Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

18 страниц

396.00 ₽

Купить ГОСТ Р 53139-2008 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на соки и соковую продукцию, включая соки и соковую продукцию для детского питания, в том числе фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные пюре, а также на концентрированные фруктовые и овощные соки, концентрированные морсы, концентрированные фруктовые и овощные пюре и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты (витамина С) в виде кислоты или ее соли. Диапазон определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты составляет от 0,0003 до 0,2 г/дм куб. включительно.

 Скачать PDF

Оглавление

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Обозначения и сокращения

4 Сущность метода

5 Отбор проб

6 Проведение определения

     6.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

     6.2 Приготовление растворов реактивов

     6.3 Подготовка пробы

     6.4 Условия определения

     6.5 Ферментативное определение

7 Обработка результатов измерений

8 Дополнительные указания

9 Метрологические характеристики метода

Приложение А (справочное) Информация о медленно текущих реакциях.

Приложение Б (справочное) Метрологические характеристики метода

Библиография

 
Дата введения01.01.2010
Добавлен в базу01.09.2013
Завершение срока действия15.02.2015
Актуализация01.01.2021

Этот ГОСТ находится в:

Организации:

18.12.2008УтвержденФедеральное агентство по техническому регулированию и метрологии568-ст
РазработанГОУ ВПО МГУПП
ИзданСтандартинформ2009 г.

Juices and juice products. Identification. Determination of ascorbic acid by enzymatic method

Нормативные ссылки:
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ



НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ


ГОСТР

53139-

2008


СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ


Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом


Издание официальное


2


Москва

Стамдартинформ

2009


Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» Министерства образования и науки Российской Федерации (ГОУ ВПО МГУПП)

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 «Продукты переработки фруктов, овощей и грибов» и Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» Министерства образования и науки Российской Федерации (ГОУ ВПО МГУПП)

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. № 568-ст

4    В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения следующих международных (региональных) стандартов:

-    CODEX-STAN 247—2005 «Единый стандарт на фруктовые соки и нектары» (CODEX-STAN 247—2005 «Codex general standard for fruit juices and nectars») в части требований к обеспечению качества, подлинности, необходимого состава и методов оценки показателей соков и нектаров:

-    ИФУ № 5:2000 «Рекомендации к анализу витамина С» Сборник методов физико-химического анализа соков Международной федерации производителей фруктовых соков (IFU Recommendation No. 5, 2000 «Recommendations for Vitamin C Analysis», (International Federation of Fruit Juice Produces))

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2009

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

II

ГОСТ P 53139—2008

Содержание

1    Область применения............................................1

2    Нормативные ссылки............................................1

3    Обозначения и сокращения........................................2

4    Сущность метода..............................................2

5    Отбор проб.................................................2

6    Проведение определения.........................................2

6.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы...........2

6.2    Приготовление растворов реактивов.................................3

6.3    Подготовка пробы...........................................4

6.4    Условия определения.........................................5

6.5    Ферментативное определение....................................5

7    Обработка результатов измерений....................................6

8    Дополнительные указания.........................................7

9    Метрологические характеристики метода................................10

Приложение А (справочное) Информация о медленно текущих реакциях...............11

Приложение Б (справочное) Метрологические характеристики метода................12

Библиография................................................13

III

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

Juices and juice products. Identification. Determination of ascorbic acid by enzymatic method

Дата введения — 2010—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и соковую продукцию, включая соки и соковую продукцию для детского питания, в т. ч. фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные пюре, а также на концентрированные фруктовые и овощные соки, концентрированные морсы, концентрированные фруктовые и овощные пюре и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты (витамина С) в виде кислоты или ее соли. Диапазон определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты составляет от 0.0003 до 0.2 г/дм3 включительно.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 841-64 Реактивы. Кислота метафосфорная. Технические условия ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора

проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-2—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального

Издание официальное

агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем юду. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3    Обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие сокращения и обозначения:

МТТ — бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенил-2Н-тетразолия.

ФМС — переносчик электронов — феназинметосульфат,

МТТ — формазан — комплекс МТТ и формазана,

АО — аскорбатоксидаза.

4    Сущность метода

Аскорбиновая кислота (витамин С) и другие редуцирующие вещества (х - Н2) восстанавливают бромид 3-(4.5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенил-2Н-тетразолия (МТТ) в присутствии переносчика электронов феназинметосульфата (ФМС) при pH 3.5 до комплекса МТТ-формазана. В кювете с пробой измеряют сумму редуцирующих веществ:

Аскорбиновая кислота (х - Н2) + МТТ —<шс -> дегидроаскорбиновая кислота(х)

+ МТТ-формазан + Н\

Для обеспечения специфичного определения аскорбиновой кислоты в контрольной кювете проводят окисление аналита аскорбатоксидазой (АО) в присутствии кислорода воздуха. Образующаяся дегидроаскорбиновая кислота не взаимодействует с МТТ и ФМС:

Аскорбиновая кислота +1/202 —дегидроаскорбиновая кислота ♦ Н20.

Количество образовавшегося комплекса МТТ-формазан. эквивалентное количеству аскорбиновой кислоты в исходной пробе, определяют спектрофотометрическим измерением оптической плотности исследуемого раствора пробы при длине волны 578 нм.

5    Отбор проб

5.1    Отбор проб — по ГОСТ 26313. подготовка проб — по ГОСТ 26671.

6    Проведение определения

6.1    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Гидроокись калия по ГОСТ 24363, ч. д. а., раствор мопярной концентрации с (КОН) = 10 моль/дм3.

Поливинилполипирролидон (код пищевой добавки Е1202) с содержанием основного вещества не менее 95 % no [1J.

Фосфорнокислый однозамещенный 2-водный натрий. NaH2P0420 по ГОСТ 245. ч. д. а.

Лимонная кислота моногидрат. С6Н807 Н20. по ГОСТ 3652. ч. д. а.

Аскорбиновая кислота. С6Н806 по (2), (3). х. ч.

Формалин по ГОСТ 1625. раствор с объемной долей 5 %.

3-(4.5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ) с содержанием основного вещества не менее 95 % по (1).

Феназинметосульфат (феназин/ФМС) с содержанием основного вещества не менее 95 % по (1).

Аскорбатоксидаза (сухой лиофилизат/АО), Е 1.10.3.3 с содержанием основного вещества не менее 95 % по (1).

Метафосфорная кислота. (НР04)п, по ГОСТ 841, раствор массовой концентрации 15 г/дм3.

Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 578 нм. или фотометр фотоэлектрический с шириной спектральной полосы не более 10 нм и допустимой абсолютной погреш- 1

ГОСТ Р 53139-2008

ностью измерений не более : 1 %, или спектрофотометр на ртутной лампе, позволяющий проводить измерения при 578 нм.

Кюветы из оптического стекла или полимерных материалов с длиной оптического пути 1 см.

Держатель для кювет.

Иономер или pH-метр с погрешностью измерения не более = 0,05 pH.

Пипетки номинальной вместимостью 0.01, 0.02, 0.1. 0.2. 0.5. 1. 2. 5 и 10 см2 3 с относительной погрешностью дозирования ± 1 % по ГОСТ 29227 1-го класса точности или дозаторы пипеточные с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более ± 1 % [4] или импортные с аналогичными характеристиками.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 250 и 1000 см3.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 20 и 200 см3.

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 см3.

Лабораторная воронка по ГОСТ 25336 диаметром 5 см.

Часы лабораторные.

Электроплитка.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 для диапазона температур от 0 °С до 100 °С с пределом допускаемой погрешности не более г 1 °С.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более г 0.1 мг.

Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 8 до 10 см диаметром 2—3 мм для перемешивания содержимого кювет при проведении ферментативного определения.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Водяной или воздушный термостат, обеспечивающий поддержание заданной температуры ферментативной реакции в диапазоне 30 °С—40 °С и контроль температуры с погрешностью не более 0,5 °С.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательные устройства с техническими характеристиками, а также реактивы, в том числе готовые наборы реактивов, по качеству не ниже перечисленных в настоящем разделе.

6.2 Приготовление растворов реактивов1

6.2.1    Фосфатно-цитратный буферный раствор (натрий фосфорнокислый однозамещен-ный молярной концентрации 0.2 моль/дм3. раствор моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3, pH 3,6)

Растворяют 35,6 г натрия фосфорнокислого однозамещенного в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Растворяют 21.0 г лимонной кислоты моногидрата в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 свежей дистиллированной воды. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3.6 смешивают 31,6 частей раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного молярной концентрации 0,2 моль/дм3 и 68,4 частей раствора моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3.

Фосфатно-цитратный буферный раствор годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °С. Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру фосфатно-цитратного буферного раствора, значения которых должны составлять соответственно 3.6 и 20 °С—25 °С. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH фосфатно-цитратный буферный раствор готовят заново.

6.2.2    Рабочий раствор МТТ массовой концентрации 5 мг/см3

Растворяют 200 мг МТТ в 40 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3.6 (см. 6.2.1). Объем рабочего раствора МТТ достаточен для проведения примерно 20 отдельных определений аскорбиновой кислоты (см. 6.4).

Рабочий раствор МТТ годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 X (без доступа света!). Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру рабочего раствора МТТ. значения которых должны составлять соответственно 3.6 и 20 °С—25 X. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH рабочий раствор МТТ готовят заново.

6.2.3    Рабочий раствор ФМС массовой концентрации 0,6 мг/см3

Растворяют 30 мг ФМС в 50 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива и нагретой на электроплитке до 40 X—50 X. Рабочий раствор ФМС годен для применения в течение 12 мес при условии хранения при температуре 4 X. Незначительно красное окрашивание, которое может появиться при хранении рабочего раствора ФМС. не влияет на результаты ферментативного определения аскорбиновой кислоты.

6.2.4    Рабочий раствор АО (1700 U/cm3)1»

Навеску сухого лиофилизата. соответствующую активности фермента 1700 U. растворяют в

1.0 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3.6 (см. 6.2.1). Раствор готовят непосредственно перед использованием

6.2.5    Раствор гидроокиси калия молярной концентрации с (КОН) = 10 моль/дм3

Растворяют 14.03 г гидроокиси калия в мерной колбе вместимостью 250 см3 в 150 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.2.6    Раствор формалина с объемной долей 5 %

В химический стакан на 20 см3 вносят 3 см3 раствора формалина с объемной долей формальдегида 35 %. Добавляют 4 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают стеклянной палочкой и используют для подготовки пробы согласно 6.3.3.

6.2.7    Раствор метафосфорной кислоты массовой концентрации (HPOJn = 15 г/дм3

Растворяют 15 г метафосфорной кислоты массовой долей 33,5 % в мерной колбе вместимостью

1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.3 Подготовка пробы

Концентрированные соки и пюре перед определением восстанавливают согласно нормативным документам свежей дистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ согласно нормативным документам для соответствующего вида продукции.

6.3.1 Прозрачные или мутные слабоокрашенные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия (10 моль/дм3) проводят корректировку pH пробы до значения 3.5—4.0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты (15 г/дм3) согласно таблице 1.

Таблица 1

Массовая концентрация аскорбиновой кислоты в пробе4, г/дм1

Разбавление

Фактор разбавления F

<0.20

_

1

0,20—2.0

1+9

10

2.0—20.0

1 +99

100

>20

1 +999

1000

Для оценки количества аскорбиновой кислоты используют документы, содержащие сведения о составе соков и соковой продукции [5].

Пробу, содержащую мутную взвесь, после разбавления фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0,100 см3.

ГОСТ Р 53139-2008

6.3.2    Прозрачные или мутные сильноокрашенные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия молярной концентрации 10 моль/дм3 проводят корректировку pH пробы до значения 3.5—4,0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты массовой концентрации 15 г/дм3 согласно таблице 1.

Для удаления природных красящих пигментов к 10 см3 пробы добавляют 100 мг поливинилполипир-ролидона. Пробу перемешивают в течение 1 мин, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0,100 см3.

6.3.3    Подготовка проб, содержащих в повышенных количествах диоксид серы

К 10 см3 пробы добавляют одну каплю разбавленного раствора формалина объемной долей 5 %. Пробу перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Значение pH пробы при необходимости корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм3) и разбавляют согласно таблице 1. Мутные пробы дополнительно фильтруют (см. 6.3.1, 6.3.2). Сильноокрашенные пробы обрабатывают поливинилполипирролидоном согласно 6.3.2.

В определении по 4.5 используют от 0,200 до 0,500 см3 фильтрата.

6.4    Условия определения

Длина волны при фотометрическом измерении составляет 578 нм. Для измерения используют стеклянную кювету1'с толщиной оптического слоя 1 см. равной ширине грани Ферментативное определение проводят при температуре 37 °С. Общий объем инкубационной смеси в кювете составляет 2,70 см3.

Измерение оптической плотности инкубационной смеси проводят против воздуха (без кюветы в световом пути прибора). Проба в инкубационной смеси в кювете должна содержать от 0.5 до 20 мкг аскорбиновой кислоты в 0.1—1,6 см3 пробы.

6.5    Ферментативное определение

Ферментативное определение аскорбиновой кислоты в пробе проводят по схеме дозирования и смешивания реактивов, приведенной в таблице 2. Если в определении используют иммобилизованную АО и готовые наборы реактивов, дозирование и смешивание реактивов проводят по схеме таблицы 3.

Таблица 2 — Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты

Дозирование в кювету

Контрольная проба

Проба

Рабочий раствор МТТ1* (см. 6.2.2) Дистиллированная вода Проба1" (см. 6.3)

Рабочий раствор АО (см. 6.2.4)

1,000 см3 1.490 см0.100 см0.01 см3

1.000 см3

1.500 см3 0.100 см3

Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 *С. В течение 6 мин3’ интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой пластиковой или стеклянной палочкой с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты в контрольной пробе!). После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют значение оптической плотности А\. Продолжают реакцию добавлением:

Рабочий раствор ФМС*1 (см. 6.2.3)

0,100 см3

0.100 см3

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 *С в течение 15 мин. после чего немедлетвю измеряют значение оптической плотности А^ в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.

4 Температура раствора должна составлять 37 *С.

п Перед дозированием в кювету пипетку или наконечник дозатора следует ополоснуть фильтратом пробы (см. 6.3).

При определении аскорбиновой кислоты в пробах, содержащих повышенные количества диоксида серы, время выдержки кюветы с контрольной пробой увеличивают до 10 мин.

4> После внесения рабочего раствора ФМС кюветы изолируют от доступа света.

3) Вместо кювет из оптического стекла допускается использование одноразовых кювет из полимерных материалов.

Таблица 3 — Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты при использовании иммобилизованной АО

Дозирование о кювету

Контрольная проба

Проба

Рабочий раствор МТТ (см. 6.2.2)

1,000 см3

1,000 см3

Дистиллированная вода

1.500 см3

1,500 см3

Проба (см. 6.3)

0.100 см3

0,100 см3

Иммобилизованная АО

Один шпатель

Перемешивают. Помещают контрольную кювету и кювету с пробой в термостат при температуре 37 *С. В течение 6 мин интенсивно перемешивают содержимое кюветы с контрольной пробой шпателем с иммобилизованной АО с целью насыщения инкубационной смеси воздухом (необходимое условие полного окисления аскорбиновой кислоты в контрольной пробе!). После выдержки в контрольной кювете и в кювете с пробой измеряют значение огни-

ческой плотности А,. Продолжают реакцию добавлением:

Рабочий раствор ФМС (см. 6.2.3)

0,100 см3

0,100 см3

Перемешивают. Инкубируют (в темноте!) при температуре 37 °С в течение 15 мин. после чею немедленно измеряют значение оптической плотности А? в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой.


7 Обработка результатов измерений

Значение разницы между конечным и начальным значениями оптической плотности контроля и пробы рассчитывают по формуле


ДА =(А21)лроб-(А21)хонт.    (1)

Значение разницы оптических плотностей ЛА должно составлять не менее 0,100.

Искомую массовую концентрацию аскорбиновой кислоты в исходной пробе, г/дм3, рассчитывают по общей формуле


с =


V-MW с d v 1000


ДА.


(2)


где V—общий объем инкубационной смеси, см3; v — объем пробы, см3;

MW— молекулярный вес аскорбиновой кислоты или аскорбата (176,13 и 175,12 г/моль соответственно);

d — длина оптического пути кюветы, см;

с— молярный коэффициент оптической плотности формазана (при измерении и длине волны 578 нм составляет 16.9 дм3/ммоль см).

Подставляя в формулу (2) необходимые значения для аскорбиновой кислоты, получают модифицированную формулу (3) для расчета массовой концентрации аскорбиновой кислоты (в г/дм3) в пробе:


с


2.70 • 176.13 16.9 1 0.100 1000


ЛА = Q2814 ДА


(3)


Если перед ферментативным определением проба подвергалась разбавлению, то результат, полученный по формуле (3), умножают на коэффициент разбавления F.

В случае концентрированных соков или пюре результат определения выражают в г/100 г продукта. Расчет осуществляют с учетом навески, взятой для получения восстановленного продукта (см. 6.3), по формуле


С = — 100,    (4)

т

где с — массовая концентрация аскорбиновой кислоты в исследованной пробе, рассчитанная по формуле (2), г/дм3;

т — навеска концентрированного сока или пюре, взятая для получения восстановленного продукта (см. 6.3), г.


6


ГОСТ Р 53139-2008

8 Дополнительные указания

8.1    Факторы, влияющие на определение

Если общая разница оптических плотностей ЛА менее 0,100. то необходимо повторно провести определение, используя большую навеску или увеличенный объем пробы, дозируемой в инкубационную смесь (до 1.490 см3 по схеме дозирования таблицы 2 или до 1.500 см3 по схеме дозирования таблицы 3). В этом случае объем воды, добавляемой в кювету, должен быть уменьшен на соответствующее значение для сохранения общего объема инкубационной смеси (2.70 см3) в кювете с неизменными контролем и пробой. Увеличенный объем пробы необходимо принимать во внимание при расчете конечного результата согласно формуле (3).

8.2    Специфичность определения

Метод специфичен для определения общей аскорбиновой кислоты, включающей D- и L-изомеры.

В анализе коммерческих препаратов аскорбиновой кислоты (например, витаминов) в свежеприготовленных растворах можно ожидать, что степень повторного нахождения искомого вещества составит 94 %—100 %. На качество результатов определения степени повторного нахождения влияет срок хранения коммерческого препарата аскорбиновой кислоты и растворитель, используемый для получения растворов Рекомендуется использовать раствор метафосфорной кислоты (см. 4.1) с доведением pH пробы до 3,5—4,0.

На стабильность аскорбиновой кислоты в водных растворах сильно влияет присутствие ионов металлов, например железа и меди, а также наличие в пробе кислорода. В этом случае ожидаемая степень повторного нахождения будет составлять менее 100 %, что обусловливается частичной потерей аскорбиновой кислоты.

С помощью настоящего ферментативного метода нельзя определить L-аскорбилпальмитат. так как в ходе щелочного гидролиза происходит спонтанное разрушение свободной аскорбиновой кислоты.

8.3    Причины возможных ошибок при проведении определения

Сахароза, содержащаяся в соках и соковой продукции, не мешает определению, если ее концентрация в кювете не превышает 30 мг.

Определению аскорбиновой кислоты мешает D-сорбит (при концентрации более 20 мг в кювете), который ингибирует аскорбатоксидазу, а также этанол в высоких концентрациях, превышающих 100 мг/юовета. Влияние большинства мешающих факторов на результат определения исключается путем увеличения длительности инкубации контрольной пробы с аскорбатоксидазой до 10 мин.

Диоксид серы в высоких концентрациях, превышающих 50 мкг/юовета. взаимодействует с МТТ и ФМС и вызывает тем самым медленно текущую реакцию. В этом случае пробу подвергают предварительной обработке согласно 6.3.3.

Ионы металлов в концентрациях более 100 мкг/юовета могут понизить pH системы и. тем самым, ингибировать действие аскорбатоксидазы.

Нитрит, который может содержаться в некоторых овощных соках, не мешает определению. Однако его присутствие в системе может привести к спонтанному распаду аскорбиновой кислоты.

Ионы оксалата в концентрациях от 30 мкг/кювета способны оказывать значительное ингибирующее действие на аскорбатоксидазу. Высокую концентрацию оксалата устраняют путем добавления ионов кальция до концентрации 30 мкг/юовета и выше, а также созданием в системе слабокислой среды (pH 5—6).

8.4    Выявление и устранение мешающих факторов при проведении анализа.

Контроль ферментативного определения

8.4.1    Общие указания

Если разница оптических плотностей ЛА менее 0,100. следует провести повторную подготовку пробы к определению, увеличив ее навеску или уменьшив разбавление. Значение pH пробы в любом определении должно находиться в интервале от 3,5 до 4,0.

8.4.2    Операции с контрольной пробой

Содержимое кюветы с контрольной пробой интенсивно перемешивают стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АО2) в течение предварительной реакции.

После внесения рабочего раствора ФМС реакция проявляет повышенную чувствительность к свету, поэтому инкубирование при температуре 37 °С необходимо проводить в полной темноте. Для чего кюветы, находящиеся, например, в держателе, помещенном в водяной или воздушный термостат, накрывают плотной светонепроницаемой тканью. Попадание света приводит к возникновению нежелательной медленно текущей реакции.

1

2

Допускается использование готового набора реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты производства «Roche Diagnostics/R-Biopharm AG» (номер набора 10 409 677 035) согласно схеме дозирования и смешивания реактивов, прилагаемой к набору. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

3

’ Допускается использовать в определении готовые препараты аскорбатоксидазы. Аскорбатоксидаза. иммобилизованная на пластиковом шпателе на целлюлозной подложке (рабочая активностью фермента 17 U). входит в состав готового набора реактивов для определения аскорбиновой кислоты производства «Roche Diagnostics/R-Biopharm AG» (номер набора 10 409 677 035). Пример схемы ферментативного определения с использованием ютового набора реактивов приведен в таблице 3. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

4