ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ Метод определения витамина D₃

Издание официальное

Москва Стандарти нформ 2013

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    РАЗРАБОТАН Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания РАМН

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 «Функциональные пищевые продукты»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. №786-ст

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2013

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

II

ветствовать всему диапазону определяемых концентраций витамина D₃. Коэффициент градуировочного графика к определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов к_п вычисляемых по формуле

где С, — массовая концентрация микронутриентов в /'-м градуировочном растворе, мкг/см³;

S, — площадь пика /'-го градуировочного раствора, mAU - с (AU - с) или высота, мм.

Проводят хроматографический анализ не менее четырех рабочих стандартных растворов витамина D₃, приготовленных по 8.1.2.5.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации R²>0,997.

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9    Выполнение измерений

В колонку хроматографа для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ последовательно вводят равные объемы испытуемого раствора по 8.2.7 и одного из градуировочных растворов по 8.1.2.5.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя время удерживания, спектры в УФ-диапазоне длин волн или соотношения интенсивности сигнала детектора при различных длинах волн для соответствующих пиков стандартов и определяемых соединений.

10    Обработка и оформление результатов

Поправочный коэффициент к рассчитывают с помощью метода внутреннего стандарта по формуле

f£ — ^н.ст ~^х    (4)

9 С ’

'-’х ^вн.ст

где S_{BH ст} — площадь (mAU • с или AU • с) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина D₂;

S_x — площадь (mAU • с или AU • с) или высота (мм) пика определяемого витамина D₃;

С_вн ст — массовая концентрация внутреннего стандарта витамина D₂ по 8.1.2.3, мкг/см³;

С_х — массовая концентрация определяемого витамина D₃, мкг/см³.

Массовую долю витамина D₃ в анализируемом образце X, млн^-1, рассчитывают по формуле

X = к■ ^m-m.<*'^sx ,    (5)

т_пр ^вн.ст

где /Т7_{ВН ст} — масса внутреннего стандарта (витамина D₂), добавленного к навеске пробы анализируемого образца, мг;

/Т7_пр — масса пробы, взятой для омыления, кг;

S_{BH ст} — площадь (mAU • с или AU • с) или высота (мм) пика внутреннего стандарта витамина D₂;

S_x — площадь (mAU • с или AU • с) или высота (мм) пика определяемого витамина D₃; к — поправочный коэффициент, рассчитанный по формуле 4.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений Х_р Х₂ (в процентах от среднего значения Х_ср), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать норматива контроля сходимости г с доверительной вероятностью 95 %.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение Х_пп.

Г раницы относительной погрешности определения массовой доли витамина D₃ ± 5, в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95 % не должны превышать значений, указанных в таблице 2.

ГОСТ Р 54637-2011

Результат определения витамина D₃ представляют в следующем виде:

Х_ср + Д, млн”¹ при Р = 95 %,    (6)

где Х_ср — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, млн^-1;

Д — значение границы абсолютной погрешности определений, млн^-1, рассчитанное по формуле

д = М5Е    (7)

100 ’

где 8 — значение границы относительной погрешности измерений, % (таблица 2).

11 Метрологические характеристики метода

11.1    Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений (X,, Х₂), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени считают удовлетворительным, если |Х₁ -Х₂| <0,01'ГХ , гдеХ_ср — среднеарифметическое значение. Значение г (предел повторямости) приведено в таблице 2.

При превышении гиспытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2    Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений (X_v Х₂), выполненными разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |Х₁ -Х₂| <0,01- R• X, гдеХ— среднеарифметическое значение. Значение R (предел воспроизводимости) приведено в таблице 2.

Таблица 2 — Основные метрологические характеристики метода

Метрологическая характеристика (Р = 0,95) Диапазон измерений, млн 1 от 0,1 до 0,5 включ. св. 0,5 до 1,0 включ. Стандартное отклонение повторяемости sr, % 8,8 7,1 Предел повторяемости г, % 25 20 Стандартное отклонение воспроизводимости sR, % 10,6 8,8 Предел воспроизводимости R, % 30 25 Границы относительной погрешности (± 8), % 25 20 Предел обнаружения, млн-1 0,03

При превышении R испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3 Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина D₃ в количестве, составляющем 50 %—150 % от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина D₃ в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности /С_доб, млн^-1:

|Хд₀б Х_ср Сд₀б|^Кдоб,    (8)

гдеХ_Д0б — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, млн^-1;

Х_ср — среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, млн^-1;

Сдоб — массовая доля добавки, млн^-1.

9

При проведении внутрилабораторного контроля значение /С_доб рассчитывают (при доверительной вероятности 90 %) по формуле

(9)

где 8—значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина D₃, указанное в таблице 2.

При проведении межлабораторного контроля значение /С_доб рассчитывают (при доверительной вероятности 95 %) по формуле

(10)

11.4 Контроль стабильности результатов при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).

10

ГОСТ Р 54637-2011

Библиография

Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением

Эфир медицинский

Кислота аскорбиновая(витамин С)

Кислота аскорбиновая (витамин С)

11

УДК 664.001.4:006.354    ОКС 67.050 Н59    ОКСТУ9Ю9

Ключевые слова: продукты пищевые функциональные, витамин D₃, холекальциферол, определение содержания, высокоэффективная жидкостная хроматография

Редактор Л.В. Коретникова Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор Ю.М. Прокофьева Компьютерная верстка И.А. Налейкиной

Сдано в набор 10.12.2012. Подписано в печать 30.01.2013. Формат 60 х 84%. Гарнитура Ариап. Уел. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,35. Тираж 225 экз. Зак. 96.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.rn    info@gostinfo.ru

Набрано во ФП/П «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

ГОСТ Р 54637-2011

Содержание

1    Область применения...................................................1

2    Нормативные ссылки..................................................1

3    Термины и определения................................................2

4    Сущность метода.....................................................2

5    Требования безопасности...............................................3

6    Условия выполнения испытания...........................................3

7    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы................4

8    Подготовка к выполнению измерений........................................5

9    Выполнение измерений.................................................8

10    Обработка и оформление результатов......................................8

11    Метрологические характеристики метода.....................................9

Библиография........................................................11

III

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

Метод определения витамина D₃

Functional food products.

Method of vitamin D₃ determination

Дата введения — 2013—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина D₃ (холекальциферола) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина D₃ составляет от 0,1 до 1,0 млн^-1.

Примечание — Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы)измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, при

меняемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Тех

нические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие тех

Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры

и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы

испытании

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание витамина D₃: Массовая доля холекальциферола, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионныхдолях(млн^-1).

4 Сущность метода

Витамин D₃ экстрагируют после омыления анализируемой пробы с использованием раствора гидроксида калия. Полученный экстракт используют для выделения методом полупрепаративной нормально-фазной (далее — НФ) ВЭЖХ фракции, содержащей витамин D₃, и затем проводят анализ с использованием аналитической обращенно-фазной (далее — ОФ) ВЭЖХ. Витамин D₃ детектируют по поглощению в ультрафиолетовой области спектра, пики идентифицируют по их времени удерживания и спектру.

Количественный анализ проводят с помощью метода внутреннего стандарта, используя площадь или высоту пиков. В качестве внутреннего стандарта для определения витамина D₃ используется витамин D₂. ¹

ГОСТ Р 54637-2011

5    Требования безопасности

5.1    Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности — ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами — ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2    Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям химик, инженер-химик, техник, лаборант, имеющие опыт работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6    Условия выполнения испытания

6.1    Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды — (25 + 5) °С; относительная влажность — (65 + 15) %; частота переменного тока — (50 + 5) Гц; напряжение в сети — (220 + 10) В.

Хранение стандартных веществ проводят в защищенном от света месте и при температуре не выше 4 °С.

При приготовлении ихранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения витамина D₃ анализ испытуемой пробы и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (L-аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2    Условия хроматографического анализа

Температура колонки: 25 °С или температура окружающей среды.

Объемная скорость подачи подвижной фазы для НФ и ОФ ВЭЖХ: 0,7—1,0 см²/мин.

Объем вводимой пробы для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ: 0,20—0,25 см².

Объем вводимой пробы для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ: 0,1 см².

Подвижная фаза для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): н-гек-сан : 2-пропанол (98:2) или н-гексан : 2-пропанол : тетрагидрофуран (98:1:1).

Подвижная фаза для проведения аналитической ОФ ВЭЖХ (в объемном соотношении): ацетонитрил : метиловый спирт (80:20) или ацетонитрил : метиловый спирт : метилен хлористый (50:45:5).

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях полупрепаративной НФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа раствора анализируемой пробы по 8.2.5. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения пика витамина D от пиков токоферолов матрицы составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения в условиях аналитической ОФ ВЭЖХ осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора витаминов D₂ и D₃ с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,5 мкг/см². Данный раствор готовят из основных растворов по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2.1 и 8.1.2.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков витаминов D₂ и D₃ составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других подвижных фаз и колонок.

7 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1    Для определения массовой доли витамина D₃ применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

-    весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности + 0,1 мг;

-    спектрофотометр со спектральным рабочим диапазоном от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %;

-    кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;

-    хроматограф для проведения анализа методом полупрепаративной ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода пробы; колонку для проведения анализа методом полупрепаративной НФ ВЭЖХ диаметром 0,4—0,46 см, длиной 25—30 см, заполненную силикагелем или силикагелем, модифицированным CN- или МН₂-группами с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10 % отн., устройство для сбора фракций, регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1 %; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

-    хроматограф для проведения анализа методом аналитической ВЭЖХ, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; колонку для проведения анализа методом аналитической ОФ ВЭЖХ диаметром 0,40—0,46 см, длиной 25—30 см, заполненную октадецилсиликагелем, с размером частиц 5 мкм; спектрофотометрический (длина волны детектирования 265 нм) или диодно-матричный детектор с погрешностью измерений не более 10 % отн., регистрирующее устройство (самописец или интегратор), позволяющее проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1 %; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

-    фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);

-    микрошприцы типа «Гамильтон» вместимостью 0,2 см³ и 0,5 см³ для ввода проб в жидкостный

хроматограф;

-    пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более + 1 %;

-    цилиндры 1-50(Ю0,250)-1(2)поГОСТ 1770;

-    колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770;

-    пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1 (0,2)ХС по ГОСТ 1770;

-    стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336;

-    колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;

-    воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ25336;

-    линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;

-    встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100—150 колебаний в минуту;

-    центрифуга, обеспечивающая 4—6 тыс. об/мин;

-    баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 30 °С до 100 °С;

-    баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм³;

-    испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт. ст. до 760 мм рт. ст. (от 9 • 10² Па до 10 • 10³ Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;

-    холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;

-    термометр лабораторный жидкостный с диапазоном температур от 0 до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498;

-    баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос. ч. и [1];

-    бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;

-    плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;

-    мельница лабораторная электрическая;

-    холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2    При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

-    абсолютный этиловый спирт (С₂Н₅ОН) массовой долей основного вещества не менее 99,9 %;

-    ректификованный этиловый спирт (С₂Н₅ОН) массовой долей основного вещества не менее 96 % или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;

ГОСТ Р 54637-2011

-    метиловый спирт (СН₃ОН), массовой долей основного вещества не менее 99,9 %;

-    ацетонитрил (CH₃CN), массовой долей основного вещества не менее 99,8 %;

-    метилен хлористый (СН₂С1₂), массовой долей основного вещества не менее 99,8 %;

-    н-гексан (С₆Н₁₄), массовой долей основного вещества не менее 99,5 %;

-    этилацетат (С₄Н₈0₂), массовой долей основного вещества не менее 99 % или по ГОСТ 8981;

-    2-пропанол (С₃Н₈0), массовой долей основного вещества не менее 99,5 %;

-    тетрагидрофуран (С₄Н₈0), массовой долей основного вещества не менее 99,5 %;

-    петролейный эфир, перегнанный при температуре (50 + 10) °С, очищенный от перекисей;

-    диэтиловый эфир, очищенный от перекисей, содержащий 0,1 % пирогаллола по [2];

-    калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363, х. ч. или ч. д. а., раствор КОН массовой долей 50 %;

-    натрий сернокислый (Na₂S0₄) безводный, массовой долей основного вещества не менее 99,5 % или по ГОСТ 4166, х. ч.;

-    дистиллированную воду по ГОСТ 6709;

-    кислоту аскорбиновую (С₆Н₈0₆) по [3] или [4], х. ч.;

-    гидрохинон (С₆Н₆0₂), массовой долей основного вещества не менее 99 % или по ГОСТ 19627;

-    пирогаллол (С₆Н₆0₃), массовой долей основного вещества не менее 99 %;

-    бутилгидрокситолуол — БГТ (С₁₅Н₂₄0), массовой долей основного вещества не менее 99 %, раствор БГТ в н-гексане массовой концентрацией 2 мг/см³;

-    эргокальциферол (витамин D₂), М (С₂₈Н₄₄0) = 396,7 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 98 %;

-    холекальциферол (витамин D₃), М (С₂₇Н₄₄0) = 384,6 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 98 %.

7.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерений, а также реактивов и материалов по качеству нехуже вышеуказанных.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1    Приготовление растворов

8.1.1    Исходные растворы стандартов

8.1.1.1    Для приготовления исходного раствора витамина D₂ в мерную колбу объемом 100 см³ помещают около 100 мг витамина D₂, растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см³ витамина D₂. Массовую концентрацию исходного раствора витамина Ь₂ уточняют по 8.1.2.1.

8.1.1.2    Для приготовления исходного раствора витамина D₃ в мерную колбу объемом 100 см³ помещают около 100 мг витамина D₃, растворяют в этиловом ректификованном спирте и доводят до метки спиртом. Этот раствор содержит около 1 мг/см³ витамина Ь₃. Массовую концентрацию исходного раствора витамина Ь₂ уточняют по 8.1.2.2.

Приготовленные растворы хранят в темноте при температуре не выше 4 °С.

8.1.2    Рабочие растворы стандартов

8.1.2.1 1 см³ исходного раствора витамина D₂ , приготовленного по 8.1.1.1, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят до метки этиловым ректификованным спиртом. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D₂ составляет 10 мкг/см³.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина D₂ проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина D₂ (C_Di, мкг/см³) используют уравнение:

Q - ^265 • 10⁶    (1)

°²    100-475’

гдеЛ₂₆₅ — значение оптической плотности рабочего раствора витамина D₂ при 265 нм;

475 — значение оптической плотности раствора витамина D₂ массовой концентрации 1 г в 100 см³ при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см (Е.^);

10⁶ — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 — коэффициент пересчета на 1 см³.

5

8.1.2.2    1 см³ исходного раствора витамина D₃, приготовленного по 8.1.1.2, с помощью пипетки переносят в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D₃ составляет 10 мкг/см³.

Измерение оптической плотности стандартного раствора витамина D₃ проводят в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при 265 нм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый ректификованный. Для расчета массовой концентрации раствора витамина D₃ (С_Сз, мкг/см³) используют уравнение:

q - ^265 ~10⁶    (2)

°³    100-485’

где Л₂₆₅ — значение оптической плотности рабочего раствора витамина D₃ при 265 нм;

485 — значение оптической плотности раствора витамина D₃ массовой концентрации! г в 100 см³ при 265 нм в спирте этиловом при толщине поглощающего слоя 1 см (Е^);

10⁶ — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

100 — коэффициент пересчета на 1 см³.

8.1.2.3    Для приготовления рабочего раствора внутреннего стандарта витамина D₂ 10 см³ стандартного раствора витамина D₂ по 8.1.1.1 с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят до метки спиртом этиловым ректификованным. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Массовая концентрация рабочего раствора витамина D₂ составляет 1 мкг/см³.

8.1.2.4    Для приготовления рабочего раствора смеси витаминов D₂ и D₃, необходимого для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ, помещают 5 см³ рабочего раствора витамина D₂ по 8.1.2.1 и 5 см³ рабочего раствора витамина D₃ по 8.1.2.2 в колбу роторного испарителя. Растворитель тщательно упаривают на водяной бане при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток перерастворяют в 50 см³ н-гекса-на или подвижной фазы, используемой для проведения полупрепаративной НФ ВЭЖХ. Массовая концентрация витамина D₂ (D₃) в растворе составляет 1 мкг/см³.

8.1.2.5    Из исходных растворов готовят не менее четырех рабочих растворов витамина D₃ в диапазоне концентраций 0,1—10,0 мкг/см³, используемых для построения градуировочного графика по 8.4. Для этого 1,0 см³ и 10,0 см³ рабочего раствора витамина D₃ по 8.1.2.2 с помощью пипетки помещают в мерную колбу на 100 см³ и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина D₃ составляет 0,1 мкг/см³ и 1,0 мкг/см³), а также 0,5 см³ и 1,0 см³ исходного раствора витамина D₃ по 8.1.1.2 помещают в мерную колбу на 100 см³ и растворы доводят до метки спиртом этиловым абсолютным (массовая концентрация полученных растворов витамина D₃ составляет 5,0 мкг/см³ и 10,0 мкг/см³).

8.2 Отбор и подготовка проб

8.2.1    Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2    Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3    Для омыления испытуемой пробы, содержащей менее 30 % жира, 5—20 г исследуемого материала помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100—500 см³, добавляют 90—100 см³этило-вого ректификованного спирта, 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см³50 %-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта. Количество витамина D₂ должно быть близким к ожидаемому количеству витамина D₃ в анализируемом образце. Омыление проводят в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником (желательно в токе азота) при температуре 70 °С—80 °С.

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре втечение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

8.2.4    Для омыления испытуемой пробы, содержащей более 30 %жира, в колбу для омыления вносят 5—20 г исследуемого материала, добавляют 90—100 см³ спирта этилового, примерно 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см³ 50 %-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта витамина D₂, количество которого должно быть близким к ожидаемому количеству витамина D₃ в анализируемом образце. Омыление проводят на водяной бане в течение 30—45 мин (желательно в токе азота) при температуре 95 °С—100 °С.

Рекомендуемое добавляемое количество внутреннего стандарта приведено в таблице 1.

Таблица 1 — Количество добавляемого внутреннего стандарта витамина D2

Заявленное содержание витамина D3, млн-1 Навеска пробы, г Количество вносимого раствора внутреннего стандарта, см3 От 0,1 до 0,3 в ключ. 20 3 Св. 0,3 до 0,6 включ. 10 3 Св. 0,6 до 1,0 включ. 5 2

Если после омыления и охлаждения жир или масло остаются на поверхности омыляемой смеси, то вновь приливают 50 см³ 50 %-ного раствора КОН и омыление повторяют.

После окончания гидролиза, проведенного по 8.2.3 (8.2.4), содержимое колбы быстро охлаждают до(20 + 5) °Сиколичественнопереносятвделительнуюворонку.ВитаминОэкстрагируютЮОсм³н-гек-сана (этилацетата, петролейного или диэтилового эфира).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2—5 г безводного сульфата натрия. Фильтр промывают 20 см³ н-гексана, затем добавляют в фильтрат 1 см³раствора (2 мг/см³) БГТ в н-гекса-не. Экстракт промывают 3—5 раз порциями воды по 50—100 см³ до исчезновения щелочной реакции промывных вод (поуниверсальной индикаторной бумаге) и затем упаривают с помощью роторного испарителя при пониженном давлении и при температуре не выше 40 °С.

8.2.5    Для приготовления раствора исследуемого образца для анализа с помощью полупрепара-тивной НФ ВЭЖХ к сухому остатку после упаривания экстракта приливают 2 см³ н-гексана (или другого растворителя или смеси растворителей, которые используются в качестве подвижной фазы в системе полупрепаративной ВЭЖХ).

8.2.6    Для выделения фракции, содержащей витамин D, 0,2—0,5 см³ раствора по 8.2.5 элюируют в условиях полупрепаративной ВЭЖХ и собирают элюат, содержащий смесь витаминов D₂ и D₃ (в условиях НФ ВЭЖХ эти соединения элюируются одновременно), предварительно определив время удерживания этих соединений по 8.3. Время удерживания витамина D зависит от используемых подвижных и неподвижных фаз и обычно составляет 10—15 мин. Общее время хроматографического разделения составляет 25—30 мин.

8.2.7    Фракцию элюата, полученную по 8.2.6, упаривают на роторном испарителе при пониженном давлении и температуре не более 40 °С, и сухой остаток перерастворяют в 0,5 см³ подвижной фазы для аналитической ОФ ВЭЖХ.

8.3    Подготовка жидкостных хроматографов

Подготовку жидкостных хроматографов к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонки промывают элюентом.

Раствор смеси витаминов D₂ и D₃ по 8.1.2.4 несколько раз вводят в хроматограф для полупрепара-тивного анализа и проверяют повторяемость времени удерживания витамина D (в варианте НФ ВЭЖХ витамины D₂ и D₃ элюируются одновременно). Хроматографические условия оптимизируют для оптимального разделения пика витамина D от пиков токоферолов и других соединений матрицы.

Раствор смеси витаминов D₂ и D₃ по 8.1.2.6 несколько раз вводят в хроматограф для варианта аналитической ОФ ВЭЖХ и проверяют повторяемость полного разделения пиков витаминов D₂ и D₃ (степень разделения пиков должна быть не менее 1,0). Условия хроматографирования также должны обеспечивать оптимальное отделение пиков витаминов D₂ и D₃ от пиков других соединений матрицы.

8.4    Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя по программному обеспечению.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал, mAU • с (AU • с) или мм» — «массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см³». Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удерживания не должно превышать 5 % средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соот-

1

2

3