Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

39 страниц

487.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В1, В2, холинхлорида, В5 химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией

Отменён
Действие завершено 30.06.2014

Показать даты введения Admin

Страница 1

ГОСТ P 50929-96

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ В

Издание официальное

*-W/I47


ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Страница 2

ГОСТ Р 50929-96

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Акционерным обществом открытого типа «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»)

Нижегородским государственным техническим университетом

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, ЬВД, премиксы*

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 19% Г. № 488

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

С И П К Издательство стандартов, 1996

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

Страница 3

ГОСТ Р 50929-96

Содержание

1    Область применения..............................1

2    Нормативные ссылки..............................1

3    Отбор проб....................................3

4    Определение витамина В,.............3

5    Определение витамина В,.............7

6    Определение витаминов В, и В, высокоэффективной жидкостной хроматографией..............9

7    Определение холинхлорнда.............14

8    Определение витамина В,.............17

9    Определение витамина В4 высокоэффективной жидкостной

хроматографией.................21

10    Требования техники безопасности.........30

Приложение Л Хроматограмма экстракта из премикса ...    31

Приложение Б Хроматограмма смеси витаминов В, и В, ...    32

Приложение В Хроматограмма экстракта витамина Bs из премикса ...............33

Приложение Г Хроматограммы растворов витамина В, . . . .    34

Приложение Д Библиография............35

ill

Страница 4

ГОСТ Р 50929-96

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ Методы определения ант ям иное группы В

Premixes. Methods Гог deteimination of vitamin В complex

Дата iwuni 1997—01—0!

1    ОБЛАСТЬ ПРИМЕНКНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В., В., холинхлорида. В< химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

2    НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия

ГОСТ427—75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия ['ОСТ 2603—79 Ацетон. Технические условия ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия

Илханис официальное

I

2 — 1238

Страница 5

ГОСТ Р 59929-96

ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия ГОСТ4204—77 Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые Технические условия

ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80. Комбикорма, сырье. Методы отбора проб ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, оснопные параметры и размеры

ГОСТ 25664-83 Метол (4-мстиламинофенол сульфат). Технические условия

ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия ГОСТ 29227- 91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Ч:»сть 1. Общие требования

ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часгь 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

Страница 6

ГОСТ Р 50919 - 9*

ГОСТ29251—91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки Часть 2. Бюрйтки без времени ожидания

3    ОТБОР ПРОБ

Огбор проб по ГОСТ 13496.0

4    ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В,

Сущность метода заключается в извлечении витамина В, (тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобугиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.

4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуоромстр Квант-7, ФАНК-1

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1

Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.

Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.

Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105±2) *С.

Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см5 по ГОСТ 25336.

Стаканы В- 1-100ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу 13).

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации с ('/, H,S04) = 0,1 моль/дм’.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации с (НС!) = 0,01 моль/дм5

3

2*

Страница 7

ГОСТ V 50929 W

Калий хлористый по ГОСТ 4234.

Натрия гидроокись по ГОСТ4328, растворе массовой долей 10 %.

Спирт иэобугиловый по ГОСТ 6016.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166

Калий желсзосинсродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1 %.

Хинннсульфат или хннинхлорид по нормативным документам (9, 10).

Тиминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам 116,17].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метршкикческнмн характеристиками не ниже указанных

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а

4.2 Подготовка к испытанию

4.2.1    Приготовление окислительной смеси

1 см* свежеприготовленного раствора жслезосинероднстого калия смешивают с 49 см5 раствора гидроокиси натрия.

Смесь готовят вдень проведения анализа.

4.2.2    Приготовление основного стандартного раствора из хининсуль-фата

10 мг хинннсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см' в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянкс из темного стекла.

4.2.3    Приготовление рабочего стандартного раствора хининсуяьфа-

та

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см* основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см! и доводят до метки раствором серной кислоты.

Концентрация хинннсульфата — 1 мкг/см1.

4.24 Приготовление основного стандартного раствора из тиамин-бромида

Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2—3 ч при температуре 100—105 *С, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см’ в растворе соляной кислоты молярной концентрации

4

Страница 8

ГОСТ Р 50929-96

с(НС1) = 0,01 моль/дм5 и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см1.

Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.

4.2.5    Приготовление рабочего стандартного раствора тиамипбро-мида

Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом-

1 см5 основного стандартного раствора тиамннбромида (4.2.4) переносят в мерную колб)' вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Концентрация рабочего стандартного раствора тиамннбромида — 1 мкг/см*.

4.2.6    Контроль за содержанием витамина В в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

4.3 Проведение испытания

Навеску прсмикса массой 5 г. взвешенную с погрешностью не более 0,002 г. помещают в мерную колбу вместимостью 100 см*, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см3 серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный филыр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см: фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см5 и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см* разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см3 изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний — переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см3 раствором серной кислоты, перемешивают.

Из пробирки берут 8 см3 раствора в делительную воронку, приливают 6 см’ окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см3 изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) — фильтруют через обезболенный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4—5 г) в флуорох<етрическую пробирку и флуорометрируют.

Для окисления стандартного раствора берут S ем5 рабочего стандартного раствор;! тиамина и проводят дальнейшую его об|)а6агку, как с испытуемой пробой.

>

Страница 9

ГОСТ Р 5W29-96

Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1—2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.

Если в качестве стандартного раствора используют раствор хи-нинсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.

По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор наделение прибора 80.

4.4. Обработка результатов испытания

Содержание витамина В, АТ в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

у_ (л-л,)-У-У, С “ (/■-/■)'"•

где А — показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения,

— показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;

V — первоначальный объем раствора, см5;

К, V} — разведения, см’;

С — масса витамина в стандартном растворе, мкг;

/"—показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;

F, — показания флуорометра для стандартного раствора после гашения,

т — масса навески, г,

И, — объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см3.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р- 0,95 не должны бьгп» более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

6

Страница 10

ГОСТ Р 50929 -96

Примечание — При использовании в качестве стандартного раствора хинкнсульфата (хииинхлорида) в расчетную формулу «мести выражения (f-fj) подставляют цифру 72.

5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В:

Сущность метода заключается в извлечении витамина В, (рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.

5.1    Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го Kiacca точности с наибольшим пределом

взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Флуорометр Квант-7, ФАНК-1

рН-метр по нормативному документу |8|

Баня водяная.

Центрифуга ОПН-8

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу 13].

Колбы мерные 2-50(100. 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1 (2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Витамин В, по нормативному документу [11].

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5 % и раствор молярной концентрации с(НС1) = 0,1 моль/дм’.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15 %.

Натрий двууглекислый по ГОСГ 4201.

Натрия гидросульфит но ГОСТ 246.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

5.2    Подготовка к испытанию

5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина В,

40 мг витамина В; растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см} ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 *С в мерной колбе вместимостью 1000 см’. Доводят объем ло мело» дистиллированной водой. В 1 см’ раствора содержится 40 мкг рибофлавина.

7

Страница 11

ГОСТ Р 50929-9*

Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.

5.2.2    Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина

1 см' основного стандартного раствора рибофлавина переносят в

мерную колбу вместимостью 100 см1 и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5 % до pH 5,5—6,0.

В 1 см3 раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.

Раствор готовят перед употреблением.

5.2.3    Контроль за содержанием витамина В, в стандартном растворе проводят по 6.2.4.

5.3    Проведение испытания

Навеску премикса массой 2—5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г помещают в мерную колбу вместимостью J00 см\ приливают 75 см5 раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,1 моль/дм1, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помешают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.

После охлаждения колбы pH раствора доводят до значения 5,5— 6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.

Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см5 фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см1) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флу-орометрическую пробирку 12—15см} испытуемого раствора, в другую — такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2—3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4—6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе.

5.4    Обработка результатов испытания

Содержание витамина В; Л'в премиксе, гД, вычисляют по формуле

У _    -    Л|    )    С-    у    -У2

lF-Ft) • т- У, '

где А — показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;

А, — показания флуорометра для испытуемого раствора после гашен ия фл уорсс це ншш,

к

Страница 12

ГОСТ Р 50929-96

С — содержание витамина В, в рабочем стандартном растворе, мкг/см1;

К— первоначальный объем раствора, см*;

V,— окончательный объем разведения, см5;

F — показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;

F, — показания флуорометра для стандартного раствора поело гашения флуоресценции;

т — масса навески, г;

К, — объем раствора, взятый для разведения, см’.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р ■ 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В, И В. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Сущность метода заключается в экстракции витаминов В, (тиамина) и Bj (рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спсктрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.

Метод применим в диапазоне содержания витамина В, от 0,05 до 0,5 г/кг в прсмиксе, витамина В5 — от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.

6.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10 %. Допускается использонать хроматографы «Цвет-306», «Цвст-3006 со спскгрофото-мстричсским детектором* и «Милихром*.

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом «Силасорб С-18» или «Сспарон С-18*.

Спскт]юфотомстр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186— 1100 нм).

3-123»

Страница 13

ГОС Т Р >0929 96

Вссы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.

Секундомер механический по нормативному документу [15) Сорбент «Силасорб С-18* зернением 7 мкм. рН-метр по нормативному документу |8|

Мешалка магнитная ММ-5.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин. Иономср ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07. Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.

Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см} по ГОСТ

25336.

Колбы мерные 2-25(50. 100, 2(Ю)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Ацетонитрил по нормативному документу [7]

Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pyher)

Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу (4| Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная и раствор молярной концентрации с(НС1) - 0,01 моль/дм'.

Витамин В, по нормативному документу (11|

Витамин В по нормативным документом (16. 17|

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается испо.щэоынис другой аппаратуры, реактивов и матери^юв с техническими и метрологически ми характеристиками не ниже укачанных,

2    Вес реактивы ласк нм бить квалификации X. ч. или м. X а.

6.2 Подготовка к испытанию

6.2.1    Приготовление мтента

Для приготовления 1 дм* элюента смешивают 120 см3 ацетоннтрила с 880 см* дистиллированной воды, добавляют 2,5 см3 трнэтиламина, 0.5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфориую кислоту до pH 7,6 по рН-мстру. Полученную смесь фильтруют чсрс-i стеклянный фильтр для удаления механических примесей.

Срок хранении элюента не более I мес.

6.2.2    Приготовление раствори -экстрагента

10

Страница 14

ГОСТ Р 50929-96

К 1 дм5 дистиллированной воды приба&тяют 0,8 см^ концентрированной (37 %-ной) соляной кислоты, pH раствора 2±0,2.

6.2.3    Приготовление основных стандартных растворов витаминов Вх и В}

Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В, и В, берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тмаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3, а рибофлавина — в мерной колбе вместимостью 200 см1, при нагревании до температуры 70—80 *С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см5 1 мг витамина В, и 0,05 мг витамина В. соответственно.

Срок хранения основных стандартных растворов витаминов В. и В; — не более 2 недель в холодильнике.

6.2.4    Контроль за содержанием витаминов В, и В:в основных стандартных растворах

Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотомстричсски по значениям молярных коэффициентов свстопоглошения.

Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Массовую концентрацию витаминов Bt и В, с рассчитывают по формуле

„ SOD

с --,

Б1

где D — оптическая плотность;

Е— молярный коэффициент;

I — толщина слоя раствора, 1 см.

Массовую концентрацию витаминов В, с: и В, с,, мг/см\ рассчитывают соответственно по формулам:

Страница 15

ГОСТ Y 50929--96

где 205— молярный коэффициент светопоглошения тнаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;

324 —молярный коэффициент светопоглошсния рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.

6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов В{ и В,

Йз основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминок В. — 0,02 мг иВ,- 0,025 мг в 1 см3.

Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см3 помешают I см1 основного стандартного раствора тнаминхлорида (6.2.3) и 25 см3 основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.

6.3 Проведение испытания

6.3.1 Экстракция витаминов В. и В,

Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помешают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см’ и приливают 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) = 0,01 моль/дм'. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000— 6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см3) раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) ■'* 0,01 моль/дм', сливают раствор в центрифужную пробирку и снов;» центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым втой же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3—4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анализа.

12

Страница 16

ГОСТ Y $0929—96

6.3.2 Хроматографирование

Хроматографирование осущест&тяют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4 х 150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4)

Подвижная фаза — элюент (6.2.1).

Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования — 1,2 смУмин. Время удерживания для витамина В составляет 6 мин, а для витамина В, — 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора — 10 мкдм' Для насыщения колонки ь начале работы производится 3—5 загрузок, отмечая высоты ников. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов В и В,.

Измеряют высоты пиков, как расстояние от вершины пика до линии проведенной в основании пика (приложение А, рисунок А.1 и приложение Б. рисунок Б.1).

6.4 Обработка результатов испытания

Содержание витаминов В, и В, ЛГ, и X, в премиксе, г/т, вычисляют по формуле

ДГ, (Л\) в -<УЯ ,

*с« «

где hx — высота пика витамина на хроматофаммах экстракта из пре микса, мм;

с^ — массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/с.м5;

Vx — объем пре микса с экстрактом, см’;

А.п — высота пика витамина на хроматофаммах рабочего стандартного раствора, мм;

т — масса навески премикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при довершельной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения. а между результатами, выполненными в двух разных лаборатори-

13

Страница 17

ГОСТ Р 50929-96

ях при доверительной RcpojtTHocTH Р ^ 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛННХЛОРИДА

Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзаме щс н н о го фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спектрофотомстрически.

7.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлектроколориметр • ФЭК-56М, КФК или спектрофотометр типа СФ-26.

Насос вакуумный по ГОСТ 25336.

Центрифуга ОПН-8.

Колбы конические вместимостью 50—100 см1 по ГОСТ 25336.

Эксикатор вакуумный по ГОСТ25336.

Стаканы химические вместимостью 200- 250 см5 по ГОСТ 25336.

Баня водяная,

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см’ по ГОСТ 25336.

Воронка ВФО-40-Г10Р-16 (Шотта Хг 2) по ГОСТ 25336.

Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.

Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Цилиндр мерный 1(2.3, 4)-100 по ГОСТ 1770.

Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу f3).

Холинхлорид кристаллический по нормативному документ,' 118|.

Спирт этиловый по ГОСТ 18300.

Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ9337. раствор с массовой долей 0,1 %.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Спирт изопропиловый по нормативному документу И).

Рейнекат аммония по нормативному документу |5]

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

14

Страница 18

ГОСТ Р 50929-96

Примечания

1    До тикаете я использование другой аппаратуры, ре-актинов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками ис ниже указанных.

2    Псс реактивы должны Gun. квалификации х. ч. иш ч. д. а.

7.2 Подготовка к испытанию

7.2.1    Приготплгение осаждающего реактива

2 г рсннската аммония растворяют в 100 см1 этилового спирта в кошпсской колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40±2) *С в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обе «золенный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.

7.2.2    Приготовление стандартного раствора холинхлорида

0,1 г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см\ Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в I см*.

Допускается приготовление стандартного раствора из 70 %-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100 %-ную активность.

7.2.3    Построение градуировочного графика

В 5 конических колб вместимостью 50 см’ помешают 1, 2, 5, 7, 10 см’’ стандартного раствора холинхлорида соответственно добавляют 10 см' раствора фосфата натрия и 5 см5 раствора рей не ката аммонии и далее проводят все испытания но 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметрс с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строит градуировочный график.

7.2.4    Проведение испытания

Навеску п ре микса массой 1—5 г. взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 1(H) см', приливают 50 см* дистиллированной воды, нагревают до 80 *С и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5—20 см* фильтрата и колбу с притертой пробкой, приливают 10 см5 раствора фосфорнокислого натрия и 5 см3 раствора рсйнската аммония Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 “С После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта N? 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся нафильт-

:s

Страница 19

ГОСТ Р 50929 96

рс, промывают 4—5 порциями (по 5 см1) охлажденного изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см4, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.

Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см3. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметрс с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона.

7.3 Обработка результатов испытания

Содержание 70 %-ного холинхлорида Xв премиксе, г/т, рассчиты-вают по формуле

К 1.43 V m-v{ '

где К — масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;

1,43 — коэффициент пересчета на 70 %-ный раствор холинхлорида;

V— обший объем экстракта, см1; т — масса навески, г,

V. — объем раствора, взятый на проведение анализа, см5.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при довери тельной вероятности Р= 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р~ 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

16

Страница 20

ГОСТ Р 50929-96

8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В,

Сущность метода заключается в кислотном пиролизе связанных форм витамина В( (никотиновой кислоты), очистке пиролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.

8.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400—440 нм.

Баня водяная.

Баня ледяная.

Воронка Бюхнера № 3 или № 4 по ГОСТ 9147.

Палочки стеклянные.

Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм* по ГОСТ 25336.

Склянки из темного стекла.

Колбы конические вместимостью 250 дм'по ГОСТ 25336.

Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.

Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3J.

Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по Г ОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см3 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(2. 3,4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.

Бром по ГОСТ 4109.

Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10 %.

Кальций углекислый по ГОСТ 4530.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации 5 (0,5 н.).

Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями с(У; H.SO()=2 моль/дм' ис(‘/, H;S01)=10 моль/дм’.

Витамин В5 но нормативному документу (121 -

Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6 %.

Натрия пироокись по ГОСТ4328, растворы молярных кон центра -

Страница 21

ГОСТ V 50929 -96

ций с (NaOH) = 4 моль/дм3 и c(NaOH) =* 10 моль/дм5.

Спирт этиловый по ГОСТ 1X300.

Уголь активный по ГОСТ 6217.

Фенолфталеин по нормативному документу |6)

Цинк сернокислый по ГОСТ4174, раствор с массовой долей 80 %.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. и ч. 5. а.

8.2 Подготовка к испытанию

8.2.1    Перекристагшзация метола

500 см? раствора серной кислоты молярной концентрации с ('/, H,S04) = 0,1 моль/дм5 нагревают до кипения, добавляют 100 i метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера. фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм1 этилового спирта (96"), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном местс

Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2—3 раза этиловым спиртом, порциями по 30 -40 см1 и высушивают на воздухе в темном местс.

Подготовленный метол хранят в склянке из темною стекла к холодильнике до полного использования.

8.2.2    Приготовление раствора метола

Навеску пере кристаллизирован ною метола массой (810.002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см' и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации с(НС|)-- 0,5 моль/дм*. Раствор готовят перед употреблением.

8 2.3 Приготовление бромной воды

В темную сктянку с притертой пробкой 100 см' дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4- -5 см'' брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1—3 суг для лучшею насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин

8.2.4 Приготовление роданбромидиого раствора

К 30 см' охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10 % до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют

IK

Страница 22

ГОСТ Р 50919--96

эти же растворы с массовой долей 1 % до полного обссцвсчивания бромной воды. К обесцвеченному раствору постепенно, небольшими порциями, по 20—50 мг, добавляют углекислый кальций до прекращения выделения пузырьков газа.

Раствор фильтруют от осадка через обеззоленный фильтр с синей лентой в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

8.2.5    Приготовление основного стандартного раствора витамина Я.

(500±0,002) мг витамина В5 помещают в мерную колбу вместимостью 500 см’, добавляют 200 см’дистиллирован ной воды, 5 см’раствора серной кислоты молярной концентрации с (У, H,SOt)=10 моль/дм1 и после растворения кристаллов доводят объем дистиллированной водой до метки.

В 1 см5 раствора содержится 1000 мкг витамина Bv

Раствор годен к употреблению в течение 6 мес при хранении в холодильнике.

8.2.6    Приготовление рабочего спшн<)артногораствора витамина В-

5 см3 основного стандартного раствора витамина В, разводят дистиллированной водой в колбе вместимостью 1 дм3, доводят до метки этой же водой и тщательно перемешивают. В 1 см'расгвора содержится 5 мкг витамина Bs. Раствор готовят в день проведения анализа.

8.3 Проведение испытания

Навеску массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см\ смывая горлышко колбы 60—65 см5 раствора серной кислоты молярной концентрации с ('/, H,S04) = 2 моль/дм’. Содержимое перемешивают и колбу помещают в кипящую водяную баню на 40 мин, периодически перемешивая содержимое. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают И фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 5—10 см1 фильтрата.

Отбирают 10—20 см‘ фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 см5 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 25 см’ полученного раствора помешают в цилиндр вместимостью 50 см1, добавляют 1—2 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют,

19

Страница 23

ГОСТ Р 50929-96

внося по каплям раствор гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 10 моль/дм' до получения слабо-розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации с(1/. H,S04) = 2 моль/дм1, добавляя по каплям до исчезновения розового окрашивания. Раствор охлаждают, добавляют 2 см5 раствора сернокислого цинка и 1—2 капли этилового спирта (для устранения пены).

Из пипетки по каплям добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией c(NaOH) = 4 моль/дм5, одновременно перемешивая палочкой до образования осадка и появления бледно-розовою окрашивания раствора. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации с (‘/: H,S04) = 2 моль/дм’ (до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин, периодически перемешивая. Палочку вынимают, обмывают над цилиндром дистиллированной водой и доводят объем до S0 см', перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Цветную реакцию проводят в восьми пробирках с притертыми пробками: в одну пробирку вносят 5 см* дистиллированной воды (контроль на реактивы. В,); в три пробирки вносят по 5 см’ рабочего стандартного раствора, В; в четыре пробирки вносят no 5 см} напученного фильтрата, из них 2 пробирки, с испытуемым раствором А; две — поправка на амннореагирующие вещества. А,.

Все пробирки, кроме А,, помешают на 5 мин в водяную баню при температуре (50±2) 'С. После этого в 2 пробирки (А,) вносят по 2 см’ дистиллированной воды, а во все остальные пробирки — по 2 см’ родан бро мид но го раствора из бюретки в вытяжном шкафу. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помешают в баню при той же температуре на 10 мин. По истечении этого времени пробирки вынимают, охлаждают водой до комнатной температуры и ставят на 10 мин в темное место. Затем в каждую пробирку' приливают по 3 см1 раствора метола, подмешивают и оставляют на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. По истечении этого времени растворы фильтруют через бумажный складчатый фильтр, если они мутные, и колоримет-рнруют на фотоэлектроколоримстре (синий светофильтр) или спектрофотометре при длине волны 400 -440 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды.

Страница 24

ГОСТ Р 50929-96

8.4 Обработка результатов испытания

Содержание витамина В, Xи премиксе, г/г, рассчитывают по формуле

у (Л-Л^У у; ул с ~ (Я - в;) п< У, V3 V, ’

где А — оптическая аютность испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определении);

Л, — оптическая плотность раствора - поправки на амннореагирую-щие вещества (среднее из двух параллельных определений);

V — объем пиролизата, см5;

V, — объем разведения, см1;

У\ — объем раствора после обработки сернокислым цинком, см5;

С — масса витамина В, в измеряемом стандартном растворе, мкг,

В — оптическая плотность стандартного раствора (среднее из трех параллельных определений);

— оптическая плотность раствора — контроль на реактивы;

m — масса навески прсмикса, г;

\\ - объем, взятый на дополнительное разведение, см5;

У} — объем гидролизата, взятый на обработку сернокислым цинком, см5;

Vi — объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см5.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые, расхождения между которыми при доверительной вероятности Р= 0,95 не должны бьггь более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В, ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

9.1 Определение витамина 8S с применением жидкостного м икроколоночного хромат о*

Страница 25

ГОСТ Р S0929—%

графа отечественного производства марки «М и л и х р о м».

Сущность метода заключается в экстракции витамина В5 (никотиновой кислоты) из навески п ре микса раствором соляной кислоты и последующем определении его содержания в испытуемом растворе с помощью хроматографа «Мил их ром».

9.1.1 Аппаратура, материагы и реактивы

Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром» со спек-трофотометрическим детектором (спектральный диапазон от 190 до 360 нм).

Колонка хроматографическая размером 2 х 120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С18, СиласорбБРНС 18, Сспарон С18.

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Колбы конические КН-100, КН-200 по ГОСТ 19908.

Баня водяная с терморегулятором.

Пипетки 2-1(2)-1, 2-1(2)-5, 2-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Колбы мерные 2-50-1(2), 2-100-1(2), 2-200-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронка ВФ-1-40-ПОР 16-ХС по ГОСТ 25336.

Воронка 71 по ГОСТ 19908.

Стакан ВН-50, ВН-200 по ГОСТ 19908.

pH-метр по нормативному документу [8)

Цилиндр мерный 2-50, 2-100 по ГОСТ 1770.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 40 %.

Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации с ('/, H.SOJ =■ 5 моль/дм1.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, с массовой долей 95 %.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, р;юткор молярной концентрации с (HCI) - 0,1 моль/дм1.

Витамин В, по нормативному документу 112].

Фенолфталеин по нормативному документу [6|.

Триметиламин по нормативному документу |2].

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Примечания

1    Допускается использиьание другой аппаратуры, реактивов и материалов с тех ничсскими и метраюнпсскими характеристиками не ниже уклаанимх

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

22

Страница 26

ГОСТ Р 50929-96

9.1.2 Подготовка к испытанию

9.1.2.1    Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный атюент готовят смсшиванисм уксусной кислоты, дистиллированной воды и триметиламина в объемном соотношении 3:95:2. Для этого в мерную колбу вместимостью 500 см' вносят пипеткой 15 см3 концентрированной уксусной кислоты, затем цилиндром вносят 100 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Добавляют 10 см3 триметиламина, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Приготовленный раствор фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 16 и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный элюент хранят не более 1 мес в холодильнике.

9.1.2.2    Подготовка хроматографической колонки

Через колонку пропускают элюент в количестве 20—30 свободных объемов колонки, т. е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкцм’/мин, а затем 100 мкдм’/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После стабилизации колонки проводят се насыщение витамином В<. Для этого выполняют 7—10 анализов более концентрированного градуировочного раствора витамина В}. Насыщение колонки прекращают, когда расхождение между последовательными определениями не превышает 3,0 %.

9.1.2.3    Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации с (Уj H,S04) * 5 моль/дм3-

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30—40 см3 дистиллированной воды и добавляют 14,2 см3 концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают и добавляют сше 35—40 см1 дис тнллированной воды. Когда раствор остынет до кохшатной температуры, осторожно доводит обьем дистиллированной водой до метки.

9.1.2.4    Построение градуировочного графика

В мерную колбу вместимостью 100 см} помешают 0,1 г витамина Bt и приливают 70 см' раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) — 0,1 моль/дм5. Колбу помещают в водяную баню и нагревают в течение 10 мин при температуре 75 'С. Затем охлаждактг и содержимое количественно переносят в химический стакан нмсстимос-гью 200 см3. Добавляют 1—2 капли I %-ного спиртового раствора фенолфталеина, раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40 % до

2)

Страница 27

ГОСТ Р 50929-96

образования розового окрашивания, избыток шслочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации с(‘/, HjSO^ = = 5 моль/дм5. Раствор фильтруют через бумажный фильтр с синей полосой d мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Получают основной стандартный раствор витамина В} массовой концентрации 1 мг/см3. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 0,4; 0,8; 1,0, 1,5; 2,0; 3,0 мг витамина В5 в 50 см3. Для этого соответственно 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 см3 основного раствора помещают в 6 мерных колб вместимостью 50 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

хроматографическая колонка 2 х 120 мм;

сорбент — Силасорб С 18, Силасорб SPH С 18, Сепарон С 18;

трехкомпонентный элюент на основе уксусной кислоты;

объем пробы — 6 мкдм5;

длина волны — 260 нм,

скорость подачи элюента — 80—100 мкдм’/ мин; постоянная времени — 0,2 с.

Удерживаемый объем пика витамина В5 — 560—580 мкдм3 (может меняться в зависимости от длины колонки и плотности ее заполнения. Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пик:» колонку промывают, прокачивая через нее 150—200 мкдм3 элюента до выхода на нулевую линию.

Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности с. о. п.) откладывают по оси ординат градуировочного график;», а по оси абсцисс — количество витамина в 50 см3 раствора.

Градуировочный график строят так же, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в единицах длины (миллиметрах).

Построение п>адуировочного графика можно заменить расчетом ко-эффиинентов наклона К, мг/с. о. п., по формуле

П

I «,

К= i-=J—,

п

где АГ — коэффициент наклона градуировочного графика для /-го градуировочного раствора, мг/с. о. п.;

Страница 28

ГОСТ Р 50919 -%

it — количество точек, по которым строится градуировочный график.

Значение коэффициента наклона градуировочного графика К, мг/с. о. п. или мг/мм, вычисляют по формуле

где С,— содержание витамина в соответствующем j'-m градуировочном растворе,

Л, — высота »-го хроматографического пика, е. о. п. или мм.

9.1.2.5 Проверка градуировочного графика

Градуировочный график контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1—2 рабочих раствора витамина следует анализировать, как указано в 9.1.2.4.

Отклонение полученных результатов от измеренных в момент построения градуировочного графика а, %, определяют по формуле

Л1

где Л,, Лг — высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, с. о. п. или мм.

При отклонении результатов более чем на 5 % строят новый градуировочный график.

Градуировочные растворы хранят в холодильнике в стеклянной посуде с притертой пробкой. Срок годности растворов не более I мес.

9.1.3 Проведение кислотного гидролиза

Навеску премикса массой 1—5 г, взятую с погрешностью не более 0,001 г, помешают в коническую колбу вместимостью 100 см’ и добавляют 3 см5 раствора солиной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,1 МОЛЬ/ДМ1. Колбу нагревают на водяной бане при температуре (75±1) ‘С в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см3. Добавляют 1—2 капли спиртового раствора фенолфталеина с массовой

is

Страница 29

ГОСТ Р SW29-W

долей 1 % и раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40 % до образования розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации с(1/, HjSOt) = 5 моль/дм1. После Ю-минугного выдерживания раствор фильтруют через обездоленный фильтр с синей лентой в мерную колбу вместимостью 50 см5 и доводят объем до метки дистиллированной водой.

9.1.4    Хроматографирование

Полученный экстракт хроматографируют, как в 9.1.2.4. Для определения содержания витамина В( в премиксах проводят 2 параллельных анализа, начиная со взятия навески. Каждый экстракт хроматографируют два раза, находят среднеарифметическое значение высоты пиков в единицах оптической плотности или миллиметрах и по градуировочному графику определяют содержание витамина в миллиграммах, приложение В, рисунок В.1.

9.1.5    Обработка результатов испытания

Содержание витамина В5 X в прсмиксс. мг/кг, вычисляют по формуле

где С — содержание витамина, найденное по градуировочному графику, мг; т — навеска прсмикса, г.

При использовании коэффициента наклона К вместо градуировочного графика содержание витамина В* в п ре миксе, мт/г, вычисляют по формуле

КА

X =-,

т

где К — коэффициент наклона градуировочного графика, мг/с. о. п.; А — высота хроматографического пика, е. о. п.; т — масса навески прсмикса, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

26

Страница 30

ГОСТ Р S0929-96

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р = 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р= 0,95 расхождения не должны превышать 15 %.

9.2 Определение витамина В, с применением жидкостных хроматографов импортного производства

Сущность метода заключается в экстракции витамина Bs из навески премикса раствором соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) а 0,01 моль/дм3 и хроматографическом анализе его содержания в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа со спектрофотометр ическим детектором.

Метод применим в диапазоне содержания витамина Вs от 0,2 до 4 г/кг премикса.

9.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором при спектральном диапазоне от 200 до 300 нм. Возможно использование детектора при постоянной длине волны 254 нм.

Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150— 200 мм и диаметром 2,6—4,6 мм с числом теоретических тарелок не менее 3000 на 1 м, заполненная сорбентом «Силосорб С-18» или «Се-парой С-18* с зернением 7,5 мкм.

Весы лабораторные не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в минуту. Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Иономер ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-63-07.

Пипетка 4-1(2)-1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.

Ацетонитрил по нормативному документу [7J Тетрабугиламмоний хлористый по нормативному документу 114] Тстрабугиламмоний бромистый по нормативному до куме irry (13] Витамин В4 по нормативному документу [12|

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации с (HCI) = 0,01 моль/дм1.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

27

Страница 31

ГОСТ Р 50919-9€

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Примечания

1    Допускается использование другой аппаратуры, рсакгавов и материалов с техническими к метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2    Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

9 2.2 Подготовка к испытанию

9-2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии

В колбе вместимостью 1дм5 смешивают 120 см3 ацетонитрила с 880 см} дистиллированной воды, добавляют (210,002) г хлористого (бромистого) тетрабуткпаммония. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр для удаления механических примесей и помешают в стеклянный сосуд с притертой пробкой.

Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.

9-2.2.2 Приготовление раствора экстрагента

Для экстракции витамина В; используют раствор соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) = 0,01 моль/дм', который готовят прибавлением к 1 дм3 дистиллированной воды 0,6 см’ концентрированной 37 %-ной соляной кислоты. Значение pH должно бьггь 2±0,2.

9.2.2.3    Приготовление основного стандартного раствора витамина В,

Навеску витамина В, массой 0,1 г взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см' и доводят до метки этой же водой. Полученный раствор содержит 1 мг витамина Bs в 1 см’.

Раствор хранят в холодильнике до полного использования.

9.2.2.4    Приготовление рабочего стандартного раствора витамина В^

Рабочий стандартный раствор никотиновой кислоты готовят в зависимости от предполагаемого содержания се в премиксе по таблице 1. Рабочий стандартный раствор готовят в день проведения контроля.

Таблица 1

Концентрация рабочего

CIMISiplMCCU piLOOp*.

угла»’

Кеявжестю основного стандартного раствора, необходимее 1« си*

Вместимость мерной гяч ригсхния. см'

И р« ап оа ага с и •>« i ойфанк мпамкгл В,

» ) К! t^CWKIKl. г .

0.04

2

50

2-3

0,02

1

50

.-2 1

1

0,01

1

too

Менее 1

28

Страница 32

ГОСТ Р 50929-96

9-2.3 Проведение испытания

9.2.3.1 Экстрагирование

Навеску прсмикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помешают в мерную колбу вместимостью 50 см1, приливают V, объема раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НС1) а 0,01 моль/дм’, перемешивают и оставляют стоять в течение 20 мин, несколько раз при этом перемешивая, после чего доводят до метки тем жс раствором. Полученную суспензию перемешивают и часть отливают в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин. Полученный центрифугат используют для хроматографического анализа.

9 2.3.2 Хроматографирование

Хроматографирование осуществляют при следующих условиях, колонка, заполненная сорбентом, подвижная фаза — элюент по 9.2.2.1, рабочая длина волны спсктрофотомстр1псского детектора 262 нм (или 254 нм), скорость элюирования — 1,5 см'/мин, температура — комнатная. При данных условиях проводят 3—5 загрузок стандартного раствора по 5 мкдм\ отмечая время выхода пика витамина Bs в секундах и высоту ника относительно базисной линии. При достижении постоянной высоты можно приступать к контролю. Загружают по 3 раза в одинаковых условиях 5—10 мкдм5 стандартного раствора витамина массовой концентрации 0.01—0,04 мг в 1 см1 в зависимости от состава премикса (10 мкам'' раствора массовой концентрации 0,01—0,02 мг/см' или 5 мкам-' раствора массовой концентрации 0,04 мг/см5) и экстракт премикса после цен трифугирования. По времени выхода определяют пик витамина В4 в экстракте и измеряют высоту пика, как расстояние от вершины пика до линии проведенной в основании пика (приложение Г рисунок Г.1). Измеряя и сравнивая высоты пиков на хроматограммах, вычисляют содержание витамина В, в премиксах.

9.2.3.3 Обработка результатов испытания

Содержание витамина В,Хъ прсмиксс, г/кг, вычисляют по формуле

где ст — концентрация витамина В, в рабочем стандартном растворе.

мг/см1;

29

Страница 33

ГОСТ Р 59929--96

ht — высота пика витамина В, на хроматограмме испытуемого раствора, мм;

V — общий объем экстракта, см3;

— высота пика витамина В, на хроматограмме рабочего стандартного раствора, мм;

т — масса навески, г.

Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности Р=* 0,95 не должны быть более 10 % относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности Р = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.

10 ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

10.1    Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.

10.2    Необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с атектропрнборами.

10

Страница 34

ГОСТ Р 50929-96

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ИЗ ПРЕМИКСА

Рисунок А. 1 — Хромагго грамма ■««.•факта из прсмикса

31

Страница 35

ГОСТ Р 50929 <Н>

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочно*)

ХРОМАТОГРАММА СМЕСИ ВИТАМИНОВ ВИВ.

Рисунок Б.1 — Хромагограммл смеси витаминов В, и В,

)2

Страница 36

ГОСТ Р М»2¥-»6

ПРИЛОЖЕНИЕ В (справочное)

ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ВИТАМИНА В, ИЗ ПРЕМИКСА

Время, мим Т

Рмсунок В.1 — Хроматограмма экстракта витамин* В, кз пр«миксд

33

Страница 37

ГОСТ Р 59919—9€

ПРИЛОЖЕНИЕ Г (справочное)

ХРОМАТОГРАММЫ РАСТВОРОВ ВИТАМИНА В.

Время, мин Т б

Рисунок Г.1 — Хроматограммы: а — стандартного растворе; 6 — экстраета иа Премнкса

Страница 38

ГОСТ Р 50929-9*

ПРИЛОЖЕНИЕ Д (и ы форм ацио мко*)

БИБЛИОГРАФИЯ

(I)    ТУ 6—09—4U2 -87 2 пропана! (изопропиловый спирт) химически чистый 12] ТУ б—09—И—2021—87 Гримстилямин

(3]    ТУ 6—09—1678—86 Фильтры обезэаленныв (белая, красная, синяя ленты)

(4)    МРГУ 6—09—2437—65 Триэткламин

|5J ТУ 6—09—08—944—S3 Рейнеют аммония

(6] ТУ 6-09—53-60—87 фенолфталеин (индикатор)

|71 ТУ 6—09—06—1092—83 Ацетонитрил. Технические условия [8| ТУ 25-7416-0171-88 рН-метр тпя рН-155 |9) ГФ СССР-Х ст. 149 Хкнинсульфат |10| ГФ СССР—X    ст.    147 Хинингидрохлорил

(II]    ГФ СССР—X    ст.    S85 Рибофлавин (витамин    В.»

112| ГФ СССР—X    ст.    19 Никотиновая кислота    (витамин В,)

(13] МРТУ 6—09—105—62 Торабутиламмоний бромистый

114]    МРТУ 6—09—5351—68 Тетрабугиламмоний хлористый

115]    ТУ 25-1894.003-90 Секундомер СОС I1P-2A-3-000

116]    ГФ СССР—X    ст.    673 Тиамкнбромка

|17| ГФ СССР—X    ст.    674 Тиаминхлорид

118) ГФ X ст. 42-1997-93 Холинхторид

35

Страница 39

ГОСТ Р 509»-*6

УДК 636.085.3:006.354 ОКС 65.120.19    С19    ОКСТУ 9209

Ключевые слова: премикс, метод, контроль, витамины, экстракция, флуоресценция, хроматограмма

Редактор Г Я Шашина Технический редактор Н. С. Гришанова Корректор Е. Ю. Митрофанова Компьютерная иерсткд В. И Матюшепко

И-a пии М 011007 in 10СЯ*5 Сини а тбф 15.08%. Паышаио i псч*л 1110 96 Уел. IL й. г.а УЧ. мм t 2.05. Тирц ИИ>ю. С И01.1*х 12М.

ИПК HvurutcTiu етшхфти*. 107076, Мжга, КспаоопыЯ в«р, 14. Нибрши • КацаиявЙ luuii^M спндцт» и» ПЭВМ.

Кдлужсаи гжяо!&и}шл стмицяи*. jя. М«ежш aiP .404015!