ГОСТ 20909.4-75
Сперма быков неразбавленная. Методы биологических исследований

УДК 619:611-013.11:620.193.8(063.74)    Группа    Р39

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ Методы биологических исследований

Non-diluted sperm of bulls Methods of biological tests

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 19 сентября 1975 г. № 2440 срок действия установлен

с 01.07.76 до 01.07.81

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную све-жеполученную сперму быков и устанавливает методы испытаний биологических свойств спермы — подвижности спермиез, абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах, осмотической (физиологической) резистентности, активности дегидрогеназ и резистентности спермиев к холодовому шоку.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1.    Отбор проб — по ГОСТ 20909.1-75.

1.2.    Для проведения испытаний используют сперму, хранившуюся при температуре 30—35°С не более 30 мин с момента ее получения.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении количества спермиев с прямолинейным поступательным движением.

2.1.    О бо р удов а ние и реактивы

2.1.1.    Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284-67;

термостат ТМ-1 или другой конструкции, снабженный стандартным контактным или нестандартным однотемпературным термометром;

ГОСТ 20909,4—75 Стр. 2

стекла покровные по ГОСТ 6572-59;

стекла предметные по ГОСТ 9284-59;

стекла предметные с углублением;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 5.1314-72, 3%-ный раствор;

натрий хлористый по ГОСТ4233—66, 1%-ный раствор.

2.2. Подготовка к испытанию

2.2.1.    Подготовка и стерилизация лабораторной посуды — по ГОСТ 20909.2-75.

2.2.2.    Термостат включают за 20—30 мин до начала работы. Температура в термостате должна быть 40—42°С.

2.2.3.    Предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, пипетки и растворы подогревают до 35—40°С.

2.3.    Проведение испытания

2.3Л. Подвижность спермиев определяют в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100—180^х. Более точно количество живых и мертвых спермиев определяют в счетной камере по ГОСТ 20909.3-75.

2.3.2. При определении подвижности спермиев под микроскопом наносят на предметное стекло теплой стерильной стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой небольшую каплю спермы, к которой добавляют двух-четырехкратное количество 3%-иого раствора лимоннокислого натрия. Сперму с раствором лимоннокислого натрия тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом весь препарат. Подсчет спермиев пре изводят не менее чем в трех полях зрения микроскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывают количество спермиев с прямолинейным поступательным движением и отдельно — количество спермиев с неправильным движением — манежным (перемещение по кругу), колебательным (спермин не перемещаются, но производят движение головкой или хвостиком) и мертвых спермиев.

2.4.    Обработка результатов

2.4.1. Подвижность спермиев (#_с ) в баллах вычисляют по

формуле

П_e=2ii!i.

^с п ⁹

где п — общее число подсчитанных спермиев;

«1 —- число подсчитанных спермиев с прямолинейным поступательным движением;

10— постоянный к оэффициент.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Минимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,6 балла.

13

Изменение № 1 ГОСТ 20909.4-75 Сперма быков неразбавленная. Методы биологических исследований

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 08.06.81 № 2857 срок введения установлен

с 01.07.81

Пункты 2.1.1, 4.1.1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284-67 на ГОСТ    8284—78,

ГОСТ 6672-59 на ГОСТ 6672-75, ГОСТ 9284-59 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 4233-66 на ГОСТ 4233-77.

Пункты 2.1.1, 5:2.1. Заменить ссылку: ГОСТ 5.1314-72 на ГОСТ 22280—

76.

Пункт 4.1.1. Заменить слова:    «микропипетки    стеклянные по ГОСТ

12487—67» на «микропипетки стеклянные».

Пункты 5.1.1, 5.2.1. Заменить ссылки: ГОСТ 5072-72 на ГОСТ    5072—79,

ГОСТ 9284-50 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 4233-66 на ГОСТ 4233-77.

Раздел 5 дополнить новым пунктом — 5.1.4.3:

«5.1.4.3. Коэффициент дегидрогеназной активности (/(Да) вычисляют

по формуле

(Продолжение см. стр. 236) (Продолжение изменения к ГОСТ 20909.4—75)

где Д _а — дегидрогеназная активность».

Пункт 5.2.1. Заменить слова и ссылки: «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487-67» на «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 20292-74», ГОСТ 12487-67 на ГОСТ 1770-74, ГОСТ 3164-52 на ГОСТ 3164-78.

Пункт 5.2.4. Исключить слова: «и 5.1.5».

Пункт 6.1.1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284-67 на ГОСТ 8284-78, ГОСТ 9284-59 на ГОСТ 9284-75, ГОСТ 6672-59 на ГОСТ 6672-75, ГОСТ 6038--74 на ГОСТ 6038-79.

Приложение 1. Графа «Последовательные интервалы времени, t, ч». Заменить значение: 26 на 36;

графа а. Для 12-го дня проведения испытаний заменить знак:—на ЕП (3 раза).

(ИУС № 8 1981 г.)

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ И ВРЕМЕНИ ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в установлении подвижности спермиев за каждый последовательный интервал времени в процессе хранения спермы после ее разбавления.

Выживаемость спермиев в часах определяют по количеству времени, прошедшего от начала хранения спермы до ее гибели.

3.1.    Оборудование и реактивы

3.1.1.    Оборудование и реактивы — по п. 2.1;

глюкозо-иитратно-желточиая среда — по ГОСТ 14746-69.

3.2.    Проведение испытания

3.2.1.Отбирают из одного эякулята или серии спермы не менее двух проб для анализа, которые разбавляют глюкозо-цитратнэ-желточной средой, приготавливая одно из разведений от 1:8 до 1:32, и сохраняют при 2—5^СС.

Подвижность спермиев определяют через каждые 24 ч (в начале хранения можно через 48 ч) по п. 2.3. Последним днем испытания считают день, когда наблюдается единичная подвижность спермиев и нельзя установить минимальную подвижность спермиев в баллах.

3.3.    Обработка результатов

3.3.1.    Абсолютную выживаемость спермиев (5) вычисляют по

формуле

S = &itx +    Н" #3^3    • • • Н” &n tfl *

где а₂, а₃ . . . а_п —подвижность спермиев за интервалы времени, баллы;

t_u t₂, f₃.. - t_n — последовательные интервалы времени, в течение которых подвижность спермиев соответственно равна а_и а_2у а₃...а_п , ч, вычисляемые по п- 3.3.2; a\tu ct₂t_2i a₃t₃.. ,а_п t_n—выживаемость спермиев за последовательные интервалы времени.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух или более параллельных определений. Допускаемые расхождения между двумя параллельными определениями не должны превышать ±10%. Если из трех или четырех определений одно имеет расхождение более чем на ±10%, то среднее арифметическое вычисляют соответственно по двум или трем определениям. Если из трех или четырех определений два имеют расхождение более чем на ±10%, то испытание повторяют.

При проведении пяти определений среднее арифметическое вычисляют потрем определениям, при шести или семи определениях — по четырем, при восьми и девяти определениях — по пяти определениям, имеющим расхождение не более ±10%.

14

ГОСТ 20909.4—7S Стр. 4

3 3.2. Интервалы времени (/_ь t%,    в    часах    вычис    шюг    по

формуле

где Т — время, прошедшее от начала испытания до дня следующего испытания, ч; п — порядковый номер дня испытания.

При определении выживаемости спермиев в день испытания, когда нельзя установить минимальную подвижность спермиев, интервал времени (t_n) в часах вычисляют по формуле

А _

¹п~    2    *

где Т_нс — время выживаемости спермиев, ч, вычисляемое по п 3.3 3,

Tn i — время, прошедшее от начала испытания до предпоследнего дня испытания, когда была установлена минимальная подвижность спермиев в баллах, ч.

3.3.3. Время выживаемости спермиев (Т _IiC ) в часах вычисляют по формуле

'Г _ ^ТП-Т_П-1 , гг

¹ нс~~ >    Г * гг—Ь

где Т „ — время, прошедшее от начала испытания до последнего дня испытания, ч.

Результаты испытаний по определению подвижности спермиев при вычислении абсолютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах записывают в журнале испытаний. Форма журнала для записи результатов испытаний, а также примеры вычислений абсолютной выживаемости спермиев, интервала времени и выживаемости спермиев в часах приведены в приложениях 1 и 2.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ (ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ! РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении устойчивости спермиев к действию гипотонического раствора хлористого натрия.

4.1.    О б о р у до в а н ие и реактивы

4.1.1.    Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284-67;

термостат ТМ-1 для микроскопа; флаконы вместимостью 10—15 мл или пробирки; микропипетки стеклянные по ГОСТ 12487-67; колбы стеклянные вместимостью 100—500 мл по ГОСТ 12487—67;

стекла предметные по ГОСТ 9281-59; стекла покровные по ГОСТ 6672-59;

15

Стр. 5 ГОСТ 20909.4-75

натрий хлористый по ГОСТ 4233-66, 0,1—0,6%-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

4.2. Подготовка к испытанию

4.2.1.    При определении осмотической резистентности неразбавленной спермы должны строго соблюдаться правила, предупреждающие холодовый шок слермиев. Растворы и лабораторная посуда, применяемые для проведения испытания, должны быть стерильными и подогретыми до температуры 30—35°С.

4.2.2.    Перед испытанием готовят пробирки с концентрацией раствора хлористого натрия от 0,6 до 0,1%. Для этого вначале готовят на дистиллированной воде 1%-ный раствор хлористого натрия, который разливают в девять пробирок в объеме от 0,5 до 3,0 мл в соответствии с таблицей и добавляют дистиллированную воду до объема 5 мл.

Номера проби рок	Количество 1%-но-го раствора хлористого натрия, мл	Количество дистиллированной воды, мл	Концент- | рация раст-| вора хлористого I натрия, %	Номера пробирок	Количество 1%-ного раствора хлористого натрия, мл	Количество дистиллированной воды, мл	Концентрация раствора хлористого натрия, %
1	3,00	2,00	0,60	6	1,25	3,75	0,25
2	2,50	2,50	0,50	7	1,00	4,00	0,20
3	2,00	3,00	0,40	8	0,75	4,25	0,15
4	1,75	3,25	0,35	9	0,50	4,50	0,10
5	1,50	3,50	0,30 1

При исследовании большого количества проб спермы раствор хлористого натрия в концентрациях от 0 6 до 0,1% готовят в девяти колбах, затем из каждой колбы переносят мерной стеклянной пипеткой по 5 мл раствора в заранее приготовленные флаконы или пробирки.

4.2.3.    Приготавливают по две пробирки с раствором хлористого натрия каждой из указанных в таблице концентраций. Пробирки закрывают резиновыми пробками, обернутым-г пергаментной бумагой, и ставят в термостат при температуре 3D—-35“С на 10—15 мин.

4.3.    Проведение испытания

4.3.1.    В каждую пробирку с раствором хлористого натрия теплой микропипеткой вносят по 0,025 или 0,05 мл испытуемой спермы. Получают разбавление от 1:100 до 1:200.

Пробирки с разбавленной спермой выдерживают 3 чпрн температуре 18—22"С.

Подвижность спермиев в раздавленной капле определяют по п. 2.3 без добавления раствора лимоннокислого натрия.

4.4.    Обработка результатов

4.4.1.    Осмотическую резистентность спермы (R₀) выражают

ГОСТ 20909.4-7$ Стр. 6

значением концентрации раствора хлористого натрия, при которой подвижность спермиев составляет не менее 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора хлористого натрия, в котором спермин остаются живыми, тем выше осмотическая резистентность спермы.

Пример. В пробирке № 8 (0,15%-ный раствор хлористого натрия) определена единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 7 (0,2%-ный раствор хлористого натрия) подвижность спермиев 0,5 балла. Следовательно, значение осмотической резистент-нссти спермы равно 0,2. Или, если в пробирке № 8 мертвые спермин, в пробирках № 7 и 6 единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 5 (0,3%-ный раствор хлористого натрия) подвижность — 0,5 балла. Следовательно, осмотическая резистентность спермы равна 0,3.

4.4.2. Коэффициент резистентности (Як) вычисляют по формуле

где 0,1 — постоянный коэффициент;

R о— осмотическая резистентно сть (концентрация раствора хлористого натрия, %).

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ НОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ

Сущность метода заключается в определении скорости обесцвечивания метиленовой сини, добавленной к сперме.

Скорость обесцвечивания метиленовой сини зависит от активности дегидрогеназ-ферментов дыхания спермиев.

Дегидрогеназную активнсегь спермы определяют в капиллярах или в пробирках.

5.1.    Метод определения д егидр ог е н а з н о й активности спермы в капиллярах

5.1.1.    Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют: термостат ТМ-1 для микроскопа; термометр по ГОСТ 2Я5—73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную; секундомер по ГОСТ 5072-72; стекла предметные по ГОСТ 9284—5Э; пн пет* и глазные и пастеровские;

трубочки стеклянные длиной 5—S см с внутренним диаметром 0,8—1,0 мм или катетеры от шприцов для искусственного осеменения коров;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-66; синь метиленовую 0,01%-ный раствор; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

5.1.2.    Подготовка к испытанию

17

Стр. 7 ГОСТ 20909.4-75

5.1.2.1.    Концентрацию спер мне» в сперме определяют и ГОСТ 20909.5—75.

5.1.2.2.    Подвижность спермиев определяют по п. 2.3.

Раствор метиленовой сини готовят, растворяя 0,01 г метил ел о-вон сини и 0,9 г хлористого натрия в 190 мл дистиллированной воды.

5.1.3.    Проведение испытания

На чистое предметное стекло, подогретое до 30—37°С, наносят 0,05 мл (каплю) спермы и добавляют теплой пипеткой такое же количество (каплю) 0,01%-ного раствора метиленовой сини, подогретой до 30°С. Смесь спермы с краской тщательно смешивают и набирают ее в теплую (30—37°С) стеклянную трубку, рассчитывая, чтобы высота столбика смеси составляла 2—3 см. Столбик смеси, не содержащий пузырьков воздуха, располагают в центре трубки.

Трубочку, заполненную смесью опер мы с метиленовой синью, помещают в термостат при температуре 37*0,54] на лист белой бумаги в горизонтальном положении. Записывают время начала испытания и окончания обесцвечивания метиленовой сини. При этом учитывают, что концы столбика (1—2 мм) обычно не обесцвечиваются.

5.1.4.    Обработка результатов

5.1.4.1.    Дегидрогеназную активность спермы выражают в условных единицах.

За единицу активности принимают такую активность, когда 1 млрд, спермиев обесцвечивает за 1 мин 0,05 мл 0,01%-ного раствора метиленовой сини (0,000005 г порошка метиленовой сини).

5.1.4.2.    Дегидрогеназную активность спермы (Д_а) в условных единицах вычисляют по формуле

лг _ n_c    t    -C

Мл— ₁₀    ,

где П _с —подвижность спермиев, баллы;

t — время обесцвечивания метиленовой сини в опыте,мин;: С — концентрация спермы, млрд/мл;

10 — постоянный коэффициент.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны превышать ±10%.

5.2.    Метод определения д егид р оге н а зной активности спермы в пробирках

5.2.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют:

термостат ТМ-1 для микроскопа;

термометр по ГОСТ 215-73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную;

18

ГОСТ 20909.4-75 Стр. 8

секундомер по ГОСТ 5072-72; стекла предметные по ГОСТ 9284-59;

пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487-67; колбы стеклянные по ГОСТ 12487— 67;

пробирки стеклянные вместимостью 5 мл и диаметром 1 см;

синь метиленовую, 0,05%-ный раствор;

натрий лимоннокислый по ГОСТ 5.1314-72;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164-52, хл.;

глюкозу по ГОСТ 4233-66;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.

5.2.2. Подготовка к испытанию

5.2.2.1.    Приготовляют глюкозо-цитратный раствор на прокипяченной дистиллированной воде, для чего растворяют в колбе вместимостью 100 мл 3 г глюкозы и 1,4 г лимоннокислого натрия.

Раствор доводят до -метай водой.

5.2.2.2.    Раствор мэтиленоной сини готовят на прокипяченной дистиллированной воде, растворяя в мерной колбе вместимостью 100 мл 3 г глюкозы, 1,4 г цитрата натрия и 0,05 г метиленовой сини. Объем раствора доводят до метки.

5.2.2.3.    Концентрацию спермиев определяют по ГОСТ 20909.5—75.

5.2.3.    Проведение испытания

В чистую, подогретую до 30—37°С стеклянную пробирку вносят 0,8 мл теплого (37—45°С) глюкозо-цитратного раствора, добавляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленовой сини и 0,2 мл спермы. Содержимое тщательно перемешивают и наслаивают очищенное вазелиновое масло в таком количестве, чтобы получился столбик масла высотой 0,5—1,0 см.

Пробирки со смесью ставят в термостат или в водяную баню при температуре 45°С и учитывают время обесцвечивания метиленовой сини.

Допускается одновременно определять показатель выживаемости спермиев при температуре 45*С. Для этого через каждые 10— 15 мин из пробирок берут пробу стеклянной палочкой и оценивают подвижность спермиев по п. 2.3.

5.2.4.    Обработка результатов

Депидрогеназную активность спермы и коэффициент дегидро-геназной активнссги вычисляют по пп. 5.1.4 и 5.1.5.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ К ХОЛОДОВОМУ ШОКУ

Сущность метода заключается в определении выживаемости спермиев после быстрого их охлаждения до температуры 1—3°С.

6.1.    Оборудование и реактивы

6.1.1.    Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284-67;

19

Стр. 9 ГОСТ 20909.4—<7$

термостат ТМ-1 для микроскэпа;

стекла предметные по ГОСТ 9284-59;

стекла покровные размером 18x18 или 24 x 24 мм го ГОСТ 6672-59;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

флаконы вместимостью 2 мл;

глюкозу по ГОСТ 6038-74, 6%-ный раствор.

6.2.    Подготовка к испытанию

6.2.1.    Перед началом работы готовят на прокипяченной дистиллированной воде 6%-ный раствор глюкозы, растворяя 6 г глюкозы в мерной колбе вместимостью 100 мл. Объем раствора доводят водой до метки. Приготовленный раствор разливают по 1—2 мл в пробирки или флаконы из расчета на каждую пробу спермы не менее трех пробирок.

Готовят ванну со льдом с температурой 2±ГС, в которую не менее чем за 5 мин до начала исследования ставят для охлаждения по две из трех пробирок. Третью пробу с 6%-ным раствором глюкозы ставят в термостат при температуре 37—40°С.

Подвижность слермиев определяют по п. 2.3.

6.3.    Проведение испытания

6.3.1.    Одну-две капли неразбавленной спермы, выдержанной при комнатной температуре не менее 10 и не более 30 мин, вносят стеклянной пипеткой в пробирки или флаконы с 6%-ным раствором глюкозы, охлажденной до 2±ГС, и в пробирку с раствором, подогретым до 37—40°С. Выдерживают 5 мин. Подвижность спер-миев определяют под микроскопом по п. 2.3.

6.4.    О б р а б отк а результатов

6.4.1.    Резистентность сиермиев к холодовому шоку (R_x) вычисляют по формуле

где а\ — подвижность сиермиев через 5 мин после внесения спермы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 2±ГС, баллы;

а₂ — подвижность сиермиев через 5 мин после внесения спермы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 37— 40°С, баллы.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±10%,

Пример. Подвижность сиермиев в 6%-ном растворе глюкозы при температуре 37—40°С — 8,0 баллов, а в растворе С температурой 2±1°С — 1,5 балла.

Следовательно, резистентность к холодовому шоку

20