Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

34 страницы

487.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на мясо кроликов и устанавливает методы бактериологического анализа, предусматривающие определение аэробов (сальмонелл, бактерий рода Эшериши, стафилококков, стрептококков, листерий, пастерелл) и анаэробов (ботулизм, перфрингренс)

Показать даты введения Admin

Страница 1

УДК 6J7.J17.9J : S76.S.07 : 00054    Групп»    HIP

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

МЯСО КРОЛИКОВ Методы бактериологического аиапиаа    ГОСТ

Meat of rabbits.    20235.2—74

Methods o( bacteriological analysis

Постановленном Государственного комитата стандарте1 Совета Министров СССР от 3 октябре 1974 г. Н® 22S4 срои ееедеиие установлен

с 01.07.75

Проверен в 1979 г. Срои действие продлен

до 01Л7.90

Несоблюдение стандарта преследуется по мкоиу

Настоящий стаидарт распространяется на мясо кроликов и устанавливает методы бактериологического анализа, предусматривающие определение аэробов (сальмонелл, бактерий рода Эше-риши, стафилококков, стрептококков, лнстернй, пастерелл) и анаэробов (ботулизм, перфрингренс).

«. МЕТОДЫ ОПОРА ОБРАЗЦОВ

1.1.    Отбор образцов проводят по ГОСТ 20235.0-74.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

2.1.    Для проведения анализа применяют: автоклав электрический по ГОСТ 9586-75; котлы с паровой рубашкой;

аппарат Коха;

петлю для бактериологического анализа; баню водяную;

весы лабираторные по ГОСТ 24104-80; воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75; дистиллятор; дуршлаг;

колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 10394-72;

12

1

Переиздание. Май. 1981 г.

Страница 2

ГОСТ 202)1.2—74 Стр. 2

кристаллизаторы по ГОСТ 10973-75; лоток;

лупу по ГОСТ 8309-75; рН-метр;

микроскоп по ГОСТ 8284-78; мясорубку бытовую;

ножницы прямые, изогнутые длиной 14 см; нож;

осветитель ОИ-19; пинцеты;

прибор для счета колоний; пластинку с сеткой для счета колоний; пеналы металлические для пипеток;

поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром соответственно 5, 9 и 10 мм; петледержатели;

проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3—0,5 мм по ГОСТ 492-73;

плитку электрическую;

пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 10515-75; пипетки вместимостью 1, 2, 5 н 10 см3; пипетки пастеровские; скальпель;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75; стекло покровное по ГОСТ 6672-75; спиртовки стеклянные по ГОСТ 10090-74; колбы стеклянные по ГОСТ 10394-72; стаканы стеклянные по ГОСТ 10394-72; ступки фарфоровые с пестиками;

термостат электрический для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до температуры 50°С и с ценой деления 0,2°С;

флаконы стеклянные вместимостью 100—250 см3; холодильник бытовой электрический с температурой в камере

4—6°С;

холодильники походные (сумки);

цилиндры измерительные вместимостью 10, 100, 500 и 1000 см* но ГОСТ 1770-74;

часы песочные на 1, 2 и 3 мин по ГОСТ 10576-74;

чашки Петри по ГОСТ 10973-75;

шкаф сушильный лабораторный;

штативы для пробирок;

бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026-76;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556-75;

нитки по ГОСТ 6309-80;

13

Страница 3

С»р. 3 ГОСТ 202)5.2—74

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-77; ткань для фильтрования;

масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164-78;

мас-ю иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78;

мел химический осажденный по ГОСТ 8253-79;

песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031-75;

экстракт дрожжевой;

диализат дрожжевой;

дрожжи прессованные хлебопекарные;

желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезво женную;

кровь кролика свежую;

молоко обезжиренное;

мясо говяжье по ГОСТ 779-55;

печень говяжью по ГОСТ 19342-73;

аммоний хлористый по ГОСТ 3773-72;

арабинозу;

глюкозу х. ч. по ГОСТ 6038-79; галактозу;

глицерин по ГОСТ 6259-75; дульцнт;

железо хлористое;

йод кристаллический по ГОСТ 4159-79;

калия гидрат окиси;

калий йодистый по ГОСТ 4232-74;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75;

калий хлористый по ГОСТ 4234-77;

калий двухромовокислый по ГОСТ 4220-75;

калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 3204-76;

ксилозу;

кислоту серную по ГОСТ 4204-77; кислоту соляную по ГОСТ 3118-77; кислоту уксусную по ГОСТ 61-75; кислоту карболовую; креатин;

кислоту розоловую;

кальций хлористый кристаллический;

лактозу х. ч.;

малонат;

магний сернокислый; маннит по ГОСТ 8321-74;

магний хлористый кристаллический по ГОСТ 4209-77; мальтозу;

мочевину по ГОСТ 6691-77;

Страница 4

ГОСТ 20335.2-74 Стр. 4

масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78; натрий-аммоний фосфорнокислый; натрий серноватнстокислый СТ СЭВ 223—75; натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773-76;

. натрия гидрат окиси по ГОСТ 4328-77;

натрий фосфорнокислый одиозамещенный по ГОСТ 245-76;

натрий кислый селенистокислый;

натрий лимоннокислый;

натрий двууглекислый по ГОСТ 4201-79;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

п а р а д и м ети л а м идобензол а л ьдегид;

рамнозу;

сахарозу по ГОСТ 5833-75; салицин;

соль закиси железа и аммония двойную сернокислую по ГОСТ 4208-72;

соль натриевую дезоксирибонуклеиновой кислоты; углерод по ГОСТ 4-75;

свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67 (СТ СЭВ 263—76); спирт амиловый чистый;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 6962-67;

хинозол;

фенилаланин;

эфир серный;

индикатор Андреде;

• бром тимоловый синий; брйллиантовый зеленый; генциан фиолетовый; крнсталлвиолег,

метиловый красный по ГОСТ 5853-51; метиловый синий;

феноловый красный по ГОСТ 4599-73; фенолфталеин по ГОСТ 5850-72; фуксин основной;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72; воду питьевую по ГОСТ 2874-73; азур-зозин по Романовскому; эозин;

агар висмут-сульфнтный; агар микробиологический по ГОСТ 17206-71; бактоагар Плоскирева сухой; синьку Леффлера;

пептон сухой для бактериологических целей по ГОСТ 13805-76;

15

Страница 5

Стр. 5 ГОСТ 20135.2-74

пептон импортный чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер»;

кровь кролика свежую; плазму цитратную кроличью сухую; среду Гнсса сухую с индикатором ВР; среду Левина сухую;

сыворотки поливалентные и монорецепторные О и Н — агглю* тнннрующие;

сыворотки антиботулнническне; среду Эндо сухую.

3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

3.1.    Подготовка и стерилизация посуды и материалов.

3.1.1.    Вся посуда для бактериологического анализа перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена.

3.1.2.    Пробирки должны быгь закрыты ватными пробкам» и завернуты в бумагу; горлышки колб и флаконов закрывают ватной пробкой, а сверху — бумажным колпачком, который обвязывают ниткой.

3.1.3.    Пробки для пробирок и колб готовят из ваты, обвертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.

3.1.4.    Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или завертывают в бумагу. Между крышками и дном чашек, предназначенных для разливки среды Эндо, можно положить кружки фильтровальной бумаги диаметром на 1—2 см больше диаметра чашки.

3.1.6.    В конце пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помещают в металлические пеналы по 6—10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.

3.1.6.    Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре 160±5С’С.

При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в течение 30 мин в автоклаве при температуре 126±2°С.

3.1.7.    Стерильную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения до температуры ниже 60°С и хранят в плотно закрытых шкафах или яшиках лабораторных столов.

3.2. Приготовление питательных сред, реактивов, красок

3.2.1. Приготовление мясной води

Говяжье или конское мясо освобождают от костей, жира и сухожилий, измельчают на мясорубке и заливают холодной водой из расчета 1000 см5 воды па 500 г мяса. Смесь воды с измельченным мясом медленно пагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 ч. Небольшое количество смеси (до 5 л) можно кипятить на 16

Страница 6

ГОСТ 2023S.2—74 Стр. 6

открытом огне при частом помешивании во избежание пригора-ния частичек мяса. Большое количество смеси лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности мясной воды сначала фильтруют небольшое количество смеси в пробирку через бумажный фильтр. Если жидкость прозрачная — вода готова.

Затем жидкость и весь сок из вареного мяса отжимают через ткань, доливают кипяченой водой до первоначального объема, разливают в чистую посуду (колбы, бутыли) и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120СС.

3.2.2.    Приготовление мясо-пептонного бульона

К 1000 мл мясной воды, приготовленной по п. 3.2.1, добавляют 10 г сухого пептона н 0,5 г хлористого натрия, кипятят в течение 30 мин, после чего доводят уровень воды до первоначального- объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 7,0—7,2 насыщенным раствором двууглекислого натрия или 10%-ным раствором гидрата окиси натрия, 15—20 мнн стерилизуют при температуре 120°С. Если после стерилизации в мясо-псп-тонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичную стерилизацию для предотвращения выпадения осадка проводят при более низкой температуре.

3.2.3.    Приготовление физиологического раствора

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически-' чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки н стерилизуют 20 мнн в автоклаве при температуре 120СС.

3.2.4.    Приготовление мясо-пептонного агара

К 1000 мл мясо-пептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2, перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50—55°С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см3 мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают pH 7,0—7,4. Разливают во флаконы и пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С.

3.2.5.    Приготовление питательного агара

К 100 см* дистиллированной воды добавляют 5 г порошка ага* ра, тщательно размешивают и кипятят на слабом огне до полного расплавления агара в закрытой посуде при периодическом помешивании во избежание пригорания, фильтруют, разливают в про-

17

Страница 7

Стр. 7 ГОСТ 20235.2-74

бирки или флаконы и 20 мин стерилизуют при температуре 120°С или по 30 мин текучим паром трое суток подряд.

3.2.6.    Приготовление среды Левина

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара с pH 7,0—7,4, приготовленного по п. 3.2.4, добавляют 2 см1 0,5%-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см3 2%-ного раствора эозина, 2 г лактозы и 0,2 г дву-замещенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде н стерилизуют 1 ч при температуре 100°С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна быть красно-фиолетового цвета.

3.2.7.    Приготовление среды Мюллера

Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватнстокислого натрия и Люголя.

В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор стерилизуют текучим паром.

Для приготовления раствора Люголя в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 25 г кристаллического йода, 20 г йодистого халия.

Для приготовления среды Мюллера в стерильную колбу помещают 4,5 г х. ч. мела и стерилизуют сухим жаром, наливают 90 см3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2, стерилизуют 30 мин при температуре 120°С, после чего стерильно добавляют 2 см3 раствора Люголя и 10 см3 раствора серноватистокислого натрия. Среду взбалтывают и разливают в колбы.

3.2.8.    Приготовление среды Кауфмана

К 100 мл стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.2.7, добавляют 1 см* 0,1%-ного водного раствора бриллиантовой зелени и 5 см* стерильной желчи крупного рогатого скота. Смесь хорошо взбалтывают, но не стирилизуют.

3.2.9.    Приготовление селенитовой среды

Сред)' готовят нз двух основных растворов — А и Б.

Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер», 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, 4 г х. ч. лактозы, 100 см3 дистиллированной воды pH 6,9—7,1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112°С.

Раствор Б состоит нз 10%-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

При изменении серии любого нз входящих в среду компонентов (пептона, кислого селенистокислого натрия, фосфатов) производят предварительную подтитровку, для чего экспериментально опреде-18

Страница 8

ГОСТ 20JJ5.1—74 Стр. 8

ляют точную пропорцию фосфорнокислого двузамещенного безводного натрия н фосфорнокислого однозамещенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9—7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.

Для приготовления селенитовой среды к 50 см3 раствора А стерильно добавляют 2 см3 раствора Б. Среду разливают в стерильные пробирки по 5—7 см3, но не стерилизуют.

3.2.10.    Приготовление хлористомагниевой среды <М> (модифицированной) -

Среду готовят из трех основных растворов А, В и С.

Для приготовления раствора А в 90 см3 дистиллированной воды растворяют 0,42 г пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0,15 г однозамещенного фосфорнокислого натри*, 2 мл дрожжевого диализата.

Для приготовления раствора Б в 9 см3 дистиллированной воды растворяют 3,6 г кристаллического хлористого магния.

Раствор С состоит из.0,09 см* 5%-ного водного раствора бриллиантовой зелени.

Для приготовления хлорнстомагнневой среды «М» (модифицированной) растворы А. В и С смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5°С.

Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.

При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.

3.2.11.    Приготовление дрожжевого экстракта

В 2000 мл дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4—6°С в течение пятн-шести суток.

Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см3 0,01%-ного раствора кристаллвиолета. разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4—6°С в течение двух недель.

3.2.12.    Приготовление среды Эндо

К 100 мл холодной дистиллированной воды прибавляют 5 г порошка сухой среды Эндо, тщательно размешивают, нагревают при помешивании до полного расплавления агара, кипятят на слабом огне 3—5 мин, не допуская пригорания. Горячую среду фильтруют через рыхлый ватный, предварительно смоченный дистиллированной водой и отжатый фильтр и вновь доводят до кипения.

После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм и после застывания подсушивают в термостате. Чашки со средой, во избежание ее покраснения, нельзя оставлять

■9

Страница 9

Стр. 9 ГОСТ 20235.2-74

на солнечном свету. Среду готовят непосредственно перед анализом.

3.2.13.    Приготовление среды Плоски рева

В 100 см3 холодной дистиллированной воды тщательно размешивают 6 г порошка сухой среды Плоскнрева, нагревают при помешивании до полного расплавления агара, кипятят на слабом огне 2—3 мин. не допуская пригорання, до образования быстро оседающей крупнопузырчатой пены. Горячую среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм и оставляют их открытыми на 40 мин для остывания и подсушивания, после чего чашки закрывают крышками или картонками и среда готова к посеву.

3.2.14.    Приготовление висмут-сульфитного агара

В 100 см3 холодной дистиллированной воды тщательно размешивают 6 г порошка сухого висмут-сульфитного агара, кипятят на слабом огне 3—5 мин при закрытой крышке или пробке, не допуская пригорання.

После остывания среду разливают в стерильные чашки Петри слоем 4—5 мм, предварительно взболтав для равномерного распределения остатка. Чашки Петри оставляют открытыми на 40 мин для остывания и подсушивания.

3.2.15.    Приготовление среды Гисса

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 0.5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают pH 7,0. прибавляют 0,5 г углерода и 1 см3 индикатора Андреде.

Среду разливают по 5 см3 в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110вС. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. .Можно использовать готовые среды Гисса.

Для приготовления индикатора Андреде к 100 см3 дистиллированной воды добавляют 16 см3 1 н. раствора гидрата окиси натрия и 0,5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110— 112°С. Среду хранят в склянке из темного стекла.

3.2.16.    Приготовление пептонной воды

К 1000 см3 дистиллированной воды добавляют 10 г 'пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают pH 7,2—7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120°С.

3.2.17.    Приготовление среды Кристенсена

К 100 см3 расплавленного мясо-пептонного агара (pH 7.2J, приготовленного по п. 3.2.4. добавляют 0,5 мл 10%-ного водного раствора хлористого железа, стерильно разливают в пробирки столбиком и немедленно охлаждают.

20

Страница 10

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 10

3.2.18.    Приготовление среды Христенсена с мочевиной

К 1000 см1 дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 5 г хлористого натрия, 1 г глюкозы, 2 г фосфорнокислого однозаме-апенного калия, 6 см1 фенолового красного (1 :500) и 20 г мочевины и нагревают до полного растворения солен.

Среду фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH <j.8—6.9. разливают в пробирки по 5—6 см3 и стерилизуют на водяной бане по 15—20 мин трое суток подряд. Готовая среда бесцветная. Особое внимание необходимо обращать на pH среды.

3.2.19.    Приготовление среды для реакции с метилротом и Фо-гес-Проскауэра

В 1000 см3 горячей дистиллированной воды растворяют 5 г дву-замешенного фосфорнокислого натрия, 7 г пептона, 5 г глюкозы, фильтруют и устанавливают pH 6,9—7,0. Среду разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют в водяной бане по 15 мин ежедневно трое суток подряд. Готовая среда должна быть бесцветной и прозрачной.

3.2.20.    Приготовление индикатора бромтимолблау

В 40 см3 дистиллированной воды растворяют 1 г бромтимол-ЧЗлау, нагревают до кипения и добавляют 25 см* 0,1 н. раствора гидрата окиси калия, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый оттенок. Затем дистиллированной водой доводят объ-■ем до 500 см5. Индикатор хранят в темной склянке с притертой пробкой.

3.2.21.    Приготовление агара Симмонса

В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого «атрия, 0,2 г сернокислого магния. 1,5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 2 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия, 20 г агара-агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см3 раствора бромтимолблау (1 :500). Среду разливают в пробирки по 5—б см1, стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мни, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.

3.2.22.    Приготовление фенилаланинового агара

К 1000 мл дистиллированной воды прибавляют 3 г дрожжевого экстракта, 2—1 г DL или L-фенилаланина, 1 г двузамещенного ■фосфорнокислого натрия, 5 г хлористого натрия, нагревают при постоянном помешивании до полного растворения добавленных компонентов. Затем устанавливают pH 7,2—7,4 и добавляют 12 г агара. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Приготовленный агар фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют 10—15 мин в автоклаве при температуре 12ГС. После стерилизации питательную среду скашивают.

21

Страница 11

Стр. II ГОСТ 20235.2-74

3.2.23.    Приготовление полужидкого агара

К мясо-пептонному бульону, приготовленному по п. 3.2.2, добавляют 0,5% агара. Среда должна иметь pH 7,0—7,2. Среду стерилизуют 20 мин при температуре I20X.

3.2.24.    Приготовление плазмы крови

В пробирку вносят 2 см3 5%-ного раствора лимоннокислого натрия и 8 см3 только что полученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник при температуре 4—6°С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета — плазмы, которую разводят физиологическим раствором 1:4.

3.2.25.    Приготовление дефибринировапной крови

В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см3 только что взятой крови кролика и непрерывно встряхивают в течение 10— 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок и обволакивает бусы. Дефнбринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибрнннрованная кровь утрачивает способность свертываться.

3.2.26.    Приготовление среды с беэоксирибонуклеиновой кислотой

В стерильный растопленный 2%-ный мясо-пептоныый агар, приготовленный по п. 3.2.4 или по п. 3.2.5, добавляют натриевую соль дезоксирибонуклеиновой кислоты из расчета 2 г на 1 см* среды. Перед добавлением дезоксирибонуклеиновой кислоты растворяют в дистиллированной воде, содержащей три—пять капель 1 н. раствора гидрата окиси натрия. Среду стерилизуют 30 мин в водяной бане. В среду добавляют хлористый кальций из расчета 0,8 мг на 1 см* разливают в чашки и подсушивают на воздухе. Среда должна иметь pH 8,6.

3.2.27.    Приготовление кровяного агара

К Ю0 мл расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 и охлажденного до температуры 45 С, стерильно прибавляют 5—10 см* дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате Лри температуре 37°С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

3.2.28.    Приготовление среды Китт-Тароцци

500 г говяжьей печени режут на куски массой по 30—40 г, заливают водой и кипятят в течение 15—20 мип. Воду сливают, куски печени разрезают на кусочки массой 1,5—3,0 г, заливают водой, подщелоченной двууглекислым натрием до pH 7,2—7.4. и кипятят в течение 10—15 мин, не допуская бурного кипения. Общее количество добавленной воды 1000 см3. Затем печень промь*-22

Страница 12

ГОСТ 2023S.2—74 Стр. 12

вают в дуршлаге под струей воды в течение I ч н два-три раза дистиллированной водой.

Кусочки печени раскладывают во флаконы, заливают водой и стерилизуют 20 мин при температуре 120СС.

Для приготовления среды Китт-Тароцци пробирки заполняют на 1,0—1,5 см кусочками печени, заливают мясо-пептонным бульоном, приготовленным по п. 3.2.2, с добавлением 1 г глюкозы. Высота слоя бульона 6—7 см в обычных пробирках. 9—10 см — в высоких. На поверхность среды в пробирке перед стерилизацией наслаивают 0,5—1 см3 вазелинового масла. Стерилизуют 20 мин при температуре 120“С.

3.2.29.    Приготовление среды Вильсона-Блера

На дистиллированной воде готовят 20%-ный раствор серноватистокислого натрия и 8%-ный раствор хлористого железа. Оба раствора кипятят.

100 см* 3%-ного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 или п. 3.2.5. растапливают на водяной бане и добавляют 1 г глюкозы, 10 см* 20%-ного раствора серноватистокислого натрия и 1 см3 8%-ного раствора хлористого железа. Среду разливают в пробирки по 7 см3.

3.2.30.    Приготовление кровяного агара Цейсслера

К Ю0 см» мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4 или п. 3.2.5, добавляют I г глюкозы, устанавливают pH 7,2, разливают во флаконы по 100 см3 и стерилизуют 30 мин при температуре 112°С. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до температуры 45°С среде прибавляют 20 см3 свежевзятой дефибринированной крови кролика. Среду разливают в чашки Петри.

3.2.31.    Приготовление молока по Тукаеву

К 1%-ной пептонной воде прибавляют 5—б см* обезжиренного молока, среду подвергают дробной стерилизации по 30 мин при температуре 100°С трое суток подряд. •

3.2.32.    Приготовление среды *Лакмусовое молоко»

Обезжиренное молоко стерилизуют в течение 15—20 мин при

температуре 112°С. Не допускается к применению стерилизованное молоко коричневого цвета и с карамелизованным сахаром.

Перед употреблением к 200 см* стерилизованного молока добавляют примерно 1 см3 лакмусовой настойки до получения сиреневатого окрашивания и 1 см3 солянокислого цистеина до конечной концентрации цистеина 0.08%.

Смесь асептически разливают по пробиркам высоким столбиком, кипятят на водяной бане в течение 15—20 мин и охлаждают. Среду готовят перед проведением анализов.

Для приготовления солянокислого пистенпа 1 г цистеина растворяют в 0,25 см3 1 и. раствора соляной кислоты.

23

Страница 13

Стр. 13 ГОСТ 202)5J—74

3.2.33.    Приготовление лакмусовой настойки

К Ю см’ этилового 96° спирта добавляют I г лакмуса и выдерживают трос суток в термостате при температуре 37°С, ежесуточно сливая окрашенный спирт и заливая новой порцией этилового спирта, после чего лакмус подсушивают в термостате, заливают дистиллированной водой п выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Настойку фильтруют и хранят в темной склянке.

3.2.34.    Приготовление реактива Эрлиха

В 50 см3 этилового 96° спирта растворяют 4 г парадиметилами-добензолальдегнда. затем медленно добавляют 50 см3 концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного стекла при температуре 4—8°С.

3.2.35.    Приготовление реактива Ковача

В 75 см3 амилового спирта растворяют 5 г парадиметиламидо-Зензолальдегида, затем медленно добавляют 25 см* концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного стекла при температуре 4—8°С.

3.2.36.    Приготовление реактива для определения сероводорода

В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислой соды. В этом растворе пропитывают полоски фильтровальной бумаги (1X2 см) н высушивают их при температуре 18—23°С.

3.2.37.    Приготовление реактива для реакции с метилротом

В 300 см3 этилового спирта растворяют 0.1 г метилового красного, затем смешивают с 500 см1 дистиллированной воды.

3.2.38.    Приготовление реактива для реакции Фогес-Проскауэра

В 500 см3 дистиллированной воды растворяют 200 г гидрата

окиси калия. Креатин добавляют на кончике скальпеля в одну пробирку перед употреблением. Креатин хранят в сухом месте.

3.2.39.    Приготовление насыщенного спиртового раствора метиленовой сини

В 100 см3 этилового 96° спирта растворяют 8—9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.

3.2.40.    Приготовление спирто-водного раствора метиленовой сини

К 30 см* дистиллированной воды добавляют 1 см* насыщенного спиртового раствора.

3.2.41.    Приготовление метиленовой сини (Леффлера)

К 100 см* дистиллированной воды добавляют 20 см* насыщенного спиртового раствора метиленовой сини н 1 см* 1%-ного спиртового раствора гидрата окиси калия.

3.2.42.    Приготовление фуксин-насыщенного спиртового раствора

8—9 г основного фуксина высыпают во флакон, заливают

100 см3 этилового 96° спирта и ставят на 18—24 ч в термостат 24

Страница 14

ГОСТ 20US.2—74 Стр. 14

с температурой 37°С. Флаконы периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.

Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла.

Из насыщенного спиртового раствора готовят фуксии-спнрто-водный раствор. Для этого к 1 см* насыщенного раствора прибавляют 9 см5 дистиллированной воды.

3.2.43.    Приготовление фуксина Циля-Карболового

I г основного кристаллического фуксина Циля растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см3 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см* этилового 96° спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Перед работой к одной части карболового фуксина Циля прибавляют девять частей дистиллированной воды.

3.2.44.    Приготовление кристаллвиолета и генциан фиолетового для окраски по Граму

В 100 см3 этилового 96° спирта растворяют 1 г кристаллвиолета и 1 см3 глицерина.

Краску наливают в лоток. Фильтровальную бумагу нарезают полосками шириной 2,0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так, чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при температуре 18—23°С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2X2 см и хранят в банке нз темного стекла.

3.2.45.    Приготовление раствора Люголя

В 10 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают несколько часов до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см3 дистиллированной воды.

3.3. Приготовление препаратов

3.3.1. Поверхность паренхиматозных органов тазобедренных мышц и пораженных участков мяса кролика стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая тампоном, смоченным в спирте. Затем вырезают стерильными ножницами кусочки размером 1,5X1.0Х 1.5 или 2.0X1.5X2,5 см и прикладывают поверхностями срезов к предметному стеклу по три отпечатка на двух предметных стеклах. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают по Граму, Романовскому—Гимза и метиленовой синь-

25

Страница 15

Стр. 15 ГОСТ 3021$.2—74

кой (в зависимости от характера патологических изменений я предполагаемого диагноза). Мазки микросколкруют.

3.3.2. Приготовление мазков из культуры

3.3.2.1.    Метод раздавленной капли

На середину предметного стекла наносят петлей для бактерио-логических испытаний или пипеткой каплю анализируемой культуры, осторожно покрывают ее покровным стеклом, чтобы под ним не образовалось пузырьков воздуха и жидкость не выступала за края покровного стекла.

3.3.2.2.    Для приготовления мазков требуются чистые обезжиренные предметные стекла (капли воды на поверхности чистого сухого стекла должны расплываться, а не принимать шаровидную форму). Чтобы приготовить мазок из культуры с плотной средой,, на предметное стекло наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора или водопроводной воды, затем при соблюдении асептики открывают пробирку или чашку Петри н„ захватив немного материала прокаленной и остуженной бактериологической петлей, размешивают его в этой капле. Полученную взвесь растирают на площади 1 см*. Материал из жидкой средь» берут пипеткой или бактериологической петлей и готовят препарат аналогичным образом непсредственно на стекле.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе. Если высушиваемые препараты содержат патогенный материал, их накрывают стеклянным колпаком. После приготовления мазка петлю прожигают на пламени горелки, а пипетку опускают в сосуд с дс- -зинфнцирующим раствором. Для фиксации мазок трижды медленно проводят через пламя спиртовой или газовой горелки. При излишнем нагревании сильно изменяется структура клеток и мазок плохо окрашивается, при недостаточной фиксации мазок можно смыть при последующей обработке. Фиксацию можно проводить. погружая мазки в фиксирующие жидкости — на 5 ми» в метиловый спирт, на 15—20 мин в этиловый 96° спирт, на 5 ми» в ацетон, па 10—15 мин в смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову. После фиксации препарат высушивают на воздухе.

3.3.3. Окраска препаратов

3.3.3.1. Окраска мазков по Граму

При окраске по Граму на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают карболовый генциан фиолетового на 2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску и, промывая водой, наливают на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1 мин его сливают н наливают этиловый спирт на 0,5—1 мин, причем препарат нужно покачивать и менять спирт.

26

Страница 16

ГОСТ 2023S.2—74 Crp. 16

Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение. 1—2 мин. Краску сливают, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой.

Окраску по Граму можно применять в видоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генциан фиолетового применяют раствор следующего состава: 1 г кристаллвиолета, 100 см* этилового 96° спирта. I см' глицерина (необязательно). Кристалл-виолет можно заменить равным количеством метиллвнолета или генциан фиолетового.

Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят несколько капель воды, которая полностью впитывается бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумажку удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.

3.3.3.2. Окраска спор

Мазок, приготовленный по п. 3.3.2, окрашивают при нагревании 1—2 мин карболовым фуксином Циля, до появления паров, промывают водой и обесцвечивают погружением в 2%-ный раствор азотной кислоты в спирте или 1%-ный водный раствор серной кислоты.

Обесцвечивать нужно так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего. Споры окрашиваются в красный цвет.

3 3.3.3. Окраска капсул методом Михина

Фиксированный мазок окрашивают в течение 2—3 мин синькой Лсффлера при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листками фильтровальной бумаги. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы — в светло-розовый.

3.3.3.4. Окраска капсул истодом Романовского-Гимза

Краску Романовского-Гимза фабричного изготовления перед окрашиванием мазков растворяют из -расчета одна капля краски на 1 см* дистиллированной воды. Разведенную краску наливают в чашку Петри, на дно которой кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, предварительно зафиксированный метиловым спиртом, после высушивания кладут намазанной поверхностью вниз и наливают краску до соприкосновения с мазком. Мазки окрашивают в течение 30—40 мин, затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Микробы окрашиваются в сине-фиолстовый цвет, капсулы — в красно-фиолетовый.

27

Страница 17

Стр. 17 ГОСТ WJJJJ-74

4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

4.1.    Определение аэробов

4.1.1.    Наряду с бактериоскопией мазков-отпечатков проводят посев паренхиматозных органов, пораженных мышц кусочками размером 1,5X1.ОХ 1.5 или 2,ОХ 1.5X2,5 см путем контакта их с поверхностью элективных сред (Эндо, Плоскирева, Левина, вис-мут-сульфитпый агар), а на мясопептонный агар путем посева взвеси материала на его поверхность. Для приготовления взвеси из глубины пораженных мышц н органов берут пробу массой 1—3 г, тщательно растирают в ступке с небольшим количеством стерильного песка, добавляют стерильный физиологический раствор или стерильную воду для разведения материала 1 : 10. Затем стерильной пипеткой берут 0,2—1 см* взвеси и переносят на поверхность мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.4. Внесенный материал стерильным шпателем равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат и выдерживают 16—24 ч при температуре 37°С, а посевы на внсмут-сульфптном агаре — 48 ч. Посевы просматривают невооруженным глазом или под микроскопом с увеличением в 8—10 раз.

4.1.2.    Одновременно с посевами на твердые среды проводят посевы материала па среды обогащения. Анализ проводят по следующей методике. При соблюдении асептики из образца вырезают пробы массой по 25 г (две из мышц и две из паренхиматозных органов), помещают нх отдельно в стерильные ступки. Пробы хорошо измельчают и вносят в 225 см* одной из сред: Мюллера, Кауфмана, селенитового бульона, хлористомагниевой. Посевы выдерживают 16—24 ч при температуре 37°С. Затем из сред обогащения проводят посев на элективные среды и помещают на 16— 48 ч в термостат с температурой 37°С.

В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на твердых питательных средах в дальнейшем проводят анализ проб из образцов на основании определенных при этом отдельных видов микробов.

4.1.3.    Определение сальмонелл

4.1.3.1. Сущность метода заключается в определении сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств сальмонелл.

Биохимические свойства сальмонелл определяют на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты. Под действием ферментов, выделяемых микробами, одни среды остаются неизменными и их цвет не меняется, в то время как другие углеводы и многоатомные спирты расщепляются, образуя кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет среды. 28

Страница 18

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 1»

Некоторые сальмонеллы продуцируют и выделяют протеолити-ческие ферменты, которые расщепляют белки до продуктов глубокого распада — индола и сероводорода.

Серологические свойства определяют в реакции агглютинации с агглютинирующими сыворотками. Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциации культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций.

На средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскнрева) колонии сальмонелл бесцветные, на висмут-сульфитном агаре — черные с металлическим блеском, на месте снятой колонии остается черный след. Черное окрашивание среды зависит от восстановления солей бактериями.

4.1.3.2. Проведение анализа

Если наблюдается обильный рост однородных колоний (чистая культура), то эту культуру используют для анализа. В случае сомнений в чистоте культуры проводят ее пересев на скошенный мясопептонныи агар. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.

При обнаружении характерных колоний на сальмонеллы из небольшой части колонии делают мазок, окрашивают по Граму и определяют подвижность в раздавленной капле. Бактерии сальмонелл представляют собой неспорообразующие маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии из рода сальмонелл подвижны, но из них галлнна-рум и пуллорум неподвижны.

Для изучения биохимических свойств проводят посев на короткий пестрый ряд, состоящий из сред Гисса с лактозой, глюкозой, сахарозой и маннитом.

Часть подозрительной колонии снимают бактериологической петлей и размешивают в 0,5—1 см3 физиологического раствора. Полученную взвесь засевают пастеровской пипеткой на указанные среды и помещают на 12—16 ч в термостат с температурой 3ГС, после чего посевы просматривают и учитывают ферментативные свойства микробов. Бактерии сальмонеллезкой группы не разлагают лактозу и сахарозу, не меняют окраску среды.

Бактерии сальмонеллезной группы расщепляют глюкозу с образованием кислоты и газа, а манннт — с образованием кислоты. Вследствие образования кислоты меняется цвет среды.

Для определения индола и сероводорода посев производят в пептониую воду. Подозрительную на сальмонеллу колонию растирают в 0,5—1 л физиологического раствора. Полученную взвесь засеивают пастеровской пипеткой на указанную среду и помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.

Для определения индола в пробирку с суточной культурой осторожно по стенке добавляют 5—10 капель реактива’Эрлиха.

29-

Страница 19

Стр. 19 ГОСТ 20235.2-74

При наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо, при отсутствии — кольцо остается светло-желтого цвета. Сальмонеллы индола не образуют.

Для определения индолообразования пользуются также реактивом Ковача. К 24-часовой культуре добавляют 0,2—0,3 см* реактива и взбалтывают. Результаты учитывают через 10 мин; реактив поднимается на поверхность среды и при наличии индола окрашивается в темно-красный цвет.

Для определения сероводорода в пробирку с анализируемой культурой под пробки помешают полоски фильтровальной бумаги, смоченные уксуснокислым свинцом и высушенные. Полоски фильтровальной бумаги не должны соприкасаться с питательной средой. Посевы выдерживают в термостате одни—трое суток при температуре 37°С. Если культура выделяет сероводород, то бумажка, смоченная раствором уксуснокислого свинца, чернеет от образующегося сернистого свинца. Сальмонеллы выделяют сероводород.

Для полной биохимической типизации бактерий сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд (табл. 1).

При наличии в препаратах палочек, характерных для сальмонелл и других грамотрицательных бактерий, культуру анализируют в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной О-сывороткой.

Поливалентную агглютинирующую сыворотку применяют для дифференциаций культур рода Salmonella от других возбудителей кишечных инфекций, а монорецептурные О- и Н-сыворотки — для идентификации сальмонеллезных культур.

Предварительно культуры испытывают в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной сывороткой.

Отрицательная реакция с поливалентной сывороткой означает, что испытуемая культура не принадлежит к роду Salmonella пяти основных групп (В, Ci, С*, Дь EJ и последующий анализ с О- и Н-агглютинирующими сыворотками не проводят.

Положительная агглютинация анализируемой культуры дает основание отнести ее к роду Salmonella одной из пяти основных групп (В, Сь Са, Д|, Ej). Такую культуру окончательно идентифицируют в реакции агглютинации с О- и Н-сыворотками, устанавливая в культуре наличие лишь основных, имеющих дифференциальное значение антигенов (табл. 2).

Идентификацию сальмонеллезных культур проводят в следующем порядке. Сначала культуру испытывают в реакции агглютинации с одной из О-сывороток, которую выбирают для кролика. При отрицательной реакции с первоначально взятой О-сывороткой культуру испытывают в реакции агглютинации с остальными четырьмя групповыми О-сывороткамн и на основании положительной реакции агглютинации относят культуру к одной из групп. 30

Страница 20

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 20

oYodoroeoda:»


Таблица


wore и


+ Х X + + +I ++++*+++


М Mil! IMItlM


дмсми

М М М I м м м м

+х >+Т++ I!>+++++

»<оинга

•СОк’ИЭД ‘


"*•**> II < I I I I I ! II I II I


t> ++++X x+>++|++


и 11111 j j i; 11 11


e<oi4i,»W,    +    +    *    +    +    +    +


+ х + + + +(    |


++++++I+


XHBU9W


VrOHBOVdy



antnirKtf


+ +

-*- + + +

teuXdj


ВСОЮТ[/


м м м i м м : i м


llSfiS

Itpli

f i ? i s. I I+lTii


31

Страница 21

Стр. 21 ГОСТ 302)5.2—74

Таблица 2

Группы

Тип

0-*ИТЯГ*НЫ

K-imrenki

(жг)-тг.кочле)

(сочня-

ческве)

I i»*u

H ф»и

В

Sal. abortus (caui) Sal. abortus ovfs

4

enx

4

с

1.6

Sal. typhi murium (Breslau)

4,5

I

U

Sal. paratyphi В

4.5

b

1.2

Sal. abortus bovis

4

b

enx

Sal. heidelberg

4.5

r

1.2 '

с,

Sal. cholerae suis

7

С

I*

Sal. cholerae suis Var. KCinzendorf

7

1.5

с,

Sal. newport

8

eh

U

Sal. bonariensls

8

i

enx

д.

Sal. enteritldls Gartner (diblin)

9

BP

_

Sal. gallinarum

9

Sal. pullorum

9

Е,

Sal. anatum

зло

eh

1.6

Sal. london

3,10

la

1.6

Культуру анализируют в реакции агглютинации с Н-еыворот-ками I п II фазы. В выборе сывороток для реакции исходят из антигенной структуры сальмонелл той группы, к которой отнесена определенная культура с учетом животного, от которого она выделена.

На основании положительной реакции агглютинации с определенными О- и П сыворотками анализируемую культуру относят к одному из серотипов.

Для проведения реакции агглютинации на предметное стекло наносят каплю неразведенной поливалентной О-сыворотки. Платиновой петлей берут анализируемую 20-часовую культуру, выращенную на мясо-пептон ном агаре, приготовленном по п. 3.2.4 или п. 3.2.5. Для агглютинации с поливалентной и О сывороткамн с верхней части агара, а для агглютинации с Н-сыворотками — из нижней части пробирки вблизи конденсационной воды.

Культуру тщательно растирают на стекле у границы капли •сыворотки с последующим смешиванием со всей каплей.

В положительных случаях О-агглютинацня наступает медленно, а агглютинат имеет вид плотных с трудом разбиваемых комочков и зернышек. Н-агглютинация наступает быстрее и агглютинат имеет вид крупных рыхлых легко разбивающихся хлопьев.

32

Страница 22

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 22

Агглютинат в реакции с поливалентной сывороткой имеет смешанный характер (хлопья, зернышки, комочки).

При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки распределяется в ней в виде гомоген-«ой взвеси.

Реакцию агглютинации проводят при хорошем освещении ■с использованием лупы.

4.1.3.3. Обработка результатов

Обнаружение подвижных (кроме Sal. gallinarum, Sal. pullorum), грамотрицательных, не разлагающих лактозу и сахарозу, разлагающих глюкозу и маннит, выделяющих сероводород, не образующих индола, обладающих положительной агглютинацией с поливалентной монорсцепторным О- и Н-агглютииирующими сыворотками бактерий указывает на бактерии рода Salmonella.

4.1.4. Определение бактерий рода Эшерихи

4.1.4.1.    Сущность метода заключается в способности бактерий рода Эшерихи на средах с лактозой (Эндо, Левина, Плоскирева) *>ззлагать лактозу с образованием кислоты, вызывающей окрашивание колоний в зависимости от индикатора среды и дальнейшей дифференциации бактерий по их биохимическим свойствам от других сходных микроорганизмов. Но есть отдельные бактерии рода Эшерихи, которые обладают способностью разлагать лактозу, вследствие чего цвет среды не меняется.

На среде Эндо колонии бактерий рода Эшерихи могут быть ■красными с металлическим блеском или без блеска, розовыми с красным центром или белыми; на среде Плоскирева — кирпично-красными с глянцевой поверхностью: на среде Левина — темно-фиолетовыми блестящими.

4.1.4.2.    Проведение анализа

Из колонии, характерных для бактерий рода Эшерихи, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопнруют. Бактерии рода Эшерихи — маленькие палочки с закругленными концами, по Граму окрашиваются отрицательно.

Для определения подвижности культуры и ее сохранения проводят посев в столбик 0,5%-ного полужидкого агара.

Для более четкого проявления особенности роста прокол среды делают у стенки пробирки и помешают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.

Бактерии рода Эшерихи обладают активной подвижиостью, вследствие чего в столбике полужидкого агара отмечается выра-кенное равномерное помутнение полужидкого агара.

Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола :реды.

33

Страница 23

Стр. 23 ГОСТ 20235.2-74

При наличии колоний, характерных для бактерий рода Эшери-хи, нх дифференцируют от других микроорганизмов Euterobactor riaccae по биохимическим свойствам, указанным в табл. 3.

Таблкца 3-

Дифференцирующие тесты

г

S

0

1

|

•з

•2

t

3

ТРИБЫ

I

</>

ч

т

1

X

с»

1

£

Образование сероюдорода

_

+

+

_

+—

Расщепление мочевины

+—

Образование индола

+—

+

+—

Реакция с метнлротои

+

+

+

+

Реакция по Фогес-Проскауэра

+

Использование цитратов

+

+

*

Дезаминирование фенилаланина

+

Условные обозначения:

<+» — положительная реакция;

«_> _ отрицательная реакция;

«+—» — реакция положительная, реже отрицательная;

*±* — положительная реакция, может быть отрицательной.

Для определения сероводорода анализируемую культуру засевают уколом в столбик среды Кристенсена и помещают на 24—48 ч в термостат с температурой 37Х.

Бактерии рода Эшерихи сероводорода не образуют и среда не меняет цвет.

Микроорганизмы, образующие сероводород, окрашивают среду в черный цвет.

Для установления способности бактерий рода Эшерихи расщеплять мочевину, производят посев культуры в среду с мочевиной (среда Христенсена) и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37°С. Бактерии рода Эшерихи не расщепляют мочевину и цвет среды не меняется. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной и среда приобретает малиновый цвет.

Индол определяют с реактивом Ковача по п. 3.2.35. Бактерии рода Эшерихи чаще образуют индол.

Для определения интенснвности кислотообразования и способности рода Эшерихи продуцировать ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра) проводят посев анализируемой культуры в две пробирки со средой, приготовленной по п. 3.2.19, и помеща-34

Страница 24

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 24

•от на 24—96 ч в термостат с температурой 37°С. Затем в одну пробирку прибавляют пять-шесть капель раствора метиленового красного.

При сильном кислотообразовании среда становится ярко-крас-«рй, при слабом — красно-оранжевой. При отрицательной реакции ■среда становится желтой.

Бактерии рода Эшерихи разлагают глюкозу с образованием кислоты.

Для определения ацетилметилкарбинола ставят реакцию Фо-гес-Проскауэра. К трех-, четырехсуточной культуре прибавляют ■0,5 см3 реактива Фогес-Проскауэра и на кончике скальпеля креатин. Содержимое пробирки взбалтывают и выдерживают 4 ч при температуре 18—24°С.

В результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе цвет среды из слабо-розового переходит в красный; отсутствие изменений в цвете среды рассматривают как отрицательный результат. Бактерии рода Эшерихи не образуют ацетнлметилкарби-нола.

Для определения способности бактерий рода Эшерихи использовать цитраты культуру засевают на скошенный агар Симмонса, посевы выдерживают 24 ч в термостате с температурой 37СС.

Кишечная палочка не растет на среде и не меняет ее цвета, а цитратассимиллирующие микробы растут хорошо, подщелачивают среду, тем самым вызывая ее окрашивание в синий цвет.

Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин производят обильный посев культуры в пробирки со скошенным фениналаниновым агаром и выдерживают 4—24 ч в термостате с температурой 37°С, после чего на косяки с культурой добавляют по четыре-пять капель 0,5 сма раствора хлорида окиси железа. При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет. Бактерии рода Эшерихи не дезаминируют фенилаланин и цвет среды не меняется.

4.1.4.3. Обработка результатов

Обнаружение подвижных грамотрицательных палочек, дающих сильное кислотообразование, образующих индол, не расщепляющих мочевину, не дезаминирующих фенилаланин, не использующих цитраты, не образующих сероводород и ацетилметнлкарбенол указывает на бактерии рода Эшерихи.

4.1.5. Определение бактерий листерий и пастерелл

4.1.5.1.    Сущность метода заключается в выделении бактерий листерий и пастерелл, дифференциации их по культурно-морфологическим, биохимическим свойствам и биологической пробе.

4.1.5.2.    Проведение анализа

35

Страница 25

v.rp. O I UCT 191ИЛ—74

Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препа^ раты-отпечатки по п. 3.3.1, окрашивают по Граму и Романовско-му-Гимза и микроскопируют.

Одновременно производят посев с анализируемых мышц и» мясо-пептонный агар, приготовленный по п. 3.2.4, н на мясо-пеп-тонный бульон с добавлением к нему 2 г глюкозы. Посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при температуре 37°С, после чего производят учет роста колоний.

Из колоний, характерных для листерий и пастерелл, готовят мазки, окрашивают их по Граму, Романовскому-Гимза и микроскопируют. Характеристика возбудителей по культурально-морфологическим свойствам приведена в табл. 4.

Таблица ♦

Х*рвкт*ркс?*ка эоэбухитсгсП

Наамесооапкя похазат«л«Я

лястерслдеэа

ыстееслдма

Морфология в препаратах-отпечатка из материала

Мелкие, часто полиморфные палочки, расположенные одиночно, в виде римской цифры V или частокола

Медхие палочки с закругленными концами, биополярно окрашивающиеся

Рост на мясо-пептонном агаре

Вначале, как и рожистые колонии, через 3—4 суток помутнение колоний

Такие же. как и рожистые колонии

Окраска по Граму

Положительная

Отрицательная

Подвижность

Подвижные

Неподвижные

Морфология в мазках из культуры

Короткие. прямые, овоидные палочки, иногда почти кокки, располагаются одиночно или кучками

Биполярность отсутствует

Рост на мясо-пелтоином бульоне

Равномерное помутнение среды, при встряхивании получаются муаровые волны

Равномерное помутнение. затем проса«тдеиие с обраэованием слизистого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде хосички

Для получения чистой культуры производят посев на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при температуре 37*0, после чего проверяют культуру на чистоту путем микроскопии.

36

Страница 26

ГОСТ 20135.2-74 Стр. 2&

Для определения образования индола и сероводорода производят посев на пептонную воду, а для определения биохимических свойств производят посев на желатин н молоко.

Сероводород и индол определяют по п. 4.1.3.2.

Для определения каталазной пробы в пробирку с культурой на мясо-пептонном бульоне, выдержанной в течение 12—24 ч в термостате при температуре 37’С, добавляют 1 см» 10%-ного раствора перекиси водорода;

При наличии каталазы жидкость вспенивается.

Для того, чтобы выделить бактерии листернй производят глазную пробу: в конъюнктивальный мешок морской свинки вводят одну-две капли смыва физиологическим раствором суточной культуры с мясо-пептонного агара и тщательно втирают в слизистую оболочку глаза морской свинки. Через 24 ч появляется отек века, гипернмия, слезотечение, через 36—72 ч веки опухают и из глаза выделяется гнойный эксудат.

Материалом для подкожного заражения лабораторных животных (кроликов, белых мышей) является 0,2—0,5 см3 чистой культуры возбудителя, животные обычно погибают через 24—48 ч.

Дифференциация листернй и пастерелл по биохимическим свойствам представлена в табл. б.

Таблица 5

)1акмеко»аям« показателей

Ласгермя

Паст«р*ллы

Разжижение желатина

Свертывание маток а

_

Образование сероводорода

+

Образование индола

О

+

Реакция на каталазу

+

О

Действие на морских свинок

+

о

Условные обозначения:

«+> — положительный результат.

<—> — отрицательный результат;

«О* —анализы не проводятся.

4.1.5.3. Обработка результатов

Обнаружение в препаратах-отпечатках мелких палочек, расположенных одиночно в виде римской цифры пять или в виде частокола. грамположительных подвижных, а в мазках из культуры— коротких овоидных палочек, не образующих сероводород и при заражении им»: морских свинок в конъюнктивидный мешочек глаза вызывающих опухоль глаза и выделение гнойного эксудата указывает на возбудителя листериоза.

зт

Страница 27

Стр. 27 ГОСТ 20235.2-74

Обнаружение в препаратах-отпечатках коротких палочек с закругленными концами и хорошо выраженной бнополярностью, а в мазках из культуры — неспорообразуюшнх палочек, грамотри-цательных, неподвижных и не имеющих биополярности, гибель лабораторных животных через 24—48 ч после заражения культурами указывает на возбудителя пастереллеза.

4.1.6. Определение стафилококков

4.1.6.1 Сущность метода заключается в выделении стафилококков, установлении их патогенности в реакции коагулирования крови кролика и определении дезоксирибонуклеазной активности.

4.1.6.2.    Проведение анализа

Для проведения анализа из пораженных мышц готовят препараты, производят посев на мясо-пептонный агар по п. 4.1.1.

Из колоний, характерных для стафилококков, готовят мазки, окрашивают их по Граму и мнкроскопируют. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную форму, располагаются группами различной величины, напоминающие гроздья винограда, иногда поодиночке. После микроскопкрования делают пересев на скошенный мясо-пептонный агар и помещают на 18—24 ч в термостат с температурой 37°С, после чего культуру определяют на патогенность в реакции плазмокоагуляции. Плазму крови кролика, приготовленную по п. 3.2.24, разливают в две стерильные пробирки, в одну из них вносят петлю стафилококковой культуры, другая пробирка служит для контроля. Внесенную культуру тщательно размешивают, после чего обе пробирки выдерживают 2—10 ч в термостате при температуре 37°С. Если в указанное время коагуляции не произошло, то пробирки оставляют на 18 ч при комнаткой температуре. Если через 18 ч плазма не свернулась, то анализируемую культуру стафилококков относят к коагулазоотрицательной.

При получении положительной реакции плазмокоагуляции считают, что в посевах обнаружен патогенный стафилококк.

Для определения дезоксирибонуклеазной активности стафилококков производят посев на среду, приготовленную по п. 3.2.26, н выдерживают 18—20 ч в термостате при температуре ЗТ’С, после чего прибавляют 5 см3 1 н. раствора соляной кислоты. Через 2 — 3 мин ее сливают, а через 7—10 мин определяют результат реакции.

Положительной реакцией считают образование прозрачной зоны вокруг колонии, содержащей продукты расщепления ДНК, которые не осаждаются соляной кислотой.

4.1.6.3.    Обработка результатов

■ Обнаружение грампложительных, расположенных гроздями или поодиночке кокков, способных коагулировать плазму крови 38

Страница 28

ГОСТ 2023S.2—74 Стр. 28

кролика и выделять ДНК-азу указывает на патогенные стафилококки.

4.1.7. Определение стрептококков

4.1.7.1.    Сущность метода заключается в определении характерных колоний на кровяном агаре.

4.1.7.2.    Проведение анализа

Для проведения анализа производят посев на мясо-пептонный агар, приготовленный по п. 3.2.4. На мясо-пептонном агаре стрептококки образуют мелкие круглые плоские прозрачные, а затем мутнеющие колонии. Из колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стрептококки располагаются в мазках цепочкой длиной всего 2—3 кокка, иногда 5—8 кокков, окрашиваются положительно. Для получения чистой культуры делают пересев на сахарный бульон. Посевы помещают на 24 ч в термостат с температурой 37°С.

Стрептококки на бульоне дают придонный рост, бульон остается прозрачным.

Через 24 ч производят пересев культуры с бульона на чашки Петри с кровяным агаром, приготовленным по п. 3.2.27. Посевы выдерживают 18—24 ч в термостате при температуре 37°С.

По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся на гемолитические, дающие вокруг колоний зону гемолиза; зеле-няющие. образующие колонии зеленого цвета без резкого гемолиза; не изменяющие кровяного агара.

4.1.7.3.    Обработка результатов

Обнаружение грамположительных расположенных цепочками кокков, вызывающих гемолиз на кровяном агаре, указывает на патогенные стрептококки в мясе кролика.

4.2. Определение анаэробов

4.2.1.    Определение Cl. perfringens.

4.2.1.1.    Сущность метода заключается в специфическом росте Cl. perfringens в лакмусовом молоке с цистеином и на среде Виль-сон-Блера, на кровяном агаре, а также определении подвижности. Cl. perfringens развивается при температуре 47СС и образует в лакмусовом молоке губчатый красновато-синеватый сгусток.

На среде Вильсон-Блера отмечается сильное газообразование и помутнение среды за счет восстановления сернистокислого натрия в сульфат натрия, который взаимодействует с хлористым железом и образует черный осадок сернистого железа.

4.2.1.2.    Проведение анализа

Для определения Cl. perfringens готовят препараты-отпечатки по п. 3.3.1, окрашивают по Граму и метиленовым синим и микро-скопируют.

В препаратах обнаруживают короткие толстые палочки с закругленными концами, грамположительные. При окраске метиле-

39

Страница 29

Стр. 29 ГОСТ 20215.2-74

новым синим обнаруживают наличие капсул. Одновременно из материала готовят взвесь по п. 4.1.1 и производят посев в две пробирки со средой Китт-Тароцци. Полученную взвесь в количестве 2—3 см3 вносят в каждую пробирку. Перед посевом среду прогревают на водяной бане 20 мин при температуре 80СС для удаления кислорода. Одну из засеянных пробирок также прогревают на водяной бане для уничтожения аэробной микрофлоры. Посевы помещают на пять суток в термостат с температурой 37°С. За появлением роста микроорганизмов наблюдают ежедневно. Развитие Cl. perfringens в среде начинается с появлением равномерной мути по всей толще столбика, отступая от его поверхности на 0,5— 1,0 см. Прорастание спор и деление клеток сопровождаются выделением газа. Среда при развитии в ней Cl. perfringens дает сырный запах. Муть в среде постепенно исчезает, культура остается на дне в виде небольшого осадка. В мазках из 18-, 24-часовой культуры наблюдаются грамположительные палочки. В мазках, приготовленных из осадка, наблюдаются толстые палочки с закругленными концами, со спорами, расположенными группами параллельно друг к другу по две, одиночно или цепочкой.

Подвижность клеток определяют микроскопированием в раздавленной капле. Клетки Cl. perfirngens неподвижны.

При обнаружении в среде Китт-Тароцци характерных для Cl. perfringens палочек производят посев в лакмусовое молоко с цистеином, среду Вильсон-Блера и на кровяной агар. Посевы помещают на 18—24 ч в термостат с температурой 47°С.

Посев на среду Вильсон-Блера производят следующим образом. Среду расплавляют и охлаждают до температуры 45°С. Посев производят пастеровской пипеткой вглубь так, чтобы не попали пузырьки воздуха.

Посевы на чашках Петри с глюкозо-кровяным агаром (по Цейсслеру) выдерживают в анаэростате при температуре 37°С.

При отсутствии анаэростатов можно использовать чашечный метод или метод Виньяля-Вейона.

При использовании чашечного метода в среду, приготовленную по Цейсслеру, вносят 0.25—0,5 см1 анализируемой взвеси. Среду осторожно взбалтывают без образования пены и наливают в крышку стерильной чашки Петри, после чего на почти застывший агар помещают вторую половину чашки Петри так, чтобы дно плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки заливают парафином или замазывают пластилином. Чашки помещают на 18—24 ч в термостат с температурой 37°С. Выросшие колонии рассматривают с помощью лупы.

При использовании метода Виньяля-Вейона засеянный материал набирают в стеклянную трубку (пастеровские пипетки длиной 20 см и диаметром 0,75 см), один конец которой закрыт ватой, 40

Страница 30

ГОСТ 20235.2-74 Стр. 30

а другой оттянут. Среду набирают не более чем на */♦ длины трубки, после чего оттянутый конец трубки запаивают. Трубки со средой помещают в термостат с температурой 37°С. На вторые—пятые сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдельных колоний. При наличии газа столбик агара разрывается.

По истечении срока термостатирования учитывают результат роста:

в пробирках с лакмусовым молоком Cl. perfringens бурно ферментирует молоко с образованием губчатого сгустка красноватосиреневого цвета в верхней части пробирки, при этом сыворотка становится прозрачной;

на среде Вильсон-Блера через 18 ч отмечается образование в глубине агара черных колоний, разрывающих среду вследствие газообразования;

на кровяном агаре образуются круглые; влажные сероватооливковые или зеленые с зоной гемолиза колонии.

4.2.1.3. Обработка результатов

Обнаружение нснодвижных грамположительных палочек, вызывающих бурную ферментацию молока с образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета, черных колоний на среде Вильсон-Блера, серовато-оливковых или зеленых колоний с зоной гемолиза указывает на Cl. perfringens в мясе кролика.

4.2.2.    В случае отсутствия Cl. perfringens анализ продолжают для выявления чистых культур анаэробов и их дифференциации по признакам, указанным в табл. б.

4.2.3.    Определение Cl. botulinum

4.2.3.1.    Сущность метода заключается в выделении Cl. botuli-num и определении специфического действия ботулинических токсинов при постановке реакции нейтрализации противоботулиниче-ской сывороткой на лабораторных животных (мышах).

4.2.3.2.    Проведение анализа Cl. botulinum

Для определения Cl. botulinum готовят препараты-отпечатки по п. 3.3.1 и окрашивают по Граму и метиленовым синим, после чего микроскопнруют.

Обнаружение в препаратах-отпечатках грамположительных толстых палочек с закругленными концами, палочек со спорами, имеющих вид пламени свечи или теннисной ракетки, указывает на возможность Cl. botulinum.

Взвесь готовят по п. 4.1.1 и делают посев в две пробирки со средой Кнтт-Тароцци. Среду предварительно кипятят в течение 20 мнн. Взвесь вносят в каждую пробирку по 2—3 см3. После посева одну из пробирок прогревают в течение 15 мин при температуре 80°С для уничтожения вегетативной микрофлоры. Посевы помещают па 24—92 ч в термостат при температуре 37°С. За ростом бактерий наблюдают ежедневно. Если возбудители боту-

41

Страница 31


to


Форме колони*


Под-

м*-

пост*


Huum

мик^обап

Cl. perfin-gens

Cl. oe-dem-atiens

Cl. Septi-cum

Cl. histoly-tiftum

Cl. toiani


Тонкая, с эакруг ленными концами, ча сто образует длин ные нити

Мелкая, с закруг ленкымн концами


Толстая, грубая, иногда короткая палочка, в организме человека к жнвогно го образует капсулы


Толстая, длинная палочка с закругленными концами; иногда образует цслоэкн


Тонкая, мелкая с закругленными кон цамн


Морфологи*

микробов


Спорообразование в организме наблюдается очень редко; спори расположены центрально нлн суб-термннально

Овальной формы. расположены субтерм инллыю


Субтерминаль-нос, овальной формы

Терммнплыюе. круглой формы (форма барабанных палочек)


Центральное нлн субтермималькос


Расположен** спор и нх форме


Пушистые ко лоиии с уплотненным центром и тонкими пушниками по периферии

Хлопьевидные, с древовидно разветвляющимися отросткам я

Мелкие, плотные. ветвистые, тем но-желтого цвета

Имеет сходство с комочками паты


Дискообразные, чечеинкеобралмые, в редких случаях мохнатые


а столбике агара


В виде извитых нитей и завитков с зоной гемолиза

Мелкие, гладкие, накоминак>-щне капли росы, без гемолиза

Нежный налет в виде переплетающихся нитей


Круглые, влажные. серовато-оливковые или зеленые с зоной гемолиза


Шероховатые, выпуклые, по пе рмферми зона ге молиза


па хромиом агаре


Свертывается медленно и нехарактерно

Быстрая пепто-низация без заметного свертывания


Образует буроватого цвета сгустки с отслоением сыворотки


Молоко свертывается медленно, нехарактерно


Характер росте на молоке


Таблица б


Условные обозначения:    «4- > — подвижные; «—» — неподвижные.

Страница 32

ГОСТ 202JSJ—T4 Стр. 32

лизма находятся в вегетавной форме, то будет наблюдаться рост в иепрогретой пробирке. В случае наличия споровых форм рост будет наблюдаться как в прогретой пробирке, так и в непрогретой.

Рост С), botulinum характеризуется газообразованием и помутнением среды.

Для приготовления мазков пастеровской пипеткой берут культуру со дна пробирки. Мазки окрашивают по Граму и микроско-п иру ют.

Возбудитель ботулизма имеет вид палочек с закругленными концами различной длины и ширины (в зависимости от типа), часто коротких цепочек. Клетки со спорой имеют вид ракетки, отделившиеся споры — овальные. Клетки в молодом возрасте грамположнтельные. При старении культуры (четырех и более суток) появляются грамотрицательные палочки.

Для проведения биологической пробы при определении ботули-нического токсина анализируемый материал растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором 1 :4 и оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15—20 мин. Полученную надосадочную жидкость можно хранить в холодильнике при температуре 4±2°С и испытывать по мере необходимости. Пробы ставят на мышах.

Анализ на ботулинический токсин в мясе проводят следующим образом. Вначале ставят реакцию нейтрализации со смесью про-тнвоботулинических сывороток. Смешивают разные объемы моновалентных сывороток типа А. В, С, Е, F н 0.6 см1 полученной смеси добавляют в пробирку к 2,4 см3 исследуемого центрифугата. В другую (контрольную) прбнрку к 2,4 см3 исследуемого цектрифу-гата добавляют 0.6 см3 физиологического раствора. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают в течение 30 мин при температуре 18—24°С. Для биологической пробы анализируемый цент-рифугат вначале отбирают из контрольной, а затем из опытной пробирки по 1 см3 и вводят двум белым мышам массой по 16—18 г каждая. Осадок центрифугата сохраняют в холодильнике для дальнейшего исследования.

Наблюдение за животными ведут на протяжении 2, 4, 6, 24 ч в течение четырех суток.

При наличии ботулинического токсина две контрольные мыши (которым вводился несмешанный с сывороткой центрифугат) болеют, а иногда погибают, у мышей, которым вводился смешанный с сыворотками центрифугат, признаков заболевания ботулизмом не наблюдается.

В случае гибели контрольных и опытных мышей реакцию нейтрализации повторяют с экстрактом мяса, разведенным в 5, 10^ 20 раз, что дает возможность избавиться от веществ, вызывающих нехарактерную гибель мышей.

Страница 33

Стр. 33 ГОСТ 202JJ.J—74

Если в центрифугате обнаружен ботулинический токсин, то для определения типа токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными типоспецифическими антитоксическими диагностическими сыворотками.

Для этого в шесть пробирок разливают по 2,4 см* фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 см3 сыворотки тина А, В, С, Е и F, а в шестую контрольную пробирку добавляют 0,6 см3 физиологического раствора. Приготовленную смесь выдерживают в течение -30 мин при температуре 18—24 или 37°С, после чего вводят по 1 см3 каждой смеси внутрибрюшно двум мышам. Для взятия пробы из каждой пробирки используют чистый шприц. Результаты учитывают в течение четырех суток через 4—6 ч, затем через 24 ч. Выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, остальные мыши погибают.

Типовую принадлежность определяют по типам сывороток, нейтрализующих токсин.

4.2.3.3. Обработка результатов

Обнаружение палочек, типичных по морфологии для Cl. botu-linum и ботулинического токсина, указывает иа заражение мяса кролика возбудителем ботулизма.

Страница 34

Редактор Т. И. Василенко Технический редактор Э. В. Митяй Корректор Г. И. Чуйко

Сдаио в наб. 29.11.85 Подп. в печ. 29.01.86 2,75 уел. п. л. 3,0 уел. кр.-отт. 2,92 уч.-нзд. л.

Тираж 10 ООО Цена 15 коп.

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123840, Москва, ГСП, Новопресненский пер., д. 3.

Вильнюсская типография Издательства стандартов, ул. Миндауго, 12/14. Зак. 5334.