Бруцеллезные антигены для реакции агглютинации (РА), роз бенгал пробы (РБП), реакции связывания комплемента (РСК) или реакции длительного связывания комплемента (РДСК) готовят из штаммов Brucella abortus. Антиген овисный для РДСК из штаммов Brucella ovis.