Купить ГОСТ 25384-82 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свиней, верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура
Ограничение срока действия снято: Протокол № 2-92 МГС от 05.10.92 (ИУС 2-93)
1 Методы отбора проб
2 Методы исследований
Дата введения | 01.01.1983 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.09.2013 |
Актуализация | 01.01.2021 |
11.08.1982 | Утвержден | Госстандарт СССР | 3155 |
---|
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
СОЮЗА ССР
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА
Издание официальное
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ
Москва
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛЬ
Ж. Л. Шажко
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Член Коллегии А. Д. Третьяков
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. № 3155
УДК 636:576.8.07:006.354 Группа С79
ГОСТ
25384-82
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики ящура
(CT СЭВ 2597—80)
Domestic animals. Methods of laboratory diagnostics of foot-and-mouth disease
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. № 3155 срок действия установлен
с 01.01.83 до 01.01.88
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свинейг верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура.
Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораторий.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2597—80.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения диагностических исследований на ящур отбирают стенки и содержимое афт (лимфа) на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиньи), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт отбирают пробы крови в момент температурной реакции у животных, а из трупов молодняка всех видов животных — лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца.
Издание официальное
Для проведения ретроспективных диагностических исследований на ящур отбирают пищеводно-глоточную слизь. Отбор пищеводно-глоточной слизи производят в любое время после предполагаемого заболевания животных.
Перепечатка воспрещена
© Издательство стандартов, 1982
Стр. 2 ГОСТ 25384-82
1.2. Для проведения диагностики серологическим методом отбирают не менее 5 г стенок или содержимого афт. Масса проб остальных материалов, предназначенных для выделения вируса ящура и его последующей идентификации, должна быть не менее 10 г.
При невозможности получения указанных количеств проб допускается отбирать максимально возможное количество патологического материала для проведения последующей расплодки вируса в культурах клеток.
1.3. Пробы патологического материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания— заливают консервирующей жидкостью. Для консервирования стенок и содержимого афт используют консервирующую жидкость, состоящую из равных объемов нейтрального глицерина и забуференного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток (без сыворотки). Пробы остального патологического материала консервируют растворами антибиотиков с широким спектром действия или глицерин-фос-фатным буфером.
1.4. Флаконы с пробами снабжают этикеткой с указанием вида животных, наименования патологического материала и его количества, консерванта, времени отбора и адреса отправителя. Флаконы с пробами помещают в небьющийся контейнер со льдом или хладоносителем и доставляют на исследование в возможно короткий срок, но не позднее 48 ч с момента отбора. Если пробы могут быть доставлены в течение 6—12 ч с момента отбора, замораживание и консервация проб не обязательны.
1.5. Поступившие на исследование стенки афт освобождают от консервирующей жидкости отмыванием в 2—3 сменах стерильного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в ступке с песком или с помощью гомогенизатора и смешивают в соотношении 1:1 или 1:2 с 0,15 М раствором хлористого натрия. Полученные 50 или 33% суспензии выдерживают в течение 20 мин при температуре 4°С, а затем очищают 20% (по объему) хлороформа или флюорокарбона в течение 5—7 мин и осветляют центрифугированием с частотой вращения 3000 об/мин в течение 15 мин.
1.6. Содержимое афт (лимфа) разбавляют равным количеством 0,15 М раствора хлористого натрия и подвергают очистке и осветлению в соответствии с п. 1.5.
1.7. Пробы лимфоузлов, мышцы сердца, поджелудочной железы и свернувшейся крови сначала обрабатывают в соответствии с п. 1.5, а затем разбавляют средой для культивирования клеток.
ГОСТ 25384-82 Стр. 3
Полученные суспензии при невозможности немедленно использовать для постановки биопробы замораживают и хранят при температуре минус 20°С.
1.8. Суспензии, полученные в соответствии с пп. 1.5 и 1.6, делят на три неравные части. Меньшую из них (около 1 см3), предназначенную для вирусологических исследований (постановки биопробы), консервируют антибиотиками и хранят при температуре минус 20°С. Другую часть (2—3 см3), предназначенную для исследования в РСК, прогревают при температуре 56°С в течение 40 мин, а оставшуюся (1,5—2 см3)—хранят без прогревания. Перед постановкой РСК обе эти пробы центрифугируют в течение 20 мин с частотой вращения 3500—4000 об/мин.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Серологический метод
Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).
2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы
2.1.1.1. Для проведения исследования применяют: центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;
центрифугу рефрижераторную; холодильник с температурой минус 20°С; холодильник с температурой от 0 до 8°С; гомогенизатор;
баню водяную или термостат;
шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200°С;
электрофотоколориметр или спектрофотометр; пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75; пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;
наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;
пипетки вместимостью до 10 см3 с ценой деления 0,01 и 0,1 см3 по ГОСТ 20292-74;
колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см3 по ГОСТ 1770-74;
комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446-78;
гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1 :8000 по ГОСТ 16446-78;
эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;
сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран—членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1 :20;
антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран—членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1 :4;
сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;
кислоту борную дважды перекристаллизованную;
веронал;
мединал;
глюкозу по ГОСТ 975-75; натрий хлористый по ГОСТ 4233-77; магний хлористый по ГОСТ 4209-77, х. ч.; кальций хлористый по ГОСТ 4460-77, х. ч.; среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (pH 7,4—7,6);
хлороформ по ГОСТ 20015-74 или флюорокарбон-113; консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см3 дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристалли-зованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;
раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см3 кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4°С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.
2.1.2. Подготовка к исследованию
2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп. 1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1 :2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см3 или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см3. Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомпле-ментарность и гемолитические свойства.
2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором
ГОСТ 25384-82 Стр. 5
хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5—7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 см3 осадка с 98 см3 разбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15—20 мин в водяной бане при температуре 37°С или при комнатной температуре.
При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.
2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50 %! эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п. 2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 СН50 в 0,1 см3 (если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см3 (при постановке РСК на панелях для микрореакций).
2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или веро-наловом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т. е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).
2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) ящурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или веро-наловом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т. е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).
2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп. 2.1.2.4 и 2.1.2.5.
2.1.3. Проведение исследования
2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п. 2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 СН50. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства — разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или тер-
Стр. 6 ГОСТ 25384-82
мостат при 37°С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см3 (пробирки) или 0,05 см3 (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37°С в течение 20 мин.
Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2—3 ч при комнатной температуре.
При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.
Для повышения чувствительности РСК применяют реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), при которой первая фаза протекает при 4°С в течение 16—20 ч.
2.1.4. Об р а ботка результатов
Оценку результатов проводят визуально.
Реакцию считают положительной, если в ряду пробирок (лунок) с какой-либо штаммоспецифической сывороткой отмечается задержка гемолиза не менее 50% эритроцитов при полном гемолизе в параллельных рядах с другими штаммоспецифическими сыворотками и в контроле с пробами патологического материала на антикомплементарность. Возбудитель относится к тому варианту вирусов ящура, с сывороткой которого титр исследуемой суспензии окажется выше.
Отрицательная реакция не исключает ящура или иного сходного с ним заболевания, поскольку концентрация вирусоспецифического антигена в исследуемом материале может оказаться слишком низкой для обнаружения в РСК.
2.2. Методы выявления вируса
Сущность методов заключается в выявлении биологического действия вируса на восприимчивые и чувствительные биологические системы и его последующей идентификации серологическим методом.
2.2.1. А п п а р а ту р а, материалы и растворы
2.2.1.1. Для проведения исследования применяют:
термостат с температурой нагрева 37°С;
пипетки вместимостью до 10 см3 с ценой деления 0,01 см3 по ГОСТ 20292-74;
культуры монослойные первичных клеток почки свиней (СП), телят, взрослого крупного рогатого скота (ВП) и ягнят (ПЯ) и перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2 в пробирках и флаконах вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см3;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактабумина (pH 7,4—7,6);
ГОСТ 25384-82 Стр. 7
среду питательную Игла для культивирования клеток перевиваемых линий;
раствор Хенкса солевой, pH 7,2—7,4.
2.2.2. Подготовка к исследованию
2.2.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп. 1.5, 1.6 и 1.8, и оказавшиеся неактивными в РСК, а также суспензии лимфатических узлов, сердечной мышцы, поджелудочной железы, свернувшейся крови и пищеводноглоточную слизь, полученные в соответствии с пп. 1.7 и 1.9, используют для заражения монослойных культур первичнотрипсинизирован-ных клеток (СП, ВП, ПЯ, щитовидной железы крупного рогатого скота), перевиваемых линий (ВНК-21 и IB-RS-2), десять мышат 3—6-дневного возраста и пять морских свинок. Допускается заражение двух голов крупного рогатого скота в 18-месячном возрасте и четырех поросят 3-месячного возраста, не содержащих в крови специфических антител.
2.2.3. П р о в едение исследования
2.2.3.1. Проведение биопробы на культурах клеток
Отбирают пробирки (флаконы) с хорошо сформированным
монослоем без признаков старения и неспецифической дегенерации. На каждую пробу исследуемого материала берут по 10 пробирок или по 2—3 флакона с перечисленными клеточными культурами. Непосредственно перед инокуляцией культуры дважды отмывают от ростовой питательной среды раствором Хенкса. Затем в пробирочные культуры вносят по 0,1—0,2 см3, а во флаконы от 0,5 до 10 см3 (в зависимости от хчлощади монослоя) исследуемых суспензий. Инокулированные культуры выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 60 мин, затем освобождают от исследуемой суспензии и заливают поддерживающей питательной средой. Одновременно ставят контроль на цитотоксичность раствора Хенкса. Инокулированные контрольные культуры помещают в термостат при температуре 37°С и в течение 7 дней проводят микроскопию для выявления дегенерации клеток. В случае обнаружения дегенерации только в инокулированных культурах проводят дополнительный пассаж культуральной суспензии, полученной после однократного промораживания культур с дегенерацией монослоя при температуре минус 20°С. Полученную при этом суспензию осветляют центрифугированием в течение 15 мин с частотой вращения 3000 об/мин и затем заражают исходные культуры в том же порядке, который предусмотрен для исследуемых суспензий проб патологического материала.
Специфичность дегенерации клеток проверяют в РСК-
2.2.3.2. Постановка биопробы на животных
Биопробу ставят на морских свинках, мышатах 3—6-суточного возраста и естественно-восприимчивых к ящуру животных.
Стр. 8 ГОСТ 25384-82
Используют клинически здоровых особей, в анамнезе которых полностью исключены предварительные контакты с вирусом ящура. Мышатам исследуемую суспензию инокулируют подкожно в дозе 0,1 см3, морским свинкам — в кожу подушечек обеих задних конечностей методом тунелирования в дозе 0,2—0,5 см3. Крупному рогатому скоту материал вводят в толщу эпителия языка и в мякиши всех конечностей в дозе 2—3 см3. За инокулированными животными наблюдают в течение 7 дней. В случае гибели подопытных мышат проводят дополнительный пассаж материала, приготовленного из тушек павших мышат, и исследование в РСК в соответствии с п. 2.1.
При появлении у остальных видов животных везикулярных поражений кожи в местах инокуляции исследуемого материала отбирают пробы содержимого афт в соответствии с п. 1.2, готовят из них суспензии в соответствии с пп. 1.5 и 1.6 и исследуют в РСК в соответствии с п. 2.1.
2.2.4. Обработка результатов
2.2.4.1. Пробу исследуемого патологического материала считают отрицательной, если во втором и последующем пассажах не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышат, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.