ГОСТ P 51196-98 (ИСО 8069-86)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО СУХОЕ

Метод определения молочной кислоты и лактатов

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2009

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Московской государственной академией нишевых производств

ВНЕСЕН Техническим комитетом но стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агронро-мышлейной продукции на безопасность»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 334

3    Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 8069—86 «Сухое молоко. Определение содержания молочной кислоты и лактатов. Ферментативный метод» с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2. 3 и 7.1)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5    ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 2009 г.

© ИНК Издательство стандартов, 1998 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2009

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

ГОСТ Р 51196-98 (ИСО 8069-86)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО СУХОЕ Метол определения молочной кислоты и лактатов

Dried milk.

Method for determination of lactic acid and lactates

Дата введения 2000—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сухое молоко всех видов и устанавливает метод определения молочной кислоты и ее солей — лактатов.

2    Нормативные ссылки

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу

3    Определение

Массовая доля молочной кислоты и лактатов в сухом молоке, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в граммах молочной кислоты на 100 г сухою обезжиренною вещества.

4    Сущность метода

Восстанавливают пробу сухого молока в теплой воде, осаждают жиры и белки и фильтруют пробу. Полученный фильтрат обрабатывают ферментами и биохимическими реагентами, добавляемыми одновременно, но действующими последовательно:

- L-лактатдсгидрогеназа (L-ЛДГ) и D-лактатдегидрогеназа (D-ЛДГ) в присутствии никотина -мидадениндинуклеотида (НАД) окисляют лактат до пирувата, восстанавливая НАД до НАДН:

D-ЛДГ

L-ЛДГ

Ь-;1актаг/0-лактат+11АД*------->    НАДП+пируват+Н*;

- глутаматпируваттрансфераза (ГПТ) в присутствии L-глутамата преобразует пируват в L-ала-нин и L-глутамат в альфа-кетоглутарат:

ГПТ

нируват+ L-глутамат------->    L-a.iaHHH+2-оксоглугараг.

Измеряют массовую долю образовавшегося НАДН. эквивалентную массовой доле молочной кислоты и лактатов в пробе, на спектрофотометре при длине волны 340 нм.

5 Реактивы

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Вода, используемая дли приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной. Вода для приготовления растворов других реактивов и проб должна быть дистиллированной.

Препарат НАД должен содержать не менее 90 % основного вещества.

Издание официальное

5.1    Раствор гексациано ферра та (II) к а л и я

Растворяют 35.9 г гексацианоферрата (II) калия K₄|Fe(CN₆)|x ЗН_;0 в воде и доводят объем раствора до I дм³. Рас л юр перемешивают.

5.2    Раствор с у л ь ф а т а цинка

Растворяют 71,8 г сульфата цинка гептагидрата (ZnS0₄7H₂0) в воде и доводят объем раствора до I дм³. Раствор перемешивают.

5.3    Раствор гидроксида натрия с (NaOH) = 0,1 моль/дм³

Растворяют 4.00 г гидроксида натрия (NaOH) в воде и доводят объем раствора до 1 дм³. Раствор перемешивают.

5.4    Буферный раствор активной кислотности 10.0 pH

Растворяют 7.92 г глицилглицина (C₄H₈N₂0₃) и 1.47 г L-глутаминовой кислоты (C₅H₄N0₄) в

80 см³ воды. Устанавливают активную кислотность раствора (10,0=0.1) pH при 20 °С раствором гидроксида натрия с (NaOH) = 10 моль/дм³ и доводит объем раствор;» водой до 100 см³. Раствор перемешивают.

Раствор устойчив 3 мес при температуре от 0 до 5 *С.

5.5    Раствор НАД

Растворяют 350 мг НАД (C₂₂H₂₇N₇0₁₄P₂) в 10 см³ воды.

Раствор устойчив I мес при температуре от 0 до 5 *С.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.6    Раствор L-ЛДГ

Растворяют 10 мг L-ЛДГ из мускульных тканей свиньи в I см³ раслюра глицерина массовой доли 50 % (активная кислотность приблизительно 7 pH).

Удельная активность раствора L-ЛДГ должна быть не менее 5500 Е/см³ при 25 *С. Раствор устойчив 12 мес при температуре от 0 до 5 *С.

Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с колотым льдом.

5.7    Суспензия D-ЛДГ

Смешивают 5 мг D-ЛДГ из Lactobacillus leichmannii с 1 см³ раствора сульфата аммония c((NH₄)₂S()₄) = 3.2 моль/дм³ (активная кислотность приблизительно 6 pH).

Удельная активность суспензии D-ЛДГ должна быть не менее 1500 Е/см³ при 25 °С. Суспензия устойчива 12 мес при температуре от 0 до 5 ’С. Во время использования сосуд с суспензией должен бы л» погружен в емкость с колотым льдом.

5.8    Суспензия ГПТ

Суспензию ГПТ из сердца свиньи концентрации 20 мг/см³ удельной активности 1600 Е/см³ при 25 °С в растворе сульфата аммония с ((NH₄)₂S0₄) = 3.2 моль/дм³ готовят центрифугированием 2 см³ суспензии концентрации 10 мг/см³ в течение 10 мин (при факторе разделения центрифуги 4000 #). Отбирают 1 см³ над осадочной жидкости и отбрасывают, а оставшуюся суспензию используют дли анализа.

Готовая суспензия устойчива при температуре от 0 до 5 *С 12 мес. На время работы сосуд с суспензией помешают в емкость со льдом.

5.9    Раствор L-л а к т а т а л и т и я

Растворяют 50 мг L-лактата лития (C,H_sO,Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см³. Раствор перемешивают.

5.10    Раствор D-л а к т а т а лития

Растворяют 50 мг D-лактата лития (C_xH₅0,Li) в воде и доводят объем раствора до 500 см³. Раствор перемешивают.

6 Средства контроля и вспомогательные устройства

Обычная лабораторная аппаратура, в том числе указанная в 6.1—6.11.

6.1    Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью =0.001 г.

6.2    Стаканчик стеклянный для взвешивания или бюкса вместимостью 50 см³.

6.3    Цилиндр градуированный вместимостью 50 см³ и допускаемой относительной погрешностью =2 %.

6.4    Колбы мерные вместимостью 100 см³ и допускаемой относительной погрешностью

=0.2 %.

2

ГОСТ Р 51196-98

6.5    Дозаторы пипеточные объемами доз 0.02; 0,05; 0.2; 1 и 2 см³ и относительной погрешностью дозирования ±1 %.

6.6    Пинетки градуированные вместимостью 2. 5 и 10 см³ и допускаемой относительной погрешностью ±1 %.

6.7    Воронка стеклянная для фильтрования диаметром 7 см.

6.8    Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см. свободные от молочной кислоты и лактатов.

6.9    Палочка стеклянная.

6.10    Палочки пластиковые или иные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.11    Спектрофотометр (фотометр) со следуюшими техническими характеристиками: длина волны 340 нм; спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0.000 до 2.000; тмрешность установки длины волны — =3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0.15 %.

Кюветы фотометрические толщиной поглошаюшего слоя 1 см.

7    Порядок подготовки к проведению измерений

7.1    Отбор проб — по ГОСТ 26809.

7.2    Пробу хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

8    Порядок проведения измерений

При проведении измерений следует избегать загрязнений, в том числе связанных с поглощением влаги или конденсацией ее на стенках сосудов.

8.1    Проверка активности реактивов

При приготовлении новой порции реактивов (5.5—5.8) и хранении готовых реактивов без использования более двух недель или изменении условий хранения проверяют активность реактивов.

8.1.1    Для проверки активности реактивов в две мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см³ вносят по 10 см³ L-лактата лития (5.9). в две другие мерные колбы (6.4) вместимостью 100 см³ вносят по 10 см³ D-лактата лития (5.10). Определяют концентрации L-молочной кислоты и ее лактатов, а также концентрацию D-молочной кислоты и ее лактатов (8.5.2—8.6).

8.1.2    Концентрации D-лактата лития. Л'_г>._{лакта7а}. и L-лактата лития. Л',._{дагтата}, мг/дм³, вычисляют по формулам:

^1)-.штата 346 х Д /1,

^Ь-лактага 341 х Д А,

где д А — разность оптических плотностей, рассчитанная по 8.6.4.

8.1.3 Принимая во внимание чистоту реактивов, определенная концентрация лактата лития при проверке активности реактивов должна составлять (100г5) % концентрации приготовленных растворов.

Если определяемое значение не попадает в этот интервал, проверяют реактивы, технику измерения, точность пипеток и дозаторов, а также исправность спектрофотометра. После этого тестирование повторяют до получения удовлетворительных результатов.

8.2    Подготовка пробы

Пробу продукта помещают в контейнер вместимостью, в два раза превышающей объем пробы, с герметично закрывающейся крышкой, тщательно перемешивают, энергично встряхивая и переворачивая контейнер.

В процессе подготовки пробы необходимо исключить ее контакт с атмосферой, чтобы уменьшить абсорбцию влаги.

8.3    Масса навески

В стеклянном стаканчике (6.2) взвешивают 1.000 г пробы.

8.4    Подготовка контрольной пробы

Конгрольное испытание проводят, как описано в 8.5—8.6. используя те же реактивы, но без пробы продукта. Для испытания пробы продукта (8.6) берут 1.0 см³ фильтрата (8.5.3).

3

8.5    Приготовление раствора пробы и удаление белка

8.5.1    Навеску сухого молока (8.3) растворяют при помешивании стеклянной палочкой (6.9) в 20 см³ воды температурой от 40 до 50 'С. количественно переносят в мерную колбу (6.4) вместимостью 100 см³ и охлаждают до комнатной температуры (20 *С).

8.5.2    К раствору в колбе (8.5.1) последовательно добавляют 5.0 см³ раствора гексацнанофер-рата (II) калия (5.1). 5.0 см³ раствора сульфата цинка (5.2). 10 см³ раствора гидроксида натрия (5.3). тщательно перемешивая содержимое колбы после добавления каждого компонента и доводят объем раствора водой до 100 см³. Снова тщательно перемешивают раствор и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

8.5.3    Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр (6.8). отбрасывая первую порцию фильтрата.

8.6    Определение

8.6.1    В спектрофотометрическую кювету (6.11) пипеточным дозатором (6.5) вносят:

-    1.0 см³ фильтрата (8.5.3);

-    1.0 см³ буферного раствора (5.4);

-    0.20 см³ раствора НАД (5.5);

-    0.02 см³ суспензии ГПТ (5.8).

Содержимое кюветы перемешивают палочкой (6.10).

8.6.2    Кювету выдерживают 5 мин. затем измеряют оптическую плотность раствора относительно воды при длине волны 340 нм.

В кювету добавляют 0.02 см³ раствора L-ЛДГ (5.6) и 0.05 см³ раствор;! D-ЛДГ (5.7). Раствор перемешивают палочкой (6.10).

Примечание — Раздельное определение L- и D-маточных кислот и их лактатов в пробе можно осуществить добавлением или L-ЛДГ или D-ЛДГ.

8.6.3    Раствор (8.6.2) выдерживают при комнатной темпер;!туре 45 мин и измеряют оптическую плотность. Раствор выдерживают'еще 15 мин и снова измеряют оптическую плотность (измерения после 60 мин реакции).

Примечание — Если требуется опрслслтъ содержание только L-молочнои кислоты и се лактатов. измерения производят соответственно через 30 и 45 мин.

8.6.4    Рассчитывают разность измеренных значений оптических плотностей по формуле

Д /1 = |(/1 „60—Л „о)—4(Л „60—Л п45)1"М кбо—Л ко)—4(Л к60 Л к4$)Ь

где А _||60 — оптическая плотность пробы через 60 мин (8.6.3);

А _||0 — оптическая плотность пробы через 5 мин (8.6.2);

А _п45 — оптическая плотность пробы через 45 мин (8.6.3);

Л_к60 — оптическая плотность контрольной пробы через 60 мин (8.6.3);

А_к0 — оптическая плотность контрольной пробы через 5 мин (8.6.2);

А _к45 — оптическая плотность контрольной пробы через 45 мин (8.6.3).

Примечания

1    В некоторых случаях может иметь место медленно текущая побочная реакция. И зменение оптической плотности, вызванное згой реакцией, исключают экстраполяцией оптической плотности на нулевой момент времени.

2    Если оптическую плотность измеряют через 30 и 45 мин. <|юрмула имеет вид

АА= \{А „45—А „о)—3(/4 „45 А пЗо)| \(А к45 А _ко)—3(Л *45—А кЭо)1*

где А „зо — оптическая плотность пробы через 30 мин (8.6.3);

А _кзо — оптическая плотность контрольной пробы через 30 мин (8.6.3).

8.6.5 Если разность оптических плотностей, рассчитанная в соответствии с 8.6.4, превышает 0.500. определение повторяют (8.6.1—8.6.4). разводя дистиллированной водой растворы пробы продукта (8.5.3) и контрольной пробы (8.4).

ГОСТ Р 51196-98

9    Правила обработки результатов измерений

9.1    Метод расчета

Массовую долю молочной кислоты и лактатов X в сухом молоке, выраженную в г молочной кислоты на 100 г сухого обезжиренного вещества, вычисляют по формуле

X=±dl!L_x^V> -^К« *^К» х-!^-хЮ²; exlxm    У2    хVy

где А — разность оптических плотностей (8.6.4);

М — молярная масса молочной кислоты. М = 90.1 г/моль;

V_{ — объем раствора в кювете (8.6.2). см³

(для определения D- и L-маточных кислот Р, = 2.29 см³, для определения L-молочной кислоты Г, = 2.24 см³, для определения D-молочной кислоты Р, = 2.27 см³);

Р₄ — объем подготовленного к анализу раствора (8.5.2), см³ (Р₄ = 100 см³);

Р₅ — объем разведенного фильтрата (8.6.5). см³ (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то Р₅ = 1.0 см³); е — коэффициент оптической плотности НАДН. дм³-ммать“^,см“^|. равный: при длине волны 340 нм — 6.3. при длине волны 365 нм — 3.5. при длине волны 334 нм — 6.18;

/— толщина поглощающего слоя в кювете, см; т — масса навески сухого молока, г (8.3);

Р₂ — объем фильтрата (8.5.3) в спектрофотометрической кювете (8.6.4). см³;

Р, — объем фильтрата (8.5.3). взятый для разведения (8.6.5), см³ (если испытание проводилось без разведения фильтрата, то Р, = I см³);

1Р_(К.„ — массовая доля сухого обезжиренного вещества в пробе продукта. %.

Результат определяют с точностью 0,001 % (г/100 г).

9.2    Точность

Прим с ч а н и с —Сходимость и воспроизводимость были рассчитаны но результатам межлабораторных испытаний.

9.2.1    Сходимость

Абсолютное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать г= 0.010 г/100 г. если среднее арифметическое результатов не превышает 0.060 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 15 % среднего арифметического значения, если оно превышает 0.060 г/100 г.

9.2.2    Воспроизводимость

Абсолютное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать R = 0.015 г/100 г, если среднее арифметическое результатов не превышает 0.100 г/100 г включительно.

Относительное расхождение результатов двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать 20 % среднего арифметического значения, если оно превышает 0.100 г/100 г.

10    Оформление результатов измерений

В отчете об испытании должны быть указаны:

-    используемый метод;

-    полученные результаты:

-    любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

5

УДК 637.143.001.4:006.354    ОКС 67.100.10    Н19    ОКСТУ    9209

Ключевые слова: сельскохозяйственные продукты, молочные продукты, молоко, сухое молоко, химический анализ, определение массовой доли, молочная кислота, лактаты

6