ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ГОСТ 20264.2-88

Издание официальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ Москва

УДК 574.15.001.4:006.354    Группа    С09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения протеолитической активности

Enzyme preparations. Methods for determination of proteolytic activity

ОКСТУ 9291

Срок действия с 01.01.89 до 01.01.94

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения.

1 МЕТОД ОТБОРА ПРОБ —по ГОСТ 20264.0-74.

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПС) (модифицированный метод Айсона)

2.1. Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их определением.

За единицу протеолитической активности принята способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30°С казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина.

Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при значениях pH в следующих диапазонах:

2,5±0,2 и 5,5±0,2 — кислые протеиназы;

7,2±0,2 — нейтральные протеиназы;

9,5±0,2 — щелочные протеиназы.

Издание официальное    Перепечатка    воспрещена

★

© Издательство стандартов, 1988

натрия концентрацией 0,5 моль/дм³ и по 1 см³ рабочего раствора Фолина, непрерывно перемешивают, выдерживают в ультратермостате (для разв'йтия окраски) при температуре 40°С в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры, затем фотометри-руют при длине волны 630—670 нм при использовании кювет с толщиной поглощающего свет слоя 5 мм.

Оптическую плотность испытуемых растворов измеряют по отношению к контрольной пробе (воде).

Значение оптической плотности для ферментных препаратов должно находиться в диапазоне 0,15—0,70.

В случае отклонения оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы.

3.4. Обработка результатов

Протеолитическую активность {ПС), ед/г, вычисляют по формуле

ПС^ V ^D-+°’.I.iooq,    (2)

т

где D —значение оптической плотности испытуемых растворов; т — масса ферментного препарата в фильтрате, взятом для развития окраски мг;

4,7 и 0,1 —постоянные коэффициенты, полученные экспериментально, г/ч;

1000 — переводной коэффициент милиграмм в граммы.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата.

Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей двух параллельных навесок не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5%.

ГОСТ 20264.2-88 С. II

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством медицинской и микробиологической промышленности СССР

ИСПОЛНИТЕЛИ

А. Н. Саприн, д-р. биолог, наук; А. В. Гарбузов, канд. биолог, наук; В. М. Лаврухина

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.03.88 № 440

3.    Срок первой проверки — 1992 г.

Периодичность проверки — 5 лет

4.    ВЗАМЕН ГОСТ 20264.2-74

б. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

ГОСТ 61-75 ГОСТ 83-79 ГОСТ 215-73 ГОСТ 1770-74 ГОСТ 2156-76 ГОСТ 3118-77 ГОСТ 4109-79 ГОСТ 4328-77 ГОСТ 5072-79 ГОСТ 5850-72 ГОСТ 6552-80 ГОСТ 6709-72 ГОСТ 9656-75 ГОСТ 10931-74 ГОСТ 12026-76 ГОСТ 12083¹—78 ГОСТ 14919-83 ГОСТ 18289-78 ГОСТ 20264.0-74 ГОСТ 20292-74 ГОСТ 24104-80 ГОСТ 25336-82

С. СЕЛЬСКОЕ И ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

Группа С09

Изменение № 1 ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности

Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 21.12.89 М 3952

Дата введения 01.07.90

Пункт 2.2. Заменить ссылку: ГОСТ 24104-80 на ГОСТ 24104-88; исклю* *шть ссылку: ГОСТ 5850-72.

(Продолжение см. с. 296) (Продолжение изменения к ГОСТ 20264.2-88)

Пункт 2.4. Экспликация к формуле. Заменить единицу и слова: см³/мкмоль на мкмоль/см³; <ип — масса ферментного препарата, взятая на протеолиз, мг» на <т — масса ферментного препарата, взятая на протеолиз (расчет ведется на 1 см³ ферментного раствора), мг».

(ИУС № 4 1990 г.)

Редактор Н. В. Бобкова Технический редактор Я. Я, Дубина Корректор Е. А. Богачкова

Сдано в наб. 21,00.88 Подп. в печ. 03.Q5.88 1,0 уел. п. л. 1,0 уел. кр.-отт. 0,73 уч,-Тираж 8 000    Цена

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123840, Москва, ГСП, Новопресненский пер., 3 Тип. «Московский печатник». Москва, Лялин пер., 6. За к. 2068

С. 2 ГОСТ 20264.2-88

2.2. Аппаратура, материалы, реактивы, раство-

р ы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80:

2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;

1-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г или 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г.

Прибор для определения pH среды в диапазоне от 0 до 14 с погрешностью измерения ±0,1 единиц pH.

Мешалка магнитная любого типа, обеспечивающая 3000 об/мин.

Термостат любого типа, обеспечивающий температуру нагрева 40±0,2°С.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный по ГОСТ 12083-78, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 630—670 нм с погрешностью ± 1 % (по коэффициенту пропускания) или 0,01 D (по оптической плотности).

Секундомер по ГОСТ 5072-79.

Термометры 0—150°С по ГОСТ 215-73 с ценой деления 1°С.

Холодильник бытовой любой марки.

Электроплитка с терморегулятором по ГОСТ 14919-83.

Баня водяная любого типа.

Холодильник ХСВО 10 ХС по ГОСТ 25336-82.

Стаканы любого типа и исполнения вместимостью 100, 250, 600, 1000 и 2000 см³ по ГОСТ 25336-82.

Стаканчики для взвешивания СВ-19/9 или СВ-24/10 по ГОСТ 25336-82.

Колбы типов П и Кн любого исполнения вместимостью 100, 250, 500, 1000 см³ по ГОСТ 25336-82.

Колбы типов К—1—2000—45/40 ТС, К- 2- 200—45/40 ТС по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные исполнения 1 или 2, любого класса точности, наливные вместимостью 50, 100, 200, 250, 500, 1000 и 2000 см³ по ГОСТ 1770-74.

Пробирки П1—46—150 ХС, П2—16—180 ХС по ГОСТ 25336-82.

Цилиндры любого исполнения вместимостью 50 и 100 см³ по ГОСТ 1770-74.

Пипетки любого исполнения вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³ по ГОСТ 20292-74.

Бюретки по ГОСТ 20292-74.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336-82.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Кислота уксусная по ГОСТ 61-75, раствор концентрацией 0,1 моль*'дм³.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552-80, раствор с массовой долей кислоты 85% и раствор концентрацией 0,1 моль/дм³.

ГОСТ 20264.2-88 С. 3

Кислота борная по ГОСТ 9656-75, раствор концентрацией 0,1 моль/дм³.

Натрий вольфрамовокислый 2-водный по ГОСТ 18289-78.

Натрий молибденовокислый по ГОСТ 10931-74.

Литий сернокислый.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, концентрированная, раствор концентрацией 1 моль/дм³ и 0,2 моль/дм³.

Бром по ГОСТ 4109-79.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор концентрацией 1 моль/дм³ и 0,1 моль/дм³.

Натрий казеиновокислый (казеинат натрия).

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, раствор концентрацией 0,5 моль/дм³.

Тирозин.

Кислота трихлоруксусная (ТХУ).

Фенолфталеин по ГОСТ 5850-72.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечания:

1. Все реактивы должны быть марки х. ч. или ч. д. а, кроме трихлоруксус-ной кислоты, которая используется марки ч.

2 Допускается использование импортной посуды и приборов с аналогичными техническими характеристиками.

2.3. Подготовка к испытанию

2.3.1.    Приготовление универсального буферного раствора Уб\ концентрацией 0,1 моль!дм³.

Для приготовления универсального буферного раствора У61 готовят растворы концентрацией 0,1 моль/дм³: уксусной кислоты (раствор А), ортофосфорной кислоты (раствор В) и борной кислоты (раствор С) и смешивают их в равных соотношениях. Получают буферный раствор с pH 1,8. Добавляя к этой смеси различные объемы раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм³ получают буферные раство-ры:

а)    pH реакционной смеси 2,5±0,2 и 5,5±0,2 (для кислых про-теиназ);

б)    pH реакционной смеси 7,2±0,2 (для нейтральных протеи-наз);

в)    pH реакционной смеси 9,5±0,2 (для щелотых протеиназ).

2.3.2.    Приготовление универсального буферного раствора Уб₂ концентрацией 0,5 моль/дм³.

Для приготовления универсального буферного раствора Уб₂ готовят растворы А, В и С концентрацией 0,5 моль/дм³ и смешивают их в равных соотношениях.

2.3.3.    Приготовление универсального буферного раствора Уб₅ концентрацией 0,01 моль/дм³

С. 4 ГОСТ 20264.2-88

Универсальный буферный раствор Убз готовят смешиванием девяти объемов дистиллированной воды с одним объемом буферного раствора Убь

2.3.4.    Приготовление реактива Фолина (основной раствор)

Для приготовления основного раствора Фолина в круглодонную

колбу с пришлифованным обратным холодильником вместимостью 2000 см³ наливают 700 см³ дистиллированной воды, добавляют

100,00 г вольфрамо'вокислого натрия и 25,00 г молибденовокислого натрия. Затем приливают 50 см³ ортофосфорной кислоты с массовой долей 85% и 100 см³ концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят на слабом огне на асбестовой сетке в течение 10 ч. Кипячение допускается прерывать.

В охлажденную смесь добавляют 150,00 г сернокислого лития, 50 см³ дистиллированной воды и пять капель брома. Открытую колбу кипятят на слабом огне под тягой в течение 15—20 мин, чтобы удалить избыток паров брома. Раствор должен иметь желтую окраску. После охлаждения раствор доводят дистиллированной водой до 1000 см³ (при необходимости фильтруют через трубку Аллина, заполненную стеклянной ватой).

Приготовленный раствор хранят в склянке из темного стекла в холодильнике. Через 2—3 мес хранения следует добавить в него 1—2 капли брома и снова прокипятить в течение 15—20 мин Показателем непригодности раствора считается его помутнение и изменение окраски из желтой в зеленую.

Концентрацию реактива Фолина проверяют титрованием разбавленного 1:10 реактива Фолина раствором гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм³ по фенолфталеину. Реактив Фолина должен быть концентрацией 2 моль/дм³ по кислоте. Если кислотность реактива Фолина больше 2 моль/дм³, то его разбавляют дистиллированной водой, если меньше — реактив для работы не пригоден.

Рабочий раствор Фолина готовится разведением основного раствора 1 :2 (одна часть реактива Фолина и две части дистиллированной воды) для определения активности модифицированным методом Ансона и 1 : 3 (одна часть реактива Фолина и три части дистиллированной воды) для определения активности методом ФОЛП.

2.3.5.    Приготовление раствора ферментного препарата

0,100—1,000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности), тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством буферного раствора Уб] с соответствующим pH реакционной смеси. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят этим же буферным раствором объем жидкости до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности, используя этот же буферный раствор.

ГОСТ 20264.2-88 С, б

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях. Для испытания берут две параллельные навески препарата.

Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

2.3.6.    Приготовление раствора с массовой долей казеината натрия 2% (субстрат).

2.3.6.1.    Для кислых прот еиназ (pH 2,5)

2.000    г воздушно-сухого казеината натрия растворяют в 90 см³ буферного раствора Уб₃ с pH 5,5. Затем раствор доводят до pH 2,5 добавлением 3,0—-3,5 см³ раствора соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм³.

Добавление соляной кислоты (до pH 3,0) следует проводить быстро при интенсивном перемешивании раствора. При дальней-шем подкислении раствора до pH 2,5 кислота вносится по каплям.

Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки буферным раствором У61 с pH 2,5.

Примечание. При подкислении раствора казеината натрия соляной кислотой первоначально (при значении pH в диапазоне 5,1—3,0) наблюдается образование мелких хлопьев, которые исчезают при дальнейшем добавлении соляной кислоты до pH 2,5.

2.3.6.2.    Для кислых (pH 5,5), нейтральных (pH 7,2) и щелочных (pH 9,5) протеиназ

2.000    г воздушно-сухого казеината натрия растворяют в 90 см³ У61 соответствующего pH, после чего раствор доводят до pH 5,5 (для кислых протеиназ) добавлением нескольких капель раствора соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм³, а до pH 7,2 (нейтральных) и 9,5 (щелочных) добавлением нескольких капель раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм³.

Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки буферным раствором У61 соответствующего pH.

Примечания:

1.    Для сокращения времени растворения казеината натрия раствор готовят при нагревании до температуры 70°С на магнитной мешалке.

2.    Срок хранения раствора в холодильнике в плотно закрытой склянке не более 3 сут.

2.3.7.    Проведение испытания

Берут три пробирки (одна контрольная, две опытные).

В опытные пробирки наливают по 2 см³ субстрата и помещают их в ультратермостат при температуре 30°С.

Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 2 см³ раствора фермента (предварительно термостатированного при 30°С 3—4 мин), пробирки встряхивают и оставляют на шдро-

С. 6 ГОСТ 20264.2-88

лиз ровно на 10 мин при температуре 30°С. Через 10 мин добавляют в обе пробирки по 4 см³ раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирки со смесью при температуре 30°С еще в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Отбирают в пробирки с предварительно налитыми туда 5 см³ раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм³ по 1 см³ фильтрата, перемешивают и быстро приливают по 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяют фотоэлектрическим колориметром против контроля.

Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: для этого в контрольную пробирку наливают 2 см³ ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 см³ ТХУ, выдерживают в ультратермостате при температуре 30°С в течение 10 мин, а затем вносят 2 см³ субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отбирают в сухую пробирку с предварительно налитыми туда 5 см³ раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм³ 1 см³ фильтрата, перемешивают, добавляют 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина.

Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630—670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне 0,07—0,45 для кислых протеиназ и 0,2—0,6 для нейтральных и щелочных протеиназ

При отклонении оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы.

2.3.8. Построение градуировочной характеристики

Для вычисления протеолитической активности строят градуировочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирозино-вый эквивалент (ТЭ), то есть ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см³ стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждой новой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектрического колориметра.

Для построения градуировочной характеристики готовят раствор тирозина концентрацией 10“³ моль/дм³. Для этого 181,2 мг чистого тирозина растворяют в растворе соляной кислоты концентрацией 0,2 моль/дм³ в мерной колбе вместимостью 1 дм³. Из этого исходного раствора тирозина готовят дальнейшие разведения следующим образом.

ГОСТ 20264.2-88 С. 7

Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 1 см* исходного раствора тирозина и доводят объем до метки раствором соляной кислоты концентрацией 0,2 моль/дм³. Концентрация тирозина (ci) при этом составляет 0,2 • 10~⁴ моль/дм³ или 0,02 мкмоль/см³.

Последующие растворы готовят аналогичным образом: раствор 2 : 2 см³ исходного раствора с₂ — 0,4 • 10“⁴ моль/дм³ или 0,04 мкмоль/см³;

раствор 3:4 см³ исходного раствора с₃ — 0,8-10~⁴ моль/дм³ или 0,08 мкмоль/см³;

раствор 4:5 см³ исходного раствора с₄—1,0-10^-4 моль/дм* или 0,10 мкмоль/см³;

раствор 5:7,5 см³ исходного раствора с$—1,5 • 10"⁴ моль/дм³ или 0,15 мкмоль/см³;

раствор 6:10 см³ исходного раствора с_б — 2,0 • 10~⁴ моль/дм³ или 0,20 мкмоль/см³;

раствор 7:15 см³ исходного раствора с₇ — 3,0 • 10^-4 моль/дм³ или 0,30 мкмоль/см³.

Затем берут 7 пробирок, вносят в каждую по 1 см³ раствора тирозина разной концентрации и добавляют при постоянном пере-мешивании по 5 см³ раствора углекислого натрия концентрацией 0,5 моль/дм³ и 1 см³ рабочего раствора Фолина.

Контрольный опыт готовят также, но вместо раствора тирозина берут 1 см³ дистиллированной воды. Дают реакционной жидкости постоять в течение 20 мин.

Интенсивность окраски измеряется фотоэлектрическим колориметром против контрольной пробы в диапазоне длин волн 630— 670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Следует приготовить растворы из двух навесок тирозина и провести два параллельных опыта способом, указанным выше.

По средним данным, полученным из двух опытов, строится градуировочная характеристика, имеющая линейную зависимость.

На оси абсцисс откладывают значение концентрации (с) мкмоль/см³, на оси ординат — соответствующие значения оптической плотности (D),

По градуировочной характеристике находят тирозиновый эквивалент, соответствующий оптической плотности 1 мкмоля тирозина в 1 см³.

2.4. Обработка результатов

Протеолитическую активность (ПС), ед/г, вычисляют по фор-муле

ПС= -Д-⁴—.юоо,

ТЭ-10-/И

где D — оптическая плотность исследуемого раствора;

4 — отношение объемов реакционной смеси и раствора фер~ мента после добавления ТХУ;

С. 8 ГОСТ 20264.2-88

ТЭ — тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной характеристике, см³/мкмоль;

10 —время гидролиза субстрата, мин;

т — масса ферментного препарата, взятая на протеолиз, мг;

1000 — переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата.

Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей двух параллельных навесок не должно превышать 5%. Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5%.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МЕТОДОМ ФОЛП (для определения щелочных протеиназ при pH 10,5)

За единицу протеолитической активности принята способность фермента катализировать гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных условиях:    температуре 40°С, pH 10,5 и времени

гидролиза 1 ч

3.1.    Ап п а р ату р а, материалы, реактивы, растворы

Применяемая аппаратура и материалы по п. 2 2.

Казеин по Гаммерстену.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, раствор концентрацией 0,2 моль/дм³ и 0,5 моль/дм³.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 2156-76, раствор концентрацией 0,2 моль/дм³.

Трихлоруксусная кислота (ТХУ), раствор концентрацией 0,3 моль/дм³.

Натрия гидроокись, раствор концентрацией 1 моль/дм³.

Реактив Фолина по п. 2.3.4.

3.2.    Подготовка к испытанию

3.2.1 Приготовление раствора ферментного препарата

0,100—1,000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) тщательно растирают с небольшим количеством дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности.

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях.

ГОСТ 20264.2-88 С. 9

Для испытания берут две параллельные навески препарата.

Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

3.2.2.    Приготовление карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с pH 10,7

Для приготовления буферного раствора в мерную колбу вместимостью 200 см³ наливают 45 см³ раствора углекислого натрия концентрацией 0,2 моль/дм³ и 5 см³ раствора двууглекислого натрия. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

3.2.3.    Приготовление раствора с массовой долей казеина 1% ( субстрат)

2,000 г казеинового порошка переносят в коническую колбу вместимостью 250 см³ и приливают 140 см³ карбонатно-бикарбо-натного буферного раствора с концентрацией водородных ионов pH 10,7. Колбу ставят на магнитную мешалку и раствор перемешивают в течение 30 мин, затем, продолжая перемешивать, колбу с субстратом помещают в водяную баню и нагревают до температуры 40°С; pH при этой температуре доводят до 10,5 добавлением (если необходимо) раствора гидроокиси натрия концентрацией 1 моль/дм³. Далее раствор субстрата из конической колбы переводят в мерную колбу вместимостью 200 см³, охлаждают проточной водой до 20°С и объем субстрата доводят до метки кар-бонатно-бикарбонатным буферным раствором. Срок хранения субстрата в холодильнике не более 3 сут в плотно закрытой склянке

3.3.    Проведение испытания

В 3 пробирки (одна контрольная) наливают по 5 см³ раствора казеина и выдерживают в ультратермостате при температуре 40°С в течение 5 мин.

В первую пробирку (контрольную) добавляют 2,5 см³ дистиллированной воды, в последующие — по 2,5 см³ испытуемого раствора ферментного препарата.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 60 мин при температуре 40°С.

По истечении времени гидролиза в каждую из пробирок, начиная с первой (контрольной), добавляют по 5 ом³ раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза.

Смесь быстро перемешивают и цля полноты осаждения выдерживают в течение 15 мин при температуре 40°С в ультратермостате Затем растворы фильтруют через фильтровальную бумагу и в фильтрате определяют количество прогидролизованного белка по тирозину. Для этого берут три пробирки и в каждую (начиная с контрольной) наливают по 2 см³ фильтрата, затем медленно приливают в каждую по 5 см³ раствора углекислого