ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
<£>
НАЦИОНАЛЬНЫ
СТАНДАРТ
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Экспресс-метод определения антибиотиков
|
Москва
Стандартинформ
2011 |
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации (ОАО «ВНИИС»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 ноября 2010 г. № 364-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок— в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
© Стандартинформ, 2011
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Экспресс-метод определения антибиотиков
Foodstuffs. Express-method for determination of the antibiotics
Дата введения — 2012—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает ускоренный метод качественного определения (обнаружения) антибиотиков.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный. Технические условия ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовки их к анализу
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
Издание официальное
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Настоящий экспресс-метод устанавливает качественное определение (обнаружение) антибиотиков в пищевых продуктах, основанное на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде.
4 Средства измерения, вспомогательное оборудование, посуда, материалы и реактивы
4.1 Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания + 0,01.
4.2 Баня водяная с обогревом, поддерживающим температуру до 100 °С.
4.3 Термометр стеклянный жидкостный (нертутный) по ГОСТ 28498, с диапазоном измерения до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С.
4.4 Мясорубка или гомогенизатор.
4.5 Ножницы.
4.6 Чашки Петри по ГОСТ 25336.
4.7 Пробирки по ГОСТ 25336.
4.8 Центрифуга со скоростью вращения не менее 3000 об/мин.
4.9 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
4.10 Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).
4.11 Метиленовый синий, индикатор (0,5 %-ный водный раствор).
4.12 Глюкоза 40 %-ный раствор.
4.13 Тест-культуры
5 Проведение исследования5.1 Отбор проб продукции
Отбор проб — по ГОСТ Р 53430, ГОСТ 13928, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809.
5.1.1 Подготовка проб к исследованию
5.1.1.1 Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде)
Сырое молоко исследуют непосредственно в день отбора проб. До начала анализа пробы молока и сливок хранят в холодильнике при температуре (4 + 1) °С. Затем отбирают пробу для анализа (не менее 10 см3) и помещают ее в пробирку.
5.1.1.2 Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока)
Непосредственно перед исследованием продукт подвергают восстановлению в кипяченой воде при температуре не более (45 + 1) °С. Пробу тщательно перемешивают, она не должна содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробу для анализа в объеме не менее 10 см3 и переносят ее в пробирку.
2
5.1.1.3 Яйца, меланж
Яйца или меланж, предназначенные для исследования, предварительно нагревают на водяной бане при температуре (65 ± 1) °С в течение 10—15 мин до коагуляции белка, затем содержимое яиц или меланж тщательно перемешивают и отбирают пробу для анализа массой не менее 10 г.
5.1.1.4 Мясо и субпродукты
Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т. д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают ножницами или при помощи мясорубки или гомогенизатора, затем 10 г пробы мышечной ткани помещают в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевый сок в объеме не менее 10 см3 переносят в пробирку.
5.1.2 Термическая обработка проб пищевых продуктов
Перед проведением исследования пробирку с пробой, отобранной по 5.1.1, помещают в водяную баню с температурой (60 + 1) °С. Время прогревания 30 мин отмечают от момента достижения постоянной температуры внутри пробирки.
5.1.3 Тест-культуры для определения антибиотиков
Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Bacillus subtilis, вар. 6633; Bacillus subtilis, вар. L2; Bacillus mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.
Для пенициллина и стрептомицина используют следующие тест-культуры — Bacilus subtilis, вар. 6633; Basilus mycoides 537 и Micrococcus luteum ATCC 9341, для тетрациклина — Bacillus subtilis, вар. L2.
Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в пробирке со столбиком полужидкого 0,4 %-го питательного агара.
5.1.3.1 Приготовление тест-культур
Вначале тест-культуру рассеивают на чашки Петри с 2 %-ным мясо-пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят на (20 + 3) ч в термостат при температуре (37 + 1) °С. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2 %-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 + 1) °С в течение (20 + 3) ч.
Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков.
Срок хранения полученной взвеси в холодильнике при температуре (4 + 1) °С — 7 дн.
5.1.3.2 «Рабочая доза» тест-культур
«Рабочая доза» тест-культуры — наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 ± 1) °С. При этом учитывают, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток тест-культуры в смыве. Время постановки реакции равно одному часу. Оно выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест-культуры. «Рабочую дозу» тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.
5.1.3.3 Приготовление «рабочей дозы» тест-культуры
Полученную взвесь тест-культуры (5.1.3.1) титруют путем последовательных разведений в 1 см3 питательного бульона в соотношении 1:2. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают на 3 ч в термостат при температуре (37 + 1) °С. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 см3 растопленного и охлажденного до температуры (45 ± 1) °С 1 %-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1 %-ный питательный агар из расчета: на 100 см3 среды 0,4 см3 0,5-ного водного раствора метиленового синего и 1 см3 40 %-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 + 1) °С в течение 1—2 ч, после чего учитывают результат (таблица 1).
Таблица 1 — Определение «рабочей зоны» тест-культур |
Тест-культура |
Время,
ч |
Учет интенсивности клеточного дыхания |
Разведение тест-культуры (5.1.3.3) |
1:2 |
1:4 |
1:8 |
1:16 |
1:32 |
1:64 |
1:128 |
1:256 |
1:512 |
1:1024 |
B.subtilis, вар. 6633 |
1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
_ |
_ |
B.subtilis, вар. L2 |
1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
Окончание таблицы 1 |
Тест-культура |
Время,
ч |
Учет интенсивности клеточного дыхания |
Разведение тест-культуры (5.1.3.3) |
1:2 |
1:4 |
1:8 |
1:16 |
1:32 |
1:64 |
1:128 |
1:256 |
1:512 |
1:1024 |
В.mycoides 537 |
i |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Micrococcus luteum ATCC 9341 |
i |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
|
Примечание (+) — полное обесцвечивание метиленового синего, (-) — отсутствие обесцвечивания. |
Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за «рабочую дозу». Функциональная активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение одной недели. Поэтому «рабочую дозу» первый раз определяют через сутки, а затем — через три дня.
Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через один час инкубации в термостате при температуре 37 °С, принимают за «рабочую дозу».
В среднем, «рабочую дозу» тест-культур определяют:
для Bacillus subtil is, вар. 6633 в разведении 1:256;
- Bacillus subtillis, вар. L2 » 1:512;
- Bacillus mycoides 537 » 1:128;
- Micrococcus luteum ATCC 9341 » 1:64.
6 Определение антибиотиков в анализируемой пробе
6.1 Подготовленные к исследованию анализируемые пробы по 5.1.1 в объеме 0,5 см3 вносят в пробирки с таким же (0,5 см3) объемом мясо-пептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 см3 взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест-культуры (5.1.3.3).
Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.
Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.
После этого в каждую пробирку вносят по 2 м3 растопленного и охлажденного до температуры (45 +1) °С мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 + 1) °С в течение 1—2 ч.
6.2 Учет результатов определения антибиотиков
6.2.1 При отсутствии в испытуемых пробах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур не нарушаются и восстанавливают (т. е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.
6.2.2 В контрольной пробирке, где отсутствует анализируемая проба, также происходит обесцвечивание в течение 1—2 ч наблюдения в термостате при температуре (37 + 1) °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры).
6.2.3 При наличии антибиотика в анализируемой пробе дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается, цвет остается синим.
4
ГОСТ Р 53912-2010
7 Требования, обесцвечивающие безопасность
При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:
- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с ГОСТ 12.4.021;
- содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005;
- безопасность при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;
- требования безопасности при работе в микробиологической лаборатории с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) по документу, утвержденному в установленном порядке;
- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009.
5
УДК 637.11:543.06:006.354 ОКС 65.160 Н09 ОКСТУ 9209
Ключевые слова: пищевые продукты, качественное определение, экспресс-метод, антибиотики, тест-культура, «рабочая доза», пробы
Редактор М.Е. Никулина Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.В. Бучная Компьютерная верстка Л.А. Круговой
Сдано в набор 24.08.2011. Подписано в печать 06.09.2011. Формат 60 х 84^. Гарнитура Ариап. Уел. печ. л. 0,93. Уч.-изд. л. 0,73. Тираж 211 экз. Зак. 824.
ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.rn info@gostinfo.rn
Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.
Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 117418 Москва, Нахимовский проспект, 31, к. 2.