Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

8 страниц

244.00 ₽

Купить ГОСТ Р 56058-2014 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетически-модифицированной сои (ГМ сои) и генетически-модифицированной кукурузы (ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).

 Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины и определения

4 Условия выполнения испытаний и требования безопасности

5 Оборудование, материалы и реагенты

6 Сущность метода

7 Отбор проб

8 Экстракция ДНК

9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

 
Дата введения01.07.2015
Добавлен в базу21.05.2015
Актуализация01.01.2019

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

09.07.2014УтвержденФедеральное агентство по техническому регулированию и метрологии705-ст
ИзданСтандартинформ2015 г.
РазработанФГБУ ВГНКИ

Feed and feed additives. Methods of identification and determination GMO of plant origin

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8

ГОСТР

56058—

2014

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА И КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ

Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения

Издание официальное



ГОСТ P 56058—2014

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 «Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. № 705-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к наслюящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

©Стандартинформ. 2015

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА И КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ

Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения

Feed and feed additives Methods of identification and determination GMO of plant origin

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетиче-ски-модифицированной сои (далее - ГМ сои) и генетически-модифицированной кукурузы (далее - ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 31719-2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

ГОСТ Р ИСО 6497-2011 Корма для животных. Отбор проб

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 51848-2001 Продукция комбикормовая. Термины и определения

ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически-модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты*, который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия) Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины, определения и сокращения по ГОСТ Р ИСО 6497, ГОСТ Р 51848. ГОСТ Р 55576 и ГОСТ 31719.

4    Условия выполнения испытаний и требования безопасности

Условия выполнения испытаний и требования безопасности - по ГОСТ Р 55576 (раздел 4. приложение А).

Издание официальное

5 Оборудование, материалы и реагенты

5.1    Требования к оборудованию - по ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025.

5.2    При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719. а также следующие:

-    бокс ламинарный II класса биологической безопасности:

-    отсасыватель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости:

-    микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1.5 см.

-    микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см3;

-    ПЦР-бокс;

-    прибор для проведения ПЦР;

-    халаты медицинские.

Допускается использование другого оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3    При проведения испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК по ГОСТ Р 55576. а также следующие реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации.

5.3.1    Реагенты:

-    вода деионизованная:

-    ПЦР-буфер;

-    раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) 10’ (10-кратная смесь четырех компонентов с концентрацией каждого компонента 1.76 1 2 10 ' моль/дм3);

-    Гар-полимераза термостабильная:

-    образцы стандартные состава ГМ сои и ГМ кукурузы, содержащие от 0.1 % до 5.0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы .

Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3.2    Праймеры (смесь олигонуклеотидов) и зонды (меченные флуоресцентными красителями FAM и R6G):

5.3.2.1    Для определения ГМ сои линии 40-3-2:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5'- GCC ATG TTG ТТА ATT TGT GCC АТ 3‘;

2)    праймер 2: 5'- GAA GTT CAT ТТС ATT TGG AGA GGA С 3‘;

3)    зонд: 52- FAM-CTT GAA AGA ТСТ GCT AGA GTC AGC TTG ТСА GCG - BHQ1-3';

б)    специфичные гену лектина (/eel):

1)    праймер 1: 5 -ТСС ACC ССС АТС САС ATT Т -3‘;

2)    праймер 2: 5'- GGC АТА GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3';

3)    зонд: 5’ - R6G-AAC CGG TAG CGT TGC CAG СТТ CG -BHQ1 -3';

5.3.2.2    Для определения ГМ сои линии А2704-12:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 52- GCA AAA AAG CGG ТТА GCT ССТ-3-;

2)    праймер 2:5 - ATT CAG GCT GCG CAA CTG ТТ-Э';

3)    зонд: 5'- FAM-CGG ТСС ТСС GAT CGC CCT TCC-BHQ1-32;

б)    специфичные гену лектина (/ec2):

1)    праймер 1: 5 -CAC СТТ TCT CGC ACC AAT TGA CA-3';

2)    праймер 2: 5 -TCA AAC ТСА АСА GCG ACG AC-3';

3)    зонд: 5 -R6G-CCA CAA АСА CAT GCA GGT TAT CTT GG -BHQ1 -3'.

5.3.2.3    Для определения ГМ сои линии А5547-127: а) специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5’- GCT ATT TGG TGG CAT TTT ТСС А 3‘;

2)    праймер 2: 52- САС TGC GGC CAA СТТ ACT ТСТ 3‘;

3)    зонд: 5 - FAM-CC GCA ATG ТСА ТАС CGT CAT CGT TGT-BHQ1-3'; б) специфичные гену лектина (/есЗ):

1)    праймер 1: 5 - CCT ТСТ CGC ACC AAT TGA СА -3‘;

2)    праймер 2: 5 - ТСА ААС ТСА АСА GCG ACG АС -32;

ГОСТ Р 56058-2014

3) зонд: 5-R6G-CC АСА ААС АСА TGC AGG ТТА ТСТ TGG-BHQ1 -3‘:

5.3.2.4    Для определения ГМ кукурузы линии MON 810:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5-TCG AAG GAC GAA GGA СТС ТАА CGT-3';

2)    праймер 2: 5-GCC ACC ТТС СТТ ТТС САС TAT СТТ-3';

3)    зонд: 5-FAM-AAC АТС СТТ TGC CAT TGC CCA GC-BHQ1-3';

б)    специфичные гену зеина (hmg):

1)    праймер 1: 5-TTG GAC TAG AAA ТСТ CGT GCT GA-3';

2)    праймер 2: 5-GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС Т-3';

3)    зонд: 5-R6G-CAA ТСС АСА САА ACG САС GCG TA-BHQ1-3';

5.3.2.5    Для определения ГМ кукурузы линии NK 603:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5-ATG ААТ GAC СТС GAG ТАА GCT TGT ТАА-3*;

2)    праймер 2: 5-AAG AGA ТАА CAG GAT ССА СТС ААА САС Т-3*;

3)    зонд: 5-FAM-TGG ТАС САС GCG АСА САС ТТС САС TC-BHQ1-3';

б)    специфичные гену зеина (adhl 1):

1)    праймер 1: 5-ССА GCC ТСА TGG CCA AAG-3’;

2)    праймер 2: 5-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3';

3)    зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3';

5.3.2.6    Для определения ГМ кукурузы линии Bt 11:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5-GCG GAA ССС СТА ТТТ GTT ТА-3';

2)    праймер 2: 5-ТСС AAG ААТ ССС ТСС ATG AG-3';

3)    зонд: 5 -FAM-AAA ТАС ATT САА АТА TGT АТС CGC TCA-BHQ1-3';

б)    специфичные гену зеина (adhl 2):

1)    праймер 1: 5-CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ СС-3*;

2)    праймер 2: 5 -ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3';

3)    зонд: 5-R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ТСТ CGC ТСС TCA-BHQ1-3';

5.3.2.7    Для определения ГМ кукурузы линии 725:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5’- АСА AGC GTG TCG TGC ТСС АС-3-;

2)    праймер 2: 5‘- GAC ATG АТА СТС СТТ ССА CCG-3’;

3)    зонд: 5-FAM-TCA TTG AGT CGT ТСС GCC ATT GTC G-BHQ1-3';

б)    специфичные гену зеина (adhl 3):

1)    праймер 1: 5-CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ ССТ-3*;

2)    праймер 2: 5 -ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3':

3)    зонд: 5-R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ТСТ CGC ТСС TCA-BHQ1-3';

5.3.2.8    Для определения ГМ кукурузы линии GA 21:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5-СТТ АТС GTT ATG СТА ТТТ GCA ACT ТТА GA-3';

2)    праймер 2: 5 -TGG СТС GCG АТС СТС СТ-3';

3)    зонд: 5-FAM-CAT АТА СТА ACT CAT АТС ТСТ ТТС ТСА АСА GCA ССТ GGG-BHQ1-3*;

б)    специфичные гену зеина (adhl 4):

1)    праймер 1: 5 -ССА GCC ТСА TGG ССА AAG-3*;

2)    праймер 2: 5 -ССТ ТСС TTG GCG GCT TAT CTG-3’;

3)    зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3';

5.3.2.9    Для определения ГМ кукурузы линии MIR 604:

а)    специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5 -GCG САС GCA ATT САА CAG-3';

2)    праймер 2: 5-GGT CAT ААС GTC ACT ССС ТТА ATT СТ-3';

3)    зонд: 5 -FAM-AGG CGG GAA ACG АСА АТС TGA ТСА TG-BHQ1-3';

б)    специфичные гену зеина (adhl 5):

1)    праймер 1: 5 -CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ СС-3';

2)    праймер 2: 5 -ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3';

3)    зонд: 5 -R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ТСТ CGC ТСС TCA-BHQ1-3';

5.3.2.10    Для определения ГМ кукурузы линии MON 863: а) специфичные целевой последовательности:

1)    праймер 1: 5 -GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA С -3';

2)    праймер 2: 5-TGT ТАС GGC СТА ААТ GCT GAA СТ-3';

3)    зонд: 5 -FAM-TGA АСА ССС АТС CGA АСА AGT AGG GTC A-BHQ1-3';

3

б) специфичные гену зеина (adhl 6):

1)    праймер 1: 5-ССА GCC ТСА TGG CCA AAG-3';

2)    праймер 2: 5-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3';

3)    зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3'.

6    Сущность метода

6.1    Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка эндогенной ДНК, характерной для всех линий ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка рекомбинантной ДНК. специфичной для определенных генетических линий.

6.2    Возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ Р 53244

7    Отбор проб

Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспортирования - по ГОСТ Р 55576.

8    Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК проводят в соответствии с ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.

9    Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси


Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы вионизованной воды, no 1 мм каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10* моль


мм деионизо 1 мм' каждогс


праймера

каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10 ’


берут 1 мольУдм . по

мопь/дмл, no 1 мм° каждого зонда по 5.3.2


концентрацией 3 * КГ* моль/дм3, 3 мм ’ раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешивают в пробирке вместимостью 1.5 см3.

Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 °С - не более 12 мес.


9.2 Постановка ПЦР


9.2.1    ДНК. экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее, чем в двух повторностях.

9.2.2    Для проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм ПЦР-смеси по 9.1. 5 мм5 ПЦР-буфера и 0.5 мм3 полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на мик-роцентрифуге-встряхивателе в течение 15-30 с.

9.2.3    В микропробирку вместимостью 0.2 см' вносят по 15 мм3 смеси, полученной по 9.2.2. затем. используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм3 ДНК. полученной экстракцией из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции -25 мм3.

9.2.4    Ставят контрольные реакции амплификации:

-    отрицательный контрольный образец (К-) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм3 ТЕ-буфера;

-    положительный контрольный образец (К+) - вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм3 1 %-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.

9 2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными образцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микропробирки со смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм3 каждого стандартного образца, содержащего от 0.1 % до 5.0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.

Примечание - Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диапазона


9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала

Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.


4


Таблица 1

Стадия амплификации

Программа

Денатурация первичная

95 °С/5 мин

95 °С/15 с

45 циклов

60 °С/30 с

72 °С/30 с

Детекцию проводят при температуре 60 °С по каналам FAMIGreen, JOElYellow.

Программа амплификации для количественного определения ГМ кукурузы приведена в таблице

2.

Таблица 2

Стадия амплификации

Программа

Денатурация первичная

95 °С/15 мин

10 циклов

95 °С/15 с 60 °С/20 с 72°С/15с

35 циклов

95 °С/15 с 55 °С/20с 72 °С/15 с

Детекцию проводят при температуре 55

'С по каналам FAMIGreen, JOElYellow.


Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции для генетической линии, по каналу JOE - для эндогенной ДНК ГМ сои или ГМ кукурузы. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR).

Границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р= 0.95, составляют от 0,1 % до 5.0 %, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием стандартных образцов.

Стандартное отклонение повторяемости результатов б составляет от 0,067 (для 0,1 %) до 0,54 (для 5 %).

Коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по стандартным образцам ГМО, (/?■’) > 0,97. Если коэффициент корреляции Rr менее 0,97 - требуется повторный анализ всех проб, начиная с этапа амплификации.

9.4    Учет результатов

Учет результатов и расчет содержания ГМ сои или ГМ кукурузы проводят по ГОСТ Р 53244.

9.5    Возможные ошибки

Возможные ошибки - по ГОСТ Р 55576 (подраздел 10.3).


5


УДК 636 086 15:636.086.006 034    ОКС    65    120

Ключевые слова: корма, кормовые добавки, генетически модифицированные организмы, генетически модифицированная соя, генетически модифицированная кукуруза, полимеразная цепная реакция, гибридизационно-флуоресцентная детекция в режиме реального времени, амплификация, рекомбинантная ДНК. праймеры, зонды

Подписано в печать 02.02.2015. Формат 60x847*

Уел. печ. л. 0.93. Тираж 31 экз. Зак. 298.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва. Гранатный пер.. 4 www.gostinfo.ru    info@gostinfo.ru

1

’ Прибор для проведения ПЦР 2Rotor-Gene2 2000/3000/6000 (• Corbett Research2. Австралия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта

2

Стандартные образцы состава ГМ сои и ГМ кукурузы «Сигма Алдрич2,ССМ от JRC, IRMM Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта 2