Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

20 страниц

396.00 ₽

Купить официальный бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.

Стандарт допускается применять для подготовки стандартных проб при калибровке механизированных и автоматизированных способов подсчета клеток

Отменён
Действие завершено 30.06.2017

Показать даты введения Admin

Страница 1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИ И

ГОСТ Р исо 13366-1 — 2010


МОЛОКО ПОДСЧЕТ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Часть 1

Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)

ISO 13366-1:2008 Milk — Enumeration of somatic cells —

Part 1: Microscopic method (Reference method)

(IDT)

Издание официальное

|^jj] СТ1НД15^*0,

Страница 2

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. Np 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта. указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Техническим комитетом стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. Np 686-ст

4    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13366-1:2008 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Мотод с применением микроскопа (Контрольный метод)» [ISO 13366-1:2008 «Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference method)»].

В настоящем стандарте исключен пункт «Протокол испытания» в связи с различиями форм записи результатов испытаний в различных лабораториях

5    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Националы<ые стандарты». В случав перешотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация. уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официалыюм сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартимформ. 2011

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

II

Страница 3

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

Содержание

1    Область применения................................................................................1

2    Термины и определения............................................................................1

3    Сущность метода..................................................................................1

4    Реактивы............................................................................................1

5    Аппаратура и материалы.......

6    Отбор проб..............

7    Приготовление анализируемой пробы

8    Проведение определения......

9    Обработка результатов....................................................................8

10    Прецизионность....................................................................................10

Приложение А (справочное) Результаты межлабораторных испытаний................................11

Приложение В (справочное) Окрашивание козьего молока............................................12

Приложение С (справочное) Распределение Пуассона................................................13

Библиография........................................................................................14

III

Страница 5

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО

ПОДСЧЕТ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Часть 1 Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)

Milk. Enumeration of somatic cells.

Part 1. Microscopic method (Reference method)

Дата введения — 2012 — 01 — 01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.

Стандарт допускается применять для подготовки стандартных проб при калибровке механизированных и автоматизированных способов подсчета клеток.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Использование настоящего стандарта может быть сопряжено с применением опасных материалов, операций и оборудования. Настоящий стандарт не имеет целью решение всех вопросов безопасности, обусловленных его применением. На пользователя настоящего стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности и охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до использования.

2    Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1    соматические клетки (somatic cells): Клетки с ядрами, то есть все лейкоциты и эпителиальные клетки, определяемые в соответствии с процедурой, приведенной в настоящем стандарте.

3    Сущность метода

Анализируемую пробу молока распределяют на предметном стекле и получают мазок, который высушивают. После высушивания мазок окрашивают. Далее окрашенные клетки подсчитывают с использованием микроскопа. Количество подсчитанных клеток на четко установленной площади умножают на рабочий коэффициент с целью определения количества клеток на миллилитр.

4    Реактивы

Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет друтих указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты.

4.1    Растворы красителой

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Тотрахлорэтан является ядовитым вещоством. Бромистый этидий является мутагенным веществом. В случае проливания следует предпринять надлежащие действия по обезвреживанию. Подготовка и применение растворов красителей должны осуществляться под вытяжным шкафом с использованием защитного оборудования.

Издание официальное

1

Страница 6

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

4.1.1    Модифицированный окрашивающий раствор

4.1.1.1    Состав

Этанол. 95 % (по объему), см3

54,0

Тетрахлорэтан31, см3

40.0

Метиленовый синий, г

0.6

Кислота уксусная, безводная, см3

6.0

а1 Допускается применять ксилол в том же объеме, какой указан для тет-рахлорэтана.

4.1.1.2    Приготовление модифицированного окрашивающего раствора

Смешивают этанол и тетрахлорэтан и закрывают сосуд. Смесь нагревают на водяной бане (5.1) при температуре 65 °С. Добавляют метиленовый синий под вытяжным шкафом и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до температуры 4 еС.

Затем добавляют безводную уксусную кислоту и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр (5.2) и помещают в герметичный сосуд на хранение.

Перед использованием окрашивающий раствор снова фильтруют.

4.1.2    Окрашивающий раствор бромистого этидия

4.1.2.1    Основной окрашивающий раствор

4.1.2.1.1    Состав

Бромистый этидий. г

0,25

Деминерализованная вода, см3

100

4.1.2.1.2    Приготовление основного окрашивающего раствора

Бромистый этидий растворяют в деминерализованной воде, предварительно нагретой до 40 °С. Раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до 100 см3 деминерализованной водой.

Основной окрашивающий раствор бромистого этидия хранят в темпом месте при температуре (2 ± 2) °С не более 2 мес.

4.1.2.2    Буферный раствор

4.1.2.2.1 Состав

Калия гидрофталат, г

0,51

Калия гидроксид, г

0,162

Вода деминерализованная, см3

100

4.1.2.2.2 Приготовление буферного раствора

Растворяют по отдельности калия гидрофталат и калия гидроксид в деминерализованной воде. Буферный раствор хранят в темном месте при температуре (2 ± 2) °С не более 2 мес.

4.1.2.3 Рабочий окрашивающий раствор бромистого этидия

4.1.2.3.1 Компоненты

Основной окрашивающий раствор бромистого этидия^

(4.1.2.1), см3

2

Буферный раствор (4.1.2.2), см3

8

Тритон Х-100, см3

0,1

Вода деминерализованная, см3

90

а) Высокая температура может привести к снижению окрашивающей способности бромистого этидия.

2

Страница 7

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

4.1.2.3.2    Приготовление рабочего окрашивающего раствора бромистого этидия Последовательно добавляют основной окрашивающий раствор бромистого этидия, буферный раствор

и Тритон Х-100 к деминерализованной воде и тщательно перемешивают.

Свежий рабочий окрашивающий раствор бромистого этцдия готовят непосредственно перед использованием.

4.2    Фосфатный буфорный раствор (PBS)

4.2.1 Компоненты

NaCI. г

8

KCI, г

0,2

Na2HP04гО. г

1.15

КН2Р04, г

0.2

Вода деминерализованная, см*

1 000

4.2.2 Приготовление фосфатного буферного раствора (PBS)

Соли растворяют в деминерализованной воде. Доводят объем до 10ОО см3 оставшимся количеством деминерализованной воды.

Устанавливают pH на уровне 7,2 ± 0.1.

Примечание — Допускается использовать готовый фосфатный буферный раствор с pH = 7,2.

5    Аппаратура и материалы

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, нижеприведенное.

5.1    Бани водяные, работающие при температуре (40 ± 2) °С, (50 ± 2) °С и (65 ± 2) °С.

5.2    Фильтр, устойчивый к используемым растворителям, с диаметром пор 10—12 мкм.

5.3    Микроскоп, имеющий увеличение 500х — 1000*. Допускается использовать масляно-иммерсионные объективы.

При использовании бромистого этидия микроскоп должен иметь флуоресцентное оборудование.

5.4    Микрошприц, для дозирования установленного объема молока 0.01 см3, с максимальным допуском 2 %.

5.5    Микрометр

5.6    Стекла предметные, с предварительно нанесенными очерченными контурами (прямоугопьным или круговым), ппощадью 1 см2 ± 5 % (95 —105 мм2), или стандартное предметное стекло 20 х 5 мм или имеющее диаметр 11.28 мм.

5.6.1    Формы предметных стекол

При использовании предметного стекла прямоугольной формы верхняя и нижняя внутренняя ширина, с одной стороны, и левая и правая внутренняя высота, с другой стороны, не допжны отпичаться бопее чем на 0.2 мм.

При использовании предметных стекол круглой формы вертикальный и горизонтальный внутренние диаметры не должны отличаться более чем на 0.2 мм.

6    Отбор проб

В лабораторию доставляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена ипи модифицирована при транспортировании или хранении.

Отбор проб не является частью метода, устанавливаемого в настоящем стандарте.

Отбор проб —по [1).

7    Приготовление анализируемой пробы

7.1    Хранение

До проведения определения или химического консервирования анализируемые пробы хранят при температуре (4 ± 2) еС.

Опредепение проводят в течение 6 ч после отбора проб.

Страница 8

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

В случае болоо длительного хранения в пробы добавляют химические консерванты, такие как борная кислота, бронолол или дихромат калия. Массовая концентрация борной кислоты в анализируемой пробе не должна превышать 0.6 г на 100 см3. Массовая концентрация бронопола в анализируемой пробе не должна превышать 0.05 г на 100 см3. Массовая концентрация дихромата калия в анализируемой пробе не должна превышать 0.1 г на 100 см3.

Консервированные пробы хранят при температуре (4 ± 2) °С не более 6 дней.

Рекомендуется ограничить использование дихромата калия в случае проб, для которых предусмотрен только длительный срок хранения.

7.2 Приготовление пробы

Анализируемую пробу молока нагревают (см. 7.1) на водяной бане (5.1) при температуре 40 °С. постоянно перемешивая. Охлаждают пробу до температуры 20 “С.

Разбавляют анализируемую пробу фосфатно-буферным раствором (4.2) до получения около 500 000 соматических клеток/см3 для каждой разбавленной анализируемой пробы.

где d — коэффициент разбавления для получения надлежащего количества соматических клеток в анализируемой пробе, примерно 500 000 клеток/см3:

V, — объем, см3, анализируемой пробы;

Vb —объем, см3, буферного раствора, используемого для разбавления анализируемой пробы.

Записывают надлежащий коэффициент разбавления, d, объем анализируемой пробы Vs, и объем буферного раствора Vb, используемый для получения нужного разбавления.

8 Проведение определения

Для каждой анализируемой пробы приготовляют, как минимум, два мазка (см. 8.1) и отбирают лучший из них (например, мазок, не поврежденный в процессе окрашивания). Погружают предметные стекла (5.6) в этанол (95 % по объему). Стерилизуют пламенем и охлаждают.

8.1    Приготовление мазка и окрашивания

Для приготовления мазка и окрашивания следуют рекомендациям, приведенным в 8.1.1 или 8.1.2.

Примечание — Окрашивание в случав козьего молока описано в приложении В.

8.1.1    Приготовление мазка и окрашивания с использованием окрашивающего раствора

Используя микрошприц (5.4), отбирают 0.01 см3 анализируемой пробы (при необходимости разбавленной) (см. 7.2). Микрошприц промывают анализируемой пробой. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала с анализируемой пробой.

Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 (5.6). Используя иглу, равномерно распределяют анализируемую пробу на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь. прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.

Высушенный на предметном стекле мазок погружают в модифицированный окрашивающий раствор (4.1.1) в течение не менее 15 мин. Высушивают мазок при комнатной температуре.

Затем осторожно вносят мазок под водопроводную воду до полного смыва всех излишков красителя. Высушивают вновь и хранят в условиях защиты от пыли.

Срок хранения предметных стекол с мазками — не более 12 мес.

8.1.2    Окрашивание с использованием окрашивающего раствора бромистого этидия и приготовление мазка

Смешивают 1 см3 приготовленной анализируемой пробы (см. 7.2) с 1 см3 рабочего окрашивающего раствора бромистого этвдия (4.1.2.3) в пробирке. Смесь хранят в защищенном от света месте. Нагревают пробирку на водяной бане (5.1) при температуре 50 °С в течение 3 мин. Охлаждают до комнатной температуры.

Используя микрошприц (5.4). отбирают 0,01 см3 смеси. Микрошприц промывают смесью. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала со смесью.

Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 (5.6). Используя иглу, равномерно распределяют смесь на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегаю-4

Страница 9

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

щая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.

8.2 Определение

8.2.1 Оптимизация считывания

Используя микроскоп (5.3), подсчитывают ядра клеток в полученном мазке (8.1.1 или 8.1.2) в полях микроскопа, целиком заполненных только мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (от 500“ до 10ОО '). чтобы в каждом попе максимальное количество клеток в среднем было 20.

Клетки имеют окрашенное ядро. Размер клетки — не менее 8 мкм. Не следует подсчитывать клетки с размером не более 4 мкм (см. рисунок 1). Фрагменты клеток подсчитывают в окончательном результате, если видно более 50 % ядерного материала. Кластеры клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены. См. рисунки 2 и 3.

Лимфоцит 5—10 мкм

Эпителиальная клетка

10—14 мкм

Макрофаг 8—30 мкм

Полиморфоядерный нейт-рсфил

Связь между цитоплазмой и ядром прочная. Фагоцитоз. презентация антигена. секреция хемоат-трактантое.

10—14 мкм

90 % в случае острого мастита

60 % в случав хронического

Связь между цитоплазмой и ядром незначительная. Фагоцитоз. Первая линия защиты от мастита.

Связь между цитоплазмой и ядром незначительная. Т-клетка-хел-пер. Т-клетка-супрессор. В-клетка с интенсивно окрашенным ядром.

Круглов ддро. Цитоплазма окрашена слабо.


Рисунок 1 — Примеры клеток

л* Ш ’ jf 4 •* ._* ч>а*

Длина клетки: L1 = 9.79 мкм и L2 = 2.77 мкм Рисунок 2 — Примеры клеток сборного коровьего молока (увеличение 1000")



fr0


5

Страница 10

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

(увеличение 1000х)

Длина клетки: L22 = 9.08 мкм; L23 = 8.27 мкм; L2A = 4,95 мкм; L25 = 7.39 мкм; L26 = 6.37 мкм и L27 = 3,58 мкм.

Рисунок 3 — Примеры клеток сборного коровьего молока (увеличение 500х и 1000*)

На примере кластера, представленного на рисунке 3. следует подсчитать 5 клеток. L27 опущен из-за своего диаметра, который имеет размеры не более 4 мкм.

Примечание — Подготовка и профессиональное мастерство аналитика являются основными решающими факторами успешного использования метода. Частое использование данного метода и участив в межпабо-раторных испытаниях играют существенную роль в плане обеспечения надлежащего уровня подсчета.

Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона (см. приложение С). Минимальное количество клеток (/V). подсчитываемых с учетом требуемого уровня подсчета клеток, с целью достижения указанного коэффициента вариации, приведено в таблице 1.

Для правильного выполнения метода важно, чтобы указанное минимальное количество клеток было подсчитано. Подсчитываемые поля и полосы выбирают таким образом, чтобы получить представительный подсчет для всего мазка.

Таблица 1 — Минимальное количество клеток (W)

Концентрация клеток (х 1000 клето^см3)

Коэффициент вариации. %

Минимальное количество клеток (N)

< 150

10

100

150—250

7

200

250—400

6

300

2 400

5

400

8.2.2 Подсчет в последовательных попях микроскопа

Подсчитывают ядра в последовательных попях. в вертикальных попосах на равномерно размещенных попях (см. рисунок 4 и таблицу 1).

а) Начинают приблизительно на расстоянии dL от левой стороны. В случае круглой формы начинают на достаточном расстоянии dL от левой стороны горизонтального диаметра таким образом, чтобы обеспечить подсчет минимум 5 попей от верхней части попосы. Расстояние dL 0,5 мм подходит для прямоугольной и круглой формы.

6

Страница 11

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

b)    Помещают верхний или нижний фай окружности поля тангенциально по отношению к внутренней верхней или нижней границе шаблона (шаблон не должен быть видимым в поле). В случае наличия непокрытой поверхности вблизи границы шаблона корректируют поле по границе мазка.

c)    После подсчета первого поля объектив передвигают на установленное расстояние dH вниз или вверх, до следующей градации в направлении нижнего или верхнего края и подсчитывают новое поле. Расстояние dH = 1 мм считается пригодным.

d)    С последнего подсчитанного поля повторяют операцию с), вплоть до достижения противопопожной стороны (верхней ипи нижней) попосы. Выбирают один из двух приведенных вариантов.

-    Вариант 1: последнее поле не подлежит подсчету.

-    Вариант 2: еспи появляется верхняя или нижняя граница и она заполняет менее половины поверхности поля, подсчет производится после передвижения объектива до попного исчезновения границы с поля, которое в этом случае только покрывает мазок.

e)    Затем объектив передвигают вправо на расстояние dw (например. dw = 1,5 мм или dw = 2 мм в зависимости от необходимого числа полей) и начинают работать с новой полосой в противопопожном направлении (вверх или вниз).

f)    Операции Ь)—е) повторяют до достижения правой стороны шаблона.

д) В случае недостаточного количества подсчитываемых полей (см. таблицу 1) можно подсчитать дополнитепьные поля. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации расстояний при поэтапном передвижении) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полей, которое является репрезентативным для всего мазка.

h) Результат рассчитывают в соответствии с указаниями 9.1 для прямоугольной формы или 9.3 для круглой формы.

Примечание — В случав прямоугольной формы возможно расположение 5 полей на 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос, расположенных на расстоянии 2 мм, что позволяет подсчитать 50 полей. Приблизительно такое же количество полей получается при круглой форме при использовании тех же расстояний. Расстояния между сдвигами (пространства) измеряются от той же зоны полей с использованием прибора корректировки (выравнивание верхнего или нижнего края) таким образом, чтобы они включали в себя диаметр поля.

8.2.3 Подсчет в прямоугольной форме по полосам

Ядра подсчитывают в расположенных с равными интервалами вертикальных поносах (см. рисунок 5 и таблицу 1):

a)    Начинают прибпизительно на расстоянии dL от левой стороны. Расстояние dL 0,5 мм считается пригодным.

b)    Начинают подсчитывать от верхней или нижней границы прямоугопьной площади. Помещают границу поверхности в центр зрения микроскопа. После подсчета всех клеток объектив передвигают в направлении, противопопожном границе, и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе, вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток.

c)    Затем объектив передвигают вправо на расстояние dw и начинают подсчет новой попосы (например. dw = 3—4 мм в зависимости от необходимого чиспа полей для репрезентативного подсчета всего мазка).

Операции Ь)—с) повторяют до достижения правой стороны шаблона.

В случае недостаточного количества подсчитываемых попос (см. таблицу 1) можно подсчитать дополнительные полосы. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации dw) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полос, которое является репрезентативным для всего мазка.

Результат подсчитывают, как указано в 9.2.

7

Страница 12

Пояснение

dw= 1,5 мм dH = 1 мм dL - 0,5 мм d ■ 0.5 мм dwr2 = 0,75 мм

Рисунок 4 — Вертикальные полосы, образованные равноудаленными полями в случав круглой

или прямоугольной формы

Дополнительные полосы, при необходимости

ГОСТ Р ИС0 13366-1—201 о


ъ

Рисунок 5 — Равноудаленные вертикальные полосы

9 Обработка результатов

9.1 Подсчет для прямоугольной формы в последовательных попях

Проверяют контрольные значения 20.0 и 5.0 мм для длины и ширины W5 мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

8

Страница 13

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

Рассчитывают общую концентрацию с клеток, используя следующее уравнение:

с    х    L,    х    N,

л х (%-J х N. х Vm

(2)

или

с * fwx

(3)

с постоянным рабочим коэффициентом /w

W,

(4)

я X X Vm

где с—общая концентрация, выраженная в количестве клеток на миллилитр;

Wi — ширина мазка, мм;

Z.J — длина мазка, мм;

N, — общее количество подсчитанных клеток, шт.;

Dt — диаметр попя микроскопа, мм;

N, — количество полностью подсчитанных попей, шт.;

Vm — объем, см3, испытуемой пробы мазка (см. 8.1.1 или 8.1.2) [Vm. равный 0,01 см3, в случае использования для окрашивания (8.1.1) модифицированного рабочего окрашивающего раствора; Vm, равный 0,005 см3, в случае использования для окрашивания (8.1.2) окрашивающего раствора бромистого этидия].

d — коэффициент разбавления, используемый в 7.2 (если разбавление не требуется, d= 1; при разбавлении 1:1 d= 0,5).

9.2 Подсчет для прямоугольной формы в полосах

Проверяют контрольные значения 20.0 и 5.0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию с клеток, используя следующее уравнение:

(5)

игм

(6)

с постоянным рабочим коэффициентом fw

(7)

где Nb - количество полностью подсчитанных полос.

Остальные обозначения приведены в 9.1.

9.3 Подсчет для круглой формы в последовательных полях

Проверяют диаметр мазка, равный 11.28 мм. используя градуировку и прибор корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию с клеток, используя следующее уравнение:

£13. xi

(8)

DifX Nf xVm d

игм

О)

9

Страница 14

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

с постоянным рабочим коэффициентом fm

(Ю)

где Dc — диаметр мазка, мм.

Остальные обозначения приведены в 9.1.

9.4 Выражение результатов

401 586 клеток/см3 выражают как

Результаты испытаний округляют до тысячи клеток (например.

402 ООО клеток/см3).

10 Прецизионность

Точность настоящего метода установлена в соответствии с [2] и [3]. Значения, полученные для повторяемости и воспроизводимости, выражены при уровне вероятности 95 %.

10.1 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5 % случаев превышать значения, приведенные в таблице 2.

Таблица 2 — Значения повторяемости

Концентрация >.петок (X 1 000 клето*/см3)

sr

(х 1 000 кле ток/см *)

г

(X t 000 uwsrob’cM3)

245

38

107

455

43

121

679

69

192

791

110

308

10.2 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5 % случаев превышать значения, приведенные в таблице 3.

Таблица 3 — Значения воспроизводимости

Концентрация клеток {XI 000 «лето*/см3)

5я

<Х 1 000 клеток/см3)

Я

(х 1 000 теток/см3)

245

41

114

455

62

174

679

78

218

791

110

308

Ю

Страница 15

ГОСТ Р ИС013366-1—201 о

Приложение А (справочное)

Результаты межлабораторных испытаний

А.1 Общие положения

В октябре 2005 г. были проведены совместные международные исследования коровьего молока, в которых приняли участие восемнадцать лабораторий и тринадцать стран. Испытание включало 8 гроб на четырех уровнях клеток/мл и включало 16 дублирующих проб без указания источника поступления. Среднее значение каждого уровня соответственно составляет:

-    Уровень 1, пробы А и В: 245 ООО клегок/см3;

-    Уровень 2. пробы С и D: 455 ООО клеток/см3;

-    Уровень 3, пробы Е и F: 679 ООО клеток/см3;

-    Уровень 4. пробы G и Н: 791 ООО клеток/см3.

Испытание было организовано A.I.A. Laboratorio Standard Latte. Maccarese-Roma (Италия), которая также провела статистический анализ согласно [2] и [3] с целью предоставления прецизионных данных, приведенных в таблице А.1.

Таблица А.1 — Результаты межлабораторных испытаний

Наименование показателя

Уровень

1

2

3

4

Число участников после исключения лабораторий с рез

ко отклоняющимися результатами

24

23

24

24

Среднее значение {х 1000 клеток/см3)

245

455

679

791

Среднее квадратичное отклонение повторяемости s,

(х 1000 клеток/см3)

38

43

69

110

Коэффициент вариации повторяемости (%)

169

9

10

14

Предел повторяемости г (2.8s,) (х 1000 клетсж/см3)

107

121

192

308

Среднее квадратичное отклонение воспроизводимости

sR (х 1000 клеток/см3)

41

62

78

110

Коэффициент вариации воспроизводимости (%)

17

14

11

14

Предел воспроизводимости R (2,8sR) (х 1000 клеток/ал3)

114

174

218

308

11

Страница 16

ГОСТ Р ИС013366-1—201 о

Приложение В (справочное)

Окрашивание козьего молока

В.1 Окрашивающие растворы для козьего молока

В. 1.1 Фиксатор Карнуа В.1.1.1 Состав

Хлороформ

60 см3

Кислота уксусная безводная

20 см3

Этанол 100 %

120 см3

В.1.1.2 Приготовление

Последовательно добавляют хлороформ и безводную уксусную кислоту в этанол и тщательно перемешивают. В.1.2 Окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого

В. 1.2.1 Состав

Пиронин-Y

1.0 г

\4етиловый зеленый

0.56 г

Вода деминерализованная

196 см3

В. 1.2.2 Приготовление

Последовательно добавляют пиронин-Y и метиловый зеленый в сосуд с деминерализованной водой и тщательно перемешивают. Фильтруют через подходящий фильтр (5.2) и хранят в коричневой емкости. Перед использованием раствор фильтруют снова через подходящий фильтр (5.2).

В.2 Приготовление мазка

Работают с предметным стеклом, выполняя следующие этапы окрашивания:

1    Используют фиксатор Карнуа (В.1.1) в течение 5 мин.

2    Используют этанол в концентрации 50 % в течение 1 мин.

3    Используют этанол в концентрации 30 % в течение 1 мин.

4    Используют воду в течение 1 мин.

5    Используют окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого (В. 1.2) для окрашивания в течение 6 мин.

6    Кратковременно промывают н-бутиловым спиртом, затем ксилолом.

7    Предметные стекла хранят в условиях защиты от пыли не более 12 мес.

12

Страница 17

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

Приложение С (справочное)

Распределение Пуассона

Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона. Распределение Пуассона по формуле

M=V = s2.

где М — среднее значение, которое, в случае подсчета количества соматических клеток, представляет собой число подсчитанных частиц (клеток):

V — дисперсия; s — стандартное отклонение.

Коэффициент вариации (CV) будет равен

CV = JL х 100%. s

CU=100%

13

Страница 18

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

Библиография

Молоко и молочные продукты. Руководящие указания по подбору проб

[1]    ИСО 707:2008’

[2]    ИСО 5725-1:2002

[3]    ИСО 5725-2:2002

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1.

Основные положения

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

* Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе соответствующего ИСО.

Страница 19

ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010

УДК 637.11.001:006.354    ОКС 67.100.10    Н19    ОКСТУ 9209

Ключевые слова: молоко сырое, молоко химически консервированное, соматические клетки, микроскоп, мазки, ядро клетки, окрашивание мазков, поля просмотра, обработка результатов

15

Страница 20

Редактор М. Е. Никулина Технический редактор В. Н. Прусакова Корректор Е. Ю. Митрофанова Компьютерная верстка А. П. Финогеновой

Сдано о набор 26.09.2011. Подписано о печать 20.10.2011. Формат 60x84%. Бумага офсетная. Гарнитура Ариал Печать офсетная Уел. печ. л. 2.32. Уч.-изд. п. 1.55 Тираж 201 so. Зак. 1136.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» 123995 Москва. Гранатный пер.. 4.

WA'iv.goslinfo.nj    snfo@goslmto.ru

Набрана и отпечатана о Калужской типографии стандартов. 248021 Калуга, ул. Московская. 256.