ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СЫР И СЫР ПЛАВЛЕНЫЙ

Метод определения массовой доли лимонной кислоты

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2011

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 «Молоко и молочные продукты»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 614

3    Настоящий стандарт гармонизирован с международным стандартом ИСО 2963—97 «Сыр и сыр плавленый. Определение содержания лимонной кислоты. Ферментативный метод*

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2011 г.

© И ПК Издательство стандартов. 1999 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официх!ьного издания без разрешения Федерального агентства но техническому регулированию и метрологии

48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СЫР И СЫР ПЛАВЛЕНЫЙ

Метол определения массовой доли лимонной кислоты

Cheese and processed cheese products.

Method for determination of mass percent of citric acid

Дата введения 2002—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сыр и плавленый сыр и устанавливает метод определения массовой доли лимонной кислоты.

Метод определения массовой доли лимонной кислоты в сыре и сыре плавленом основан на обработке экстракта навески продукта цитрат-лиазой для превращения лимонной кислоты в уксусную и щавелевоуксусную кислоты. Полученный раствор обрабатывают малатдегидрогеназой (МДГ) и лактатдегидрогеназой (ЛДГ) в присутствии н и коти на м идаде н и н д и нуклеотида (НАДН) восстановленной формы, для ферментативного катализа восстановления щавелевоуксусной кислоты и продукта ее декарбокенлирования — пировиноградной кислоты, соответственно с L-яблочной и L-молочной кислот. При этом НАДН превращается в окисленную форму (НАД⁺). Снижение концентрации НАДН в исследуемом растворе устанавливают измерением оптической плотности при длине волны 340 нм. Массовая доля лимонной кислоты при этом пропорциональна снижению концентрации НАДН.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия ГОСТ 3769-78 Аммоний сернокислый. Технические условия ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4529-78 Цинк хлористый. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода диспылированная. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и маточных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические

метры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пинетки с одной отметкой ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пинетки градуированные. Часть I. Общие требования

ИСО 707—97** Матоко и молочные продукты. Методы отбора проб

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

•* Действует до введения в действие ГОСТ Р. разработанного на основе соответствующего ИСО. С 11 августа 2008 г. действует ИСО 707:2008.

Издание официальное

3    Определение

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

массовая доля лимонной кислоты: Отношение массы лимонной кислоты, определенной в соответствии с настоящим стандартом в навеске продукта, к массе навески продукта, умноженное на 100 и выраженное в процентах.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Анализатор потенциометрический по ГОСТ 19881.

4.2    Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 20 до 25 'С, со стойкой для удерживания кюветы спектрофотометра в процессе термостатирования.

4.3    Спектрофотометр, обеспечивающий проведение измерений на длине волны 340 нм. с шириной полосы пропускания не более 10 нм. оснащенный кюветами длиной оптического пути

1    см.

4.4    Устройство измельчающее с угловой скоростью вращения от 500 до 3000 мин^-1, позволяющее измельчать пробу без ее нагрева, потери или поглощения влаги.

4.5    Весы лабораторные но ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности.

4.6    Пластиковые мешки для размешивания смеси исследуемого образца с ферментом непосредственно в кювете спектрофотометра.

4.7    Бумага фильтровальная но ГОСТ 12026 диаметром фильтра 15 см.

4.8    Воронка тина ВФ по ГОСТ 25336 диаметром 75 мм.

4.9    Пипетки фццуированные по ГОСТ 29227, 2-го класса точности вместимостью 10 см³.

4.10    Пипетки по ГОСТ 29169 2-го класса точности вместимостью 25. 10. 5, 2, 1. 0,1 и 0.02 см³.

4.11    Колбы конические но ГОСТ 25336 вместимостью 100 см³ с притертыми стеклянными пробками.

4.12    Колбы мерные но ГОСТ 1770 2-го класса точности вместимостью 100 и 1000 см³.

4.13    Стаканы химические стеклянные но ГОСТ 25336 вместимостью 50 см³.

4.14    Цилиндр мерный по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см³.

4.15    Кислота трихлоруксусная (CCl^COOH) но |1|.

4.16    Натрия гидроокись (NaOH) по ГОСТ 4328. ч.д.а.

4.17    Цинк хлористый (ZnCI₂) по ГОСТ 4529. ч.д.а.

4.18    Диглицин (H₂NCH₂C0NHCH₂C0₂H) по |2|.

4.19    Натрий углекислый кислый (NaHCO,) но ГОСТ 4201. х.ч.

4.20    Соль динатриевая ни коти нам идаден и нди нуклеотида (C₂₁H₂₇N-O_l4P₂Na₂) по |3|. х.ч.

4.21    Аммоний сернокислый (NH₄)₂S0₄ по ГОСТ 3769. ч.д.а.

4.22    Малатдсгидрогсназа из сердца поросенка К.Ф. 1.1.1.37 по |4|.

4.23    Лактатдегидрогеназа из мышц кролика К.Ф. 1.1.1.27 по |4|.

4.24    Циграт-лиаза (Лиофилизат из Aerolonter aerogenes) К.Ф.4.1.3.6 по |4|.

4.25    Моногодрат лимонной кислоты (С₆Н_к0₇ • Н₂0) но ГОСТ 3652.

4.26    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода деминерализованная, вода бидистилли-рованная.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.

5    Метод отбора проб

Oi6op проб — по ГОСТ 26809, для экспортно-им портных операций — по ИСО 707.

6    Подготовка к определению

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Раствор трихлоруксусной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 200.0 г трихлоруксусной кислоты (ССЦСООН) по 4.15, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.2    Раствор А гидроокиси натрия концентрации 5,0 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 200.0 г гидроокиси натрия (NaOH) по 4.16. растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

2    50

ГОСТ Р 51459-99

6.1.3    Раствор Б гидроокиси натрия концентрации 1.0 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 40.0 г гидроокиси натрия (NaOH) по 4.16, растворяют в воде. доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.4    Раствор В гидроокиси натрия концентрации 0.1 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 4.0 г гидроокиси натрия (NaOH) по 4.16. растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.5    Раствор хлористого цинка

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 0.80 г хлористого цинка (ZnCl₂) по 4.17. растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.6    Буферный раствор с pH 7,8

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 71.3 г диглицина (H₂NCH₂CONHCH₂CO,H) по 4.18. растворяют в 700 см³ воды, доводят pH до 7.8 раствором А гидроокиси натрия (6.1.2).Приливают 100 см ' раствора хлористого цинка (6.1.5). доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Буферный раствор хранят при температуре от 0 до 8 ’С не более четырех недель.

6.1.7    Раствор натрия углекислого кислого

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 4.0 г углекислого кислого натрия по 4.19. растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.8    Раствор восстановленного н и коти на м идаде н и нд и нуклеотида

В колбу вместимостью 50 см³ вносят 50 мг восстановленной динатриевой соли никотинамида-дениндинуклеотида (C₂,H₂₇N₇0₁₄P₂Na₂). 100 мг натрия углекислого кислого (6.1.7) и растворяют в 10 см³ воды.Раствор хранят при температуре от 0 до 8 *С не более четырех недель.

6.1.9    Раствор сернокислого аммония молярной концентрации 3.2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 422.4 г сернокислого аммония по 4.21, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

6.1.10    Суспензия малатдегидрогеназа/лактатдегидрогеназа

В колбу вместимостью 100 см³ вносят малатдегидрогеназу из сердца поросенка по 4.22, растворяют в растворе сульфата аммония (6.1.9) с pH 6.0 и добавляют лактатдегидрогеназу из мышц кролика по 4.23 с pH 7,0 до получения суспензии. Затем суспензию разбавляют раствором сернокислого аммония (6.1.9) так. чтобы получить раствор, содержащий 600 единиц активности МД Г и 1400 единиц активности ЛДГ в 1 см³ раствора. Раствор хранят при температуре от 0 до 8 *С не более одною года.

6.1.11    Раствор ци грат-лиазы

Растворяют цитрат-лиазу по 4.24 в ледяной воде так. чтобы получить раствор с активностью 40 ед.фермента в 1 см³.Раствор хранят при температуре от 0 до 8 *С не более одной недели. Раствор хранят при температуре хранения минус 20 *С не более четырех недель.

6.1.12    Стандартный раствор лимонной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 1.600 г моногидрата лимонной кислоты (С₆Н₈0₇ • Н₂0) по 4.25. растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. При использовании суспензии с другой активностью ферментов объем суспензии в схеме отбора пипеткой (8.2.1) следует пропорционально увеличивать или уменьшать.

6.1.13    Проверка качества растворов и настройки спектрофотометра

Проверку проводят при хранении растворов (6.1.1—6.1.12) более двух недель.Пинеткой отмеряют в каждую из двухмерных колб вместимостью 100 см'соответственно 5.0 и 10.0 см³ стандартного раствора лимонной кислоты (6.1.12), добавляют по 10 см³ расгвор;! трихлоруксусной кислоты (6.1.1), доводят объем водой до метки и перемешивают.Массовую долю лимонной кислоты в обоих растворах определяют в соответствии с 8.1.3. 8.2.3.

Массовую долю моногидрата лимонной кислоты в стандартном растворе. А”,. %. вычисляют по формуле (3). используя следующие величины:

М — 210.1 г/моль (молекулярная масса моногидрата лимонной кислоты);

К₅ = 1000 см³ (6.1.12);

К = 5 см³ и 10 см³ по 6.1.13;

^7 = 100 см³ ПО 6.1.13.

Значение А”, для обоих растворов должно быть (100г5) %.

Если результат измерения не находится в данных пределах, следует проверить реактивы, пинетки. спектрофотометр и принять меры для получения необходимого результата.

6.2 Подготовка проб

6.2.1 Сыр и плавленый сыр

От пробы сыра отделяют корковый (при наличии поверхностный заплесневелый) слой так. чтобы получить порцию сыра массой не менее 50 г.Отобранную пробу сыра измельчают на измель-

51

чающем устройстве, перемешивают до пастообразного состояния. При необходимости измельчают вторично, перемешивают.

6.2.2    Плавленый сыр. содержащий наполнители других нишевых продуктов (ветчину, фрукты. орехи, травы и т.д.)

При определении массовой доли лимонной кислоты во всем продукте подготовку пробы проводят но 6.2.1.При определении массовой доли лимонной кислоты в расчете только на сырную массу из пробы удаляют наполнители, затем подготовку пробы проводят по 6.2.1.

6.2.3    Пробу готовят непосредственно перед определением.

7    Нулевое определение

Нулевое определение проводят дважды.Фильтрат готовят в соответствии с 8.1. используя все реактивы, кроме навески продукта и использования измельчающего устройства. Измерение оптической плотности проводят в соответствии с 8.2.

8    Проведение определения

8.1    Приготовление фильтрата

8.1.1    В стакан измельчающего устройства помешают навеску продукта массой 1.0 г, добавляют 50 см³ воды при температуре (45r5) "С и измельчают до получения однородной суспензии.Суспензию из стакана переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, ополаскивая стакан водой несколько раз до полного ее удаления.

8.1.2    К полученной суспензии приливают 10 см³ раствора трихлоруксусной кислоты (6.1.1), доводят объем водой до метки, перемешивают и дают смеси выстояться 30 мин.Перед фильтрованием содержимое мерной колбы не перемешивают.

8.1.3    Смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, отбрасывая первые 2 см³ фильтрата.

8.1.4    Пипеткой отбирают 25 см³ фильтрата в химический стакан вместимостью 50 см³, доводят активную кислотность до pH = 4. приливая раствор Б гидроокиси натрия (6.1.3). затем приливают раствор В гидроокиси натрия (6.1.4) и доводят активную кислотность до pH = 8, используя для контроля потенциометрический анализатор.

8.1.5    Содержимое химического стакана переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, ополаскивая стакан водой несколько раз до полного удаления содержимого из химического стакана. доводят водой объем до метки и перемешивают.

8.1.6    Смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, отбрасывая первые 2 см³ фильтрата.

8.2 Проведение измерений оптической плотности

8.2.1    Измерения проводят при комнатной температуре буферного раствора и воды.

8.2.1.1    В кювету спектрофотометра пипеткой наливают растворы, объем которых должен соответствовать таблице 1.

Т а б л и ц а 1

Наименование Объем раствора, см3 При измерении фильтрата и стандартного раст вора При нулевом определении Буферный раствор (6.1.6) 1.00 1.00 Раствор ПАДИ (6.1.8) 0.10 0.10 Суспензия МДГ/ЛДГ (6.1.10) 0.02 0.02 Фильтрат (8.1.6) и стандартный раствор (6.1.12) 2.00 — Фильтрат нулевого определения (7) — 2.00

8.2.1.2    Растворы в кюветах перемешивают пластиковыми мешалками, выдерживают в водяной бане при температуре от 20 до 25 *С в течение 5 мин.Затем измеряют оптическую платность раствора \ в каждой кювете относительно воздуха при длине волны 340 нм, используя спектрофотометр.

8.2.1.3    В кюветы с фильтратами приливают по 0,02 см³ раствора цитрат-лиазы (6.1.11).

8.2.1.4    Растворы в кюветах перемешивают и выдерживают в водяной бане при температуре от 20 до 25 *С в течение 10 мин.

ГОСТ Р 51459-99

8.2.1.5 И змеряют оптическую плотность раствора 4,₀ к каждой кювете относительно воздуха при длине волны 340 нм.

8.2.2    Вычисляют оптическую плотность фильтрата 4, и оптическую плотность растворов дли нулевого определения 4_Г по формулам:

Л ⁼ Ак ^— ^lOs*    (1)

А, = A_ik — 4_l0r,    (2)

где А^ — оптическая шютность фильтрата, измеренная перед добавлением цитрат-лиазы;

4,о* — оптическая шютность фильтрата, измеренная после добавления цитрат-лиазы и выдержи-вания в водяной бане при температуре от 20 до 25 "С в течение 10 мин;

4<,, — оптическая плотность растворов холостого определения, измеренная перед добавлением цитрат-лиазы;

4_10г — оптическая шютность растворов холостого определения, измеренная после добавления цитрат-лиазы, и выдерживания в водяной бане при температуре от 20 до 25 *С в течение 10 мин.

8.2.3    Если оптическая шютность 4, или А_г превышает 0.800. измерения повторяют но

8.1.5 — 8.2.2, используя более разбавленные растворы фильтратов. Если разбавление не проводят, то принимают значения V₆ = У₇ = 2 см⁵.

9    Обработка результатов

Массовую долю лимонной кислоты X. %, вычисляют но формуле

_х = К -Л,) М У\ V₂ У₅ ' Vj_ ₁₀₍₎ _ 1.915(4,-4,) Vj_    ₍₃₎

к 1т    У₂У₄ У₆    т    У_ь'

где 4, — оптическая шютность фильтрата;

4, — оптическая шютность растворов нулевого определения;

М — молекулярная масса безводной лимонной кислоты. М = 192.1 г/моль;

к — коэффициент молярного поглощения НАД Н на длине волны 340 нм. к = 6.3 • 10⁶ см²/моль;

/— длина оптического пути кюветы. /= 1 см;

т — масса навески продукта, г;

У, — объем жидкости в кювете спектрофотометра. V, = 3.14 см⁵;

У₂ — объем фильтрата в кювете спектрофотометра. У₂ = 2.00 см⁵;

У_} — объем, до которого был доведен фильтрат в процессе установления активной кислотности pH = 8.0 (8.1.5). V₃ = 100 см⁵;

У₄ — объем фильтрата (8.1.3), отобранный для установления активной кислотности, У₄ = 25 см⁵;

У₅— объем суспензии (8.1.1), У₅ = 100 см⁵;

У₆ — объем фильтрата (8.1.6), взятого при необходимости для разведения, см⁵;

У₇ — объем, до которого при необходимости был разбавлен фильтрат (8.1.6). см⁵.

Результаты измерений массовой доли лимонной кислоты выражают до второго десятичного знака. Если массовая доля лимонной кислоты менее 1 %, то результаты измерений выражают до третьего десятичного знака.

10    Метрологические характеристики

10.1    Сходимость

Относительная величина разницы между результатом любого из двух определений и среднеарифметическим значением результатов этих определений, полученных при определении одной и той же пробы одним и тем же лаборантом, пользующимся одними и теми же приборами, за короткий промежуток времени не должна превышать 5 % при вероятности Р= 0.95.

10.2    Воспроизводимость

Относительная величина разницы между результатом любого из двух определений и среднеарифметическим значением результатов этих определений, полученных двумя лаборантами, работающими в разных лабораториях с одной и той же пробой, не должна превышать 8 % при вероятности Р = 0,95.

10.3    Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость) превышает 5 %. то повторно проводят два новых определения.

53