Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1
 

103 страницы

Устанавливает общий перечень количественных методов обнаружения ГМО в пищевых продуктах с использованием ПЦР. Стандарт устанавливает общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с целью количественной оценки содержания ДНК из ГМО и для подтверждения идентичности амплифицированной последовательности ДНК. Стандарт распространяется на матрицы пищевых продуктов, но может быть применен также и для других матриц, например кормов, растений.

 Скачать PDF

Оглавление

Введение

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Термины и определения

4 Принцип метода

     4.1 Общие положения

     4.2 Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР

     4.3 Количественное определение продуктов ПЦР

5 Реактивы

6 Аппаратура и оборудование

7 Руководящие указания, касающиеся методики

     7.1 Общие положения

     7.2 Стабильность целевой последовательности

     7.3 Калибровка анализа

     7.4 Рассмотрение количественного определения

     7.5 Требования к обеспечению качества

8 Оценка

9 Выражение результата

10 Отчет об испытании

Приложение А (справочное) Методы специфического целевого таксона

     А.1 Метод специфического целевого таксона для определения абсолютного количественного содержания ДНК гена adh1 из кукурузы с использованием метода ПЦР в реальном времени

Приложение В (справочное) Методы скрининга

     В.1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания ДНК 35S-промотора сои линии GTS 40-3-2 с использованием метода ПЦР в реальном времени

Приложение С (справочное) Методы специфической конструкции

     С.1 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени (метод 1)

     С.2 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени (метод 2)

     С.3 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы Event176 с использованием ПЦР в реальном времени

     С.4 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-сои линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени

     С.5 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии MON 810 с использованием ПЦР в реальном времени

     С.6 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии Event176 с использованием ПЦР в реальном времени

     С.7 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии Вt1 с использованием ПЦР в реальном времени

     C.8 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии GA2I с использованием ПЦР в реальном времени

     C.9 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии Т25 с использованием ПЦР в реальном времени

Приложение D (справочное) Методы специфического события

     D.1 Метод специфического события для абсолютного и относительного количественного определения содержания кукурузы линии Bt11 с использованием ПЦР в реальном времени

     D.2 Метод специфического события для относительного количественного определения содержания ДНК-кукурузы линии MON810 с использованием ПЦР в реальном времени

Библиография

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам

 

103 страницы

Дата введения01.01.2011
Добавлен в базу01.01.2019
Актуализация01.01.2019

Организации:

11.11.2009УтвержденЕвразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации36
24.09.2010УтвержденГосстандарт Республики Беларусь58
ИзданБелГИСС2010 г.
РазработанБелГИСС

Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27
Стр. 28
стр. 28
Стр. 29
стр. 29
Стр. 30
стр. 30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Метады анал1зу для выяулення генетычна мадыф1каваных аргашзмау i вытворных прадуктау. Колькасныя метады, ямя заснаваны на нукпешавай кюлаце

(ISO 21570:2005, ЮТ)

Издание официальное

Г осстандарт Минск

Предисловие

Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-97 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Порядок разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3    ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 36 от 11 ноября 2009 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Кыргызстан

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Российская Федерация

RU

Федеральное агентство по техническому

регулированию и метрологии

Таджикистан

TJ

Т аджикстандарт

4    Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21570:2005 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods (Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте).

Международный стандарт разработан CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN) совместно с ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO) в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венским соглашением).

Перевод с английского языка (еп).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Госстандарте Республики Беларусь.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международные стандарты актуализированы.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении Д.А.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

5    ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от от 24 сентября 2010 г. № 58 непосредственно в качестве государственного стандарта Республики Беларусь с 1 января 2011 г.

6    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ГОСТ ИСО 21570-2009

Окончание таблицы 1

Результат

Выражение результата

Обнаружены как последовательность, специфическая для целевого таксона, так и целевая последовательность, происходящая из ГМО, однако количество по крайней мере одной из целевых последовательностей ниже предела количественного определения

Для каждого ГМО констатируется:

«ДНК, происходящая из ГМО (специфический ГМО), обнаружена с помощью (специфическая целевая последовательность), полученной из (специфический вид)».

В соответствующих случаях, кроме того, добавляется «Фактический предел количественного определения составляет X %» (указываются использованные единицы)

Обнаружены как последовательность, специфическая для целевого таксона, так и целевая последовательность, происходящая из ГМО, и количество обеих целевых последовательностей выше предела количественного определения

Для каждого ГМО констатируется:

«Содержание ДНК, происходящей из ГМО (специфический ГМО), обнаруженной с помощью (специфическая целевая последовательность), полученной из (специфический вид), составляет X ± погрешность %» (указываются использованные единицы)

Может также указываться содержание ДНК, происходящей из ГМО, с учетом погрешности измерения, как в том случае, когда оно превышает конкретную величину и когда не достигает ее.

10 Отчет об испытании

Отчет об испытании должен быть написан в соответствии с ISO 24276 и ISO 21569 и должен содержать по крайней мере следующую дополнительную информацию:

a)    предел количественного определения метода и материал, с помощью которого он был установлен;

b)    фактический предел количественного определения;

c)    ссылку на метод, который был использован для экстракции ДНК;

d)    ссылку на использованные материалы;

e)    результаты, выраженные в соответствии с разделом 9.

5

Приложение А

(справочное)

Методы специфического целевого таксона

А.1 Метод специфического целевого таксона для определения абсолютного количественного содержания ДНК гена ас№1 из кукурузы с использованием метода ПЦР в реальном времени

А.1.1 Введение

В настоящем приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомогательного) гена adh 1 (кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (Zea mays) для определения содержания ДНК-кукурузы или для тестирования присугствия/отсугствия в растворах ДНК, экстрагированной из продуктов, содержащих ДНК-кукурузу, например из пищевых продуктов, обнаруженных количеств ингибиторов ПЦР.

Ограничения см. в А. 1.8.

А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

А.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для ДНК, экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев кукурузы и СЭМ (серий IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413 [10]) [11].

Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью межлабораторных испытаний с использованием неизвестных образцов (U1 - U6), состоящих из ДНК-кукурузы дикого типа с различным числом копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2), а также других межлабораторных испытаний в комбинации с методами специфического события ГМ-кукурузы, например Btl 1 (см. D.1).

Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно 1 [11].

Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности [11].

А.1.2.2 Межлабораторные испытания

Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе межлабораторных испытаний, организованных объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и институтом защиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с международным протоколом гармонизации [12].

Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов кукурузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (SI - S6) ДНК-кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [13]), содержащей известное абсолютное число копий (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения двухцепочечной ДНК фирмы PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) на справочное среднее значение 1C для геномов кукурузы (2,725 пг) [14].

Шесть образцов (U1 - U6) ДНК-кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев [13]) были использованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено тем же методом, что и в известных образцах.

Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе межлабораторных испытаний, суммированы в таблице А.1.

Валидация метода была также проведена в комбинации с методами специфического события для нескольких образцов ГМ-кукурузы, например для сладкой кукурузы Btl 1. Подробности комбинированных испытаний (относительного количественного определения) см. в [15] и [16], а также в D.I.

ГОСТ ИСО 21570-2009

Таблица А.1 - Данные валидации

Образец

U1

U2

из

U4

U5

U6

Количество участвовавших лабораторий, шт.

12

12

12

12

12

12

Количество лабораторий, имевших возвратные результаты, шт.

10

10

10

10

10

10

Количество исключенных лабораторий, шт.

1

1

1

1

1

1

Количество лабораторий, оставшихся после исключения, шт.

9

9

9

9

9

9

Количество образцов на лабораторию, шт.

4

4

4

4

4

4

Число выбросов по тесту Кохрана

1

1

1

1

-

-

Число выбросов по тесту Граббса

-

1

1

1

1

1

Количество принятых образцов, шт.

35

34

34

34

35

35

Значение ожидаемого числа копий

7 339

18 349

36 697

55 046

91 743

146 788

Среднее значение числа копий

9 985

23 885

46 918

75 161

100 541

122 080

Отклонение от истинного значения, %

36,1

30,2

27,9

36,5

9,6

-16,8

Стандартное отклонение повторяемости sr а

1 318,59

1 463,60

5 796,58

4 539,57

11 306,89

14 843,41

Относительное стандартное отклонение повторяемости, %6

13,21

6,13

12,35

6,04

11,25

12,16

Стандартное отклонение воспроизводимости Sr 3

2 013,12

2 083,57

6 145,39

6 806,85

14 592,04

17 777,70

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, %ь

20,16

8,72

13,10

9,06

14,51

14,56

а Выражается как значение числа копий. ь Выражается как процент от среднего значения.

А.1.2.3. Молекулярная специфичность

А.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной в EMBL/GenBank/DDBJ 1, регистрационный номер Х04050. Эта последовательность является уникальной для Zea mays (кукуруза/маис) и Zea mays subsp. diploperennis (теосинте мексиканского) [11].

А.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов оценена путем поиска в базах данных EMBL/GenBank/DDBJ 1 с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 1 на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ [9 октября 2003 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

А.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Специфичность метода была проверена в отношении широкого диапазона нецелевых таксонов и 20 различных линий кукурузы, представляющих географическое и филогенетическое разнообразие образцов [11]. Не было обнаружено перекрестной реактивности с нецелевыми таксонами (за исключением теосинте мексиканского Zea mays subsp. diploperennis, дикого предка культурной кукурузы) [11], [17]. Были установлены число копий и аллельная стабильность целевой последовательности у различных линий кукурузы [11].

А.1.2.4 Оптимизация

Оптимизация была проведена для системы обнаружения последовательностей (далее - СОП) ABI PRISM 7700®3) и TaqMan® chemistry3). Расчет праймера и зонда проводился с применением программного обеспечения Primer Express® (Applied Biosystems)3).

A. 1.2.5 Предел обнаружения (LOD)

В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOD составляет 10 копий целевой последовательности [11]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в межлабораторные испытания, составляло 7 399 копий целевой последовательности.

А.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOQ составляет 100 копий целевой последовательности [11]. Наименьшее число копий целевой последовательности, включенных в межлабораторные испытания, составляло 7 399 копий целевой последовательности.

А.1.3 Адаптация

Конкретная информация отсутствует.

А.1.4 Принцип метода

Фрагмент гена adh 1 размером 134 пары оснований (далее - п. о.) амплифицировали с использованием двух кукурузных adhl-специфических праймеров (см. таблицу А.2). Накопление продуктов ПЦР измеряли в конце каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью кукурузного adM-специфического олигонуклеотидного зонда (ADH1-MDO, см. таблицу А.2), помеченного двумя флуоресцентными красителями: FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве тушителя. Для этих целей применялся TaqMan® chemistry3).

Измеренный сигнал флуоресценции пересекал определяемое пользователем пороговое значение после нескольких циклов. Количество этих циклов было названо Ct-значением. Для количественной оценки количества кукурузной adhl-ДНК в неизвестном образце Ct-значение преобразовано в соответствующее значение числа копий путем сравнения с калибровочной кривой, чье Ct-значение напрямую связано с известным числом копий (регрессионный анализ).

А.1.5 Реактивы

А.1.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ISO 24276 (пункт 6.6).

А.1.5.2 Вода

А.1.5.3 Буфер для ПЦР (без МдС12) 10-кратный

А.1.5.4 Раствор МдС12, с (МдС12) = 25 ммоль/л

А.1.5.5 Раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (далее - дНТФ), с (дНТФ) = 2,5 ммоль/л (каждый)

А.1.5.6 Олигонуклеотиды

Подробная информация о применяемых олигонуклеотидах приведена в таблице А.2.

Таблица А.2 - Олигонуклеотиды

Наименование

Последовательность олигонуклеотидной ДНК

Окончательная концентрация при ПЦР

ADH-FF3

5'-CgT СдТ ТТС CCA ТСТ СТТ ССТ СС-3'

300 нмоль/л

ADH- RR4

5'-ССА СТС СдА дАС ССТ САд ТС-3'

300 нмоль/л

ADH1-MDO

5'-FAM-AAT САд ддС ТСА ТТТ ТСТ СдС ТСС TCA-TAMRA-3'а

200 нмоль/л

а FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.

Размер ампликона adh 1 составляет 134 п. о.

3) Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

ГОСТ ИСО 21570-2009

А.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза

ДНК-полимераза AmpliTaq Gold® 2.

А. 1.5.8 Урацил-М-гликозилаза (при необходимости)

А.1.5.9 Реакционная смесь для амплификации

Подробно о реакционной смеси для амплификации см. в таблице А.З.

Таблица А.З - Окончательный объем/концентрация реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Суммарный реакционный объем

25 мкл

ДНК-матрица (максимум 250 нг)

5 мкл

Т aq-Д Н К-пол имераза

TaqMan® Universal Master Mix 2X

12,5 мкл

Деконтаминационная система (дУТФ, включая урацил-М-гликозилазу)

Реакционный буфер (содержащий пассивный эталонный ROX)а

Смесь дНТФ

Праймеры

См. таблицу A.2

См. A.1.5.6

Зонд

См. таблицу A.2

См. A.1.5.6

а ROX- карбокси-Х-родамин.

А.1.6 Аппаратура

А.1.6.1 Общие положения

Должно использоваться стандартное лабораторное оборудование, если не установлено иное.

А.1.6.2 Термоциклер

Указанный температурно-временной профиль изначально был протестирован с прибором СОП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) 3. Могут использоваться другие системы ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

А.1.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере реального времени, например ABI PRISM® 96-Well Optical Reaction Plate или MicroAmp® Optical Caps (8 крышек/плоских полосок) (Applied Biosystems)3.

A. 1.7 Порядок проведения ПЦР

A.1.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности эталонного гена и для целевой последовательности ГМО должна проводиться в отдельных пробирках, если иное не установлено в соответствующем приложении для ГМ-специфических целевых последовательностей.

Метод описан для ПЦР с общим объемом реакционной смеси 25 мкл и реактивами, список которых приведен в таблице А.З.

А.1.7.2 Контроль ПЦР

Если результаты контроля отличаются от ожидаемых, испытание повторяют.

В качестве положительного контроля и/или эталонного материала для калибровки может быть использована высококачественная чистая геномная ДНК, экстрагированная из кукурузы (например, СЭМ от JRC, IRMM 3) [13]. Должны быть проведены все виды контроля, установленные в ISO 24276.

А.1.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице А.4, была оптимизирована для СОП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) 5). В исследовании по подтверждению достоверности метода она использовалась совместно с AmpliTaq Gold® ДНК-полимеразой °\ Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для акгивации/инициации денатурации фермента, зависит от особенностей используемой полимеразы. Условия реакции указаны в таблице А.4.

Таблица А.4 - Условия проведения реакции

Время, с

Температура, °С

Процедура перед ПЦР: деконтаминация

120

50

Процедура перед ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация ДНК-матрицы

600

95

ПЦР (50 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15

95

Стадия 2

Ренатурация и элонгация

60

60

А.1.8 Ограничения и оценка результатов

Присутствие ингибиторов ПЦР может оказать сильное влияние на точность оценки числа копий adftl -последовательности в исследуемых образцах. Поэтому необходимо проверять присутствие или отсутствие обнаруженного количества ингибиторов ПЦР (см. также ISO 21571:2005, приложение А), например, путем проведения серии разбавлений ДНК-матрицы и проверки соответствия между разбавлениями и различиями величины Ct (порогового цикла), т. е. одной единице Ct соответствует удвоение концентрации ДНК-матрицы.

Для использования этого метода в комбинации с методом количественного определения происходящей из ГМО ДНК важно, чтобы абсолютное количество ДНК-матрицы (нг) было таким же, как при adftl-ПЦР, так и при ГМО-специфической ПЦР. Если это будет не так, то абсолютное число копий, полученное в ходе этих реакций, не может быть сравнено непосредственно и будет необходимо приведение этих чисел в соответствие. В противном случае относительная концентрация ГМО не может быть рассчитана.

А.1.9 Калибровка и результаты расчетов

Калибровочные точки получают с ДНК, содержащей определенное количество (в абсолютных числах копий) гаплоидной геномной ДНК-кукурузы, включающей целевую последовательность.

Калибровочную кривую получают путем построения графика значений Q против логарифма числа копий целевой последовательности для калибровочной точки. Это может быть осуществлено, например, путем использования программного обеспечения (электронной таблицы), такого как Microsoft Excel , или напрямую с помощью опций, доступных в программном обеспечении СОП.

Калибровочную кривую используют для определения абсолютного числа гаплоидных копий генома кукурузной ДНК неизвестных образцов. Несмотря на то, что ДНК образца может быть деградирована вследствие процесса приготовления продукта либо может содержать иные ингредиенты, чем кукуруза, это не будет влиять на рассчитываемое число гаплоидных копий генома неизвестных образцов. 4

ГОСТ ИСО 21570-2009

Приложение В

(справочное)

Методы скрининга

В.1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания ДНК 358-промотора сои линии GTS 40-3-2 с использованием метода ПЦР в реальном времени

В.1.1 Введение

В настоящем приложении описан метод специфической амплификации и обнаружения таксон-специфического гена сои (ген лектина, /е1) и ДНК 358-промотора, происходящего из вируса мозаики цветной капусты, количественного определения содержания ДНК 358-промотора в соевых ингредиентах, содержащих ГМ-сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready®).

Ограничения см. в В. 1.8.

В.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров

В.1.2.1 Общие положения

Метод был оптимизирован для СЭМ (СЭМ IRMM-410) 5 [18], состоящих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.

Воспроизводимость описанных методов была проверена в ходе межлабораторных испытаний с использованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA- SE, см. в таблице В.1), состоящих из смеси эталонных материалов вышеперечисленного типа [19]. Кроме того, были протестированы доступные пищевые продукты [20].

Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было [21], [22].

Метод был опубликован в [23].

В.1.2.2 Межлабораторные испытания

Пять неизвестных образцов, содержащие от 0,7 % до 3 % (по массе) высушенной соевой муки из сои GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.

Метод, специфичный для обнаружения 358-промотора, дал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17 % до 34 % (см. таблицу В.1). В ходе начальных экспериментов межлабораторных испытаний было определено, что 1%-ный соевый СЭМ не соответствовал заявленной величине.

Исследования показали, что различавшиеся эталонные материалы были изготовлены разными способами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники межлабораторных испытаний были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2%-ный СЭМ и разбавлять его для получения раствора 1%-ной эталонной ДНК для использования при количественном определении.

Для экстракции ДНК использовалась процедура, приведенная в [23]. 200 нг материала образца было лизировано в 1 мл буфера [гуанидингидрохлорид//протеиназа К (0,5 моль/л//0,8 мг/мл)] при 56 °С в течение 3 ч. После стадии обработки РНКазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 мл силикогелевой смолы Wizard® 6 и смола со связанной ДНК была пропущена через колонку с фильтром Wizard®6. После промывания изопропанолом ДНК элюировали из силикогелевой смолы в 10 ммоль/л Трис-буфером pH 9,0 при 70 °С. Концентрацию ДНК определяли измерением оптической плотности при 260 нм и приводили к уровню 20 мкг/мл. Для последующего ПЦР-анализа 200 нг ДНК из каждого образца было проанализировано в двух независимых реакциях.

Каждый образец анализировался дважды.

Поскольку образцы, помеченные SA - SE, представляли собой смеси этих различных эталонов, результаты, полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший сценарий, ведущий к недооценке точности прикладного метода ПЦР в реальном времени [19].

Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и на статистическом расчете выбросов. Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовавшие системы LightOycler® 8), были исключены еще до расчета выбросов. Исключение определенных приборов для ПЦР обусловлено тем, что прикладной метод нуждается в тщательной адаптации и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того, который поименован в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Граббсу [24]. Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности межлабораторных испытаний приведены в таблице В.1.

Таблица В.1 - Данные валидации Збв-промотор-специфического обнаружения ГМО

Образцы

SA

SB

SC

SD

SE

Год проведения межлабораторных испытаний

1999

1999

1999

1999

1999

Количество лабораторий, имевших возвратные результаты, шт.

11

11

11

11

11

Количество образцов на лабораторию, шт.

1

1

1

1

1

Количество исключенных лабораторий, шт.

2

2

2

2

2

Количество лабораторий, оставшихся после исключения, шт.

9

9

9

9

9

Количество принятых образцов, шт.

9

9

9

9

9

Ожидаемое значение, % ГМО

1,4

1,8

3

0,7

1

Среднее значение, % ГМО

1,63

1,76

4,04

0,88

1,73

Среднее линейное значение, % ГМО

1,62

1,70

3,46

1,00

1,60

Стандартное отклонение воспроизводимости Sr, % ГМО

0,28

0,39

1,36

0,21

0,35

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости, %

17

22

34

24

20

Предел воспроизводимости R(R = 2,8 sR)

0,80

1,08

3,82

0,58

0,97

Кроме того, четырьмя участниками межлабораторных испытаний были проанализированы четыре неизвестных доступных образца пищевой продукции, содержащей от 0,3 % до 36 % (по массе; средние значения) ГМ-сои линии GTS 40-3-2. Метод, специфический для обнаружения 358-промотора, показал относительное стандартное отклонение воспроизводимости в диапазоне от 17 % до 28 % [20].

В.1.2.3 Молекулярная специфичность

В.1.2.3.1 Общие положения

Метод был разработан для использования в качестве целевой части последовательности, описанной, например, в GenBank®7, регистрационный номер V00141.

Список ГМ-растений, содержащих CaMV 358-промотор, приведен в [25].

Может быть получен ложноположительный результат вследствие того, что амплифицированная последовательность происходит из цветной капусты и других представителей сем. Brassicaceae (Cruciferae), а также Resedaceae и Solanaceae, инфицированных вирусом мозаики цветной капусты [26], [27], поэтому положительные результаты, касающиеся Brassicaceae, Resedaceae и Solanaceae, должны тщательно рассматриваться. Положительные результаты могут указывать на присутствие продуктов, происходящих из ГМ-растений, но не должны интерпретироваться как доказательство присутствия продуктов, происходящих из ГМ-растений, без дополнительного подтверждения.

Для того чтобы отличить вирусную инфекцию от ГМ-материала, могут использоваться методы обнаружения вируса мозаики цветной капусты [28].

ГОСТ ИСО 21570-2009

В.1.2.3.2 Теоретическая специфичность

Теоретическая специфичность праймеров и зондов оценена путем поиска в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ 9) с использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью программы BLASTN 2.2.3 9) [24 апреля 2002 г.]. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемыми целевыми последовательностями.

В.1.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности

Экспериментальная специфичность метода оценена путем анализа СЭМ IRMM-410 из высушенной соевой муки производства IRMM, содержащей от 0 % до 5 % сои линии GTS 40-3-2, и эталонного материала фирмы Leatherhead Food Research Association International 9>- цельной соевой муки (Lot №. 2/99-01), содержащей 0 %, 0,3 %, 1,25 % и 2 % сои линии GTS 40-3-2 соответственно.

Исследованным коммерческим пищевым материалом были соевая мука, белковые изоляты сои, композитные пищевые продукты, содержащие соевую муку и соевый белок.

В.1.2.4 Оптимизация

Оптимизация была проведена для СОП ABI PRISM 7700®9) и TaqMan® chemistry9).

Расчет праймера и зонда проводился с применением программного обеспечения Primer Express® (Applied Biosystems)9).

В. 1.2.5 Предел обнаружения (LOD)

Поскольку метод является количественным, LOD прямо не оценивался. LOD должен быть больше или равным пределу количественного определения, т. е. 50 копий генома сои линии GTS 40-3-2 в 82 000 копий генома обычной соевой муки.

В.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)

LOQ был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК, как описано в [20]. В соответствии с рекомендациями разработчика метода LOQ составляет 50 копий генома сои линии GTS 40-3-2 в 82 000 копий генома обычной соевой муки. Значение 1C см. в [20]. В соответствии с этими данными оцененный относительный LOQ составляет 0,06 (= 50 копий/82 000 копий *100 %).

Концентрации, исследованные в межлабораторных испытаниях, приведены в таблице В.1.

Примечание - Число копий в межлабораторных испытаниях не определялось.

В.1.3 Адаптация

Конкретная информация отсутствует.

В.1.4 Принцип метода

Фрагмент последовательности CaMV 358-промотора размером 82 п. о. был амплифицирован с помощью ПЦР двух 358-промотор-специфических праймеров. ПЦР-продукгы измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью 353-промотор-специфического олигонуклео-тидного зонда, помеченного двумя флуоресцентными красителями: FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве тушителя. Для этих целей применялся TaqMan® chemistry 8.

Фрагмент последовательности гена лектина сои размером 81 п. о. был амплифицирован с помощью ПЦР в отдельной ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических для гена соевого лектина, и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зондов, специфических для гена соевого лектина, производства TaqMan®1 \

Количественное определение производили с использованием метода AACt или метода двойной калибровочной кривой (см. В.1.9).

В.1.5 Реактивы

В.1.5.1 Общие положения

Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ISO 24276 (6.6).

В.1.5.2 Вода

В.1.5.3 Буфер для ПЦР (без МдС12) 10-кратный

В.1.5.4 Раствор МдС12, с (МдС12) = 25 ммоль/л

В. 1.5.5 Раствор дНТФ, с (дНТФ) = 2,5 ммоль/л (каждый)

В.1.5.6 Олигонуклеотиды

Подробная информация о применяемых олигонуклеотидах приведена в таблице В.2.

Таблица В.2 - Олигонуклеотиды

Наименование

ДНК-последовательность олигонуклеотида

Окончательная концентрация при ПЦР

Целевая последовательность эталонного гена

Лекгин-F

5'-ТСС ACC ССС АТС САС ATT Т-3'

900 нмоль/л

Лекгин-R

5'-ggC АТА дАА ддТ дАА дТТ дАА ддА-3'

900 нмоль/л

Лектин-ТМР

5'-FAM-AAC Сдд ТАд СдТ ТдС САд СТТ Cg-TAMRA-З'а

100 нмоль/л

Целевая последовательность ГМО

35S-F

5'-дСС ТСТ дСС дАС АдТ ддТ-3'

300 нмоль/л

35S-R

5'-ААд АСд Тдд ТТд дАА СдТ СТТ С-3'

900 нмоль/л

35S-TMP

5'-FAM-CAA АдА Тдд АСС ССС АСС САС g-TAMRA-З'а

100 нмоль/л

а FAM: 6-карбоксис

злуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.

Размер пектинового ПЦР-продукга составляет 81 п. о.; размер 353-ПЦР-продукта составляет 82 п. о.

В. 1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза

ДНК-полимераза AmpliTaq Gold®

В. 1.5.8 Урацил-М-гликозилаза (при необходимости)

В.1.6 Аппаратура

В.1.6.1 Общие положения

Должно использоваться стандартное лабораторное оборудование, если не установлено иное.

В.1.6.2 Термоциклер

Указанный температурно-временной профиль изначально был протестирован с прибором СОП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) и СОП GeneAmp® 5700 (Applied Biosystems) Могут использоваться другие системы СОП ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.

В.1.6.3 Реакционные пробирки

Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере, например ABI PRISM® 96-Well Optical Reaction Plate или MicroAmp® Optical Caps (8 крышек/плоских полосок) (Applied Biosystems)9.

B.1.7 Порядок проведения ПЦР

B.1.7.1 Общие положения

ПЦР для целевой последовательности эталонного гена и для целевой последовательности ГМО должна проводиться в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.

Метод описан для ПЦР с общим объемом реакционной смеси 50 мкл и реактивами, список которых приведен в таблице В.З.

ГОСТ ИСО 21570-2009

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах.

© Госстандарт, 2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Республики Беларусь без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

ГОСТ ИСО 21570-2009

Таблица В.З - Окончательный объем/концентрация реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Целевая последовательность эталонного гена

Общий объем

50 мкп

ДНК-матрица (максимальное количество 200 нг)

10 мкп

ДНК-полимераза

AmpliTaq Gold®

1,25 ед.

Деконтаминационная

система

ДУТФ

Урацил-Л/-гликозилаза AmpErase®

400 мкмоль/л 0,5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan® (содержащий пассивный эталонный ROX)а

IX

МдС12

5 ммоль/л

Праймеры

Лекгин-F и лекгин-R (см. таблицу В.2)

См.таблицу В.2

дНТФ

дАТФ, дЦТФ, дГТФ

200 мкмоль/л каждого

Зонд

Лектин-ТМР (см. таблицу В.2)

См.таблицу В.2

Целевая последовательность ГМО

Общий объем

50 мкп

ДНК-матрица (максимальное количество 200 нг)

10 мкп

ДНК-полимераза

AmpliTaq Gold®

1,25 ед.

Деконтаминационная

система

ДУТФ

Урацил-Л/-гликозилаза AmpErase®

400 мкмоль/л 0,5 ед.

Реакционный буфер

Буфер A TaqMan® (содержащий пассивный эталонный ROX)а

IX

МдС12

5 ммоль/л

Праймеры

35S-F и 35S-R (см. таблицу В.2)

См.таблицу В.2

дНТФ

дАТФ, дЦТФ, дГТФ

200 мкмоль/л каждого

Зонд

35S-TMP (см. таблицу В.2)

См.таблицу В.2

а ROX- карбокси-Х-родамин.

В.1.7.2 Контроль ПЦР

В качестве положительного контроля и эталонного материала для калибровки могут быть использованы СЭМ GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0,1 % до 5 % ГМ-сои), производимые IRMM, Гиль, Бельгия (серии IRMM-410) 12)[18].

Должны быть проведены все виды контроля, установленные в ISO 24276.

В.1.7.3 Температурно-временная программа

Температурно-временная программа, приведенная в таблице В.4, была оптимизирована для СОП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems)1 \ В исследовании по подтверждению достоверности метода она использовалась совместно с AmpliTaq Gold® ДНК-полимеразой . Использование других термоциклеров может потребовать специальной адаптации. Время, необходимое для активации/ инициации денатурации фермента, зависит от особенностей используемой полимеразы.

Условия реакции указаны в таблице В.4.

Таблица В.4 - Условия проведения реакции

Время,с

Температура, °С

Процедура перед ПЦР: деконтаминация

120

50

Процедура перед ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация ДНК-матрицы

600

95

ПЦР (45 циклов)

Стадия 1

Денатурация

15

95

Стадия 2

Ренатурация и элонгация

60

60

12) Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

ГОСТ ИСО 21570-2009

Содержание

Введение..................................................................................................................................................VI

1    Область применения..............................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки.............................................................................................................................1

3    Термины и определения........................................................................................................................1

4    Принцип метода......................................................................................................................................2

4.1    Общие положения............................................................................................................................2

4.2    Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР................................................2

4.3    Количественное определение продуктов ПЦР..............................................................................2

5    Реактивы.................................................................................................................................................2

6    Аппаратура и оборудование..................................................................................................................2

7    Руководящие указания, касающиеся методики...................................................................................2

7.1    Общие положения............................................................................................................................2

7.2    Стабильность целевой последовательности................................................................................3

7.3    Калибровка анализа........................................................................................................................3

7.4    Рассмотрение количественного определения..............................................................................3

7.5    Требования к обеспечению качества.............................................................................................3

8    Оценка.....................................................................................................................................................4

9    Выражение результата..........................................................................................................................4

10 Отчет об испытании...............................................................................................................................5

Приложение А (справочное) Методы специфического целевого таксона.............................................6

A.    1 Метод специфического целевого таксона для определения абсолютного количественного

содержания ДНК гена adh 1 из кукурузы с использованием метода ПЦР в реальном времени................................................................................................................................................6

Приложение В (справочное) Методы скрининга...................................................................................11

B. 1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания ДНК

358-промотора сои линии GTS 40-3-2 с использованием метода ПЦР в реальном

времени.............................................................................................................................................11

Приложение С (справочное) Методы специфической конструкции...................................................17

C. 1 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания сои

линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени    (метод 1).................................17

С.2 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания сои

линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени    (метод 2).................................22

С.З Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы Event176 с использованием ПЦР в реальном времени..........................................30

С.4 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-сои линии GTS 40-3-2 с использованием ПЦР в реальном времени..................................36

С.5 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы линии MON 810 с использованием ПЦР в реальном времени.............................42

С.6 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы линии Event176 с использованием ПЦР в реальном времени.............................49

С.7 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы линии Btl 1 с использованием ПЦР в реальном    времени.....................................56

IV

С.8 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы линии GA21 с использованием ПЦР в реальном времени...................................63

C. 9 Метод специфической конструкции для количественного определения содержания

ДНК-кукурузы линии Т25 с использованием ПЦР в реальном времени......................................69

Приложение D (справочное) Методы специфического события.........................................................77

D. 1 Метод специфического события для абсолютного и относительного количественного

определения содержания кукурузы линии Btll с использованием ПЦР в реальном времени..............................................................................................................................................77

D.2 Метод специфического события для относительного количественного определения

содержания ДНК-кукурузы линии MON 810 с использованием ПЦР в реальном времени.......83

Библиография..........................................................................................................................................89

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии межгосударственных стандартов

ссылочным международным стандартам................................................................95

V

Введение

Исследование генетически модифицированных организмов (далее - ГМО) и производных продуктов осуществляется посредством следующих стадий, выполняемых последовательно или одновременно. После отбора проб нуклеиновые кислоты экстрагируются из навески пробы. Экстрагированные нуклеиновые кислоты далее могут быть очищены в процессе экстрагирования или после него. Следующими стадиями являются: оценка количества экстрагированных нуклеиновых кислот (при необходимости), разведение нуклеиновых кислот (при необходимости) и выполнение аналитических процедур, например полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Указанные стадии подробно изложены в настоящем стандарте и следующих международных стандартах:

-    ISO 21568 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Отбор проб»;

-    ISO 21569 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте».

Дополнительная информация об общих требованиях и определениях, относящихся к вышеупомянутым стадиям, приведена в ISO 24276 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения».

Международная организация по стандартизации (ISO) обращает внимание на то, что соблюдение настоящего стандарта включает использование патентов, касающихся ПЦР-технологии.

ISO не устанавливает никаких требований в части обоснованности и сферы применения патентных прав.

ISO было проинформировано, что компании Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. и Hoffman-La Roche являются держателями патентных прав, касающихся ПЦР-технологии. Компании гарантировали ISO свою готовность вести переговоры о лицензиях на приемлемых и недискриминационных условиях с заявителями по всему миру. В этой связи заявления держателей этих патентных прав зарегистрированы ISO. Информация может быть получена от Licensing Department Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City.CA 94404, USA (США) и Roche Molecular Systems, Inc. Licensing Department 1145 Atlantic Avenue Alameda, CA 94501, USA (США).

Следует обратить внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего стандарта могут быть предметом патентных прав, отличных от вышеописанных. ISO не может нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.

VI

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов

и производных продуктов.

Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Метады анал1зу для выяулення генетычна мадыфшаваных аргашзмау i вытворных прадуктау.

Колькасныя метады, ямя заснаваны на нукпешавай кгслаце

Foodstuffs

Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products.

Quantitative nucleic acid based methods

Дата введения 2011-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общий перечень количественных методов обнаружения ГМО в пищевых продуктах с использованием ПЦР.

Стандарт устанавливает общие требования к специфической амплификации целевых последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК) с целью количественной оценки содержания ДНК из ГМО и для подтверждения идентичности амплифицированной последовательности ДНК.

Целью руководящих принципов, включающих минимальные требования и критерии исполнения, изложенные в настоящем стандарте, является обеспечение сравнимости, точности и воспроизводимости результатов, получаемых в разных лабораториях.

Настоящий стандарт распрастраняется на матрицы пищевых продуктов, но может быть применен также и для других матриц, например кормов, растений.

Конкретные примеры методов приведены в приложениях А - D.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

ISO 21569:2005 Продукты пищевые. Методы анализа на обнаружение генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Качественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте

ISO 21571:2005 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и их производных продуктов. Извлечение нуклеиновой кислоты

ISO 24276 11 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Общие требования и определения

ISO Guide 32:1997 Калибровка в аналитической химии с использованием аттестованных стандартных образцов

3    Термины и определения

В настоящем стандарте применяют термины и определения, установленные в ISO 24276.

Готовится к изданию.

Издание официальное

4    Принцип метода

4.1    Общие положения

Количественный анализ заключается в количественном определении целевой последовательности ДНК в исследуемых образцах. Каждый метод определяет целевую (ые) последовательность (и).

Количественное определение может проводиться с использованием конкурентной ПЦР [1], [2] или ПЦР в реальном времени [3], [4].

Количественный анализ должен ясно выражать количество целевого генетического элемента относительно количества специфического стандарта, соответствующих калибровок и видов контроля и быть в пределах динамического диапазона применяемого аналитического метода и анализируемого образца.

Анализ, как правило, состоит из:

-    амплификации одной или большего числа специфических целевых последовательностей;

-    обнаружения и подтверждения специфичности продукта (ов) ПЦР;

-    количественного определения амплифицированных фрагментов относительно калибровок.

Примечание - В случае анализа, проведенного с помощью ПЦР в реальном времени, амплификация, обнаружение и подтверждение происходят одновременно.

4.2    Амплификация, обнаружение и подтверждение продуктов ПЦР

Описание принципов амплификации, обнаружения и подтверждения последовательностей ДНК приведено в ISO 21569.

4.3    Количественное определение продуктов ПЦР

Принцип метода количественного определения, как правило, заключается в определении соотношения (выраженного в процентах) двух целевых последовательностей ДНК в последовательности, представляющей интересующий ГМО, и последовательности (эндогенной), специфической для целевого таксона. Однако в некоторых случаях количественное определение может также производиться по отношению к определенному количеству основного анализируемого вещества пищевого продукта (например, когда производится обнаружение генетически модифицированных (далее - ГМ) микроорганизмов в пищевых продуктах).

Материалы, применяющиеся для калибровки, которые используются для количественного определения, должны быть пригодными для контроля с сертифицированными эталонными материалами (далее - СЭМ), если таковые имеются. Если такие материалы отсутствуют, должны использоваться другие подходящие эталонные материалы. Примерное руководство приведено в [5]. Информация об исследованиях подтверждения достоверности и погрешности измерений приведена в международных исследованиях [6] - [9].

5    Реактивы

Все реактивы и материалы, использующиеся для анализа, должны быть идентичными или эквивалентными реактивам и материалам, указанным в методе. В противном случае все реактивы и материалы должны быть пригодными для проведения исследований в области молекулярной биологии. Реактивы должны храниться и использоваться в соответствии с рекомендациями изготовителей или в соответствии с техническими требованиями обеспечения качества лабораторных работ. Список реактивов приведен в приложениях А - D.

6    Аппаратура и оборудование

См. приложения А - D и ISO 24276.

7    Руководящие указания, касающиеся методики

7.1 Общие положения

Общие положения, имеющие отношение к ПЦР-амплификации для обнаружения ГМО, указаны в ISO 21569.

В приложениях А - D указаны методы ПЦР-обнаружения и описана возможность их применения. Для каждого метода подробно описаны рабочие характеристики.

ГОСТ ИСО 21570-2009

Концентрация интересующей последовательности ДНК должна находиться в пределах динамического диапазона метода.

Примечание - Для определения, достаточно ли качества ДНК-матрицы (по длине и структурной целостности), а также достаточно ли ее чистоты и количества для обеспечения обнаружения и количественного определения ГМО, принадлежащего к целевому таксону, может быть проведен специфический контроль для целевого таксона. Он может быть обоснован, когда ДНК экстрагирована из композитного или подвергнувшегося глубокой обработке материала.

ДНК, экстрагированная из каждой части исследуемого образца, должна быть проанализирована не менее двух раз.

Виды контроля - в соответствии с ISO 24276, таблица 1.

7.2    Стабильность целевой последовательности

Для сортов различного географического и филогенетического происхождения должны быть приняты во внимание аллельная стабильность и число копий гена целевой последовательности.

7.3    Калибровка анализа

Должно быть применено соответствующее число калибровочных точек и повторений, охватывающих диапазон количественного определения [например, четыре калибровочные точки в двух повторениях (всего 4x2 значения) или шесть калибровочных точек с одним измерением в каждой точке (всего 6 значений)]. Качество калибровки влияет на погрешность измерения [9].

В качестве альтернативы эталонного материала геномной ДНК для калибровки может использоваться ряд разбавлений плазмиды или синтетической двухцепочечной ДНК, содержащих целевую последовательность, при условии, что результаты калибровки с их использованием сопоставимы с результатами, полученными при калибровке с использованием эталонного материала геномной ДНК и геномной ДНК, экстрагированной из образца.

7.4    Рассмотрение количественного определения

Методы ПЦР должны быть соответствующим образом разработаны с целью минимизации изменчивости.

Примечание - В зависимости от применяемого метода и/или анализируемого материала присутствие конструкций, включающих несколько целевых генов, может привести к преувеличению истинного содержания ГМО.

Для определения предела количественного определения (LOQ) см. ISO 24276.

На расчет содержания ГМО, основанный на числе копий целевых последовательностей в гаплоидном геноме, влияет гомо- и гетерозиготность изучаемых образцов. Более подробная информация приведена в приложениях А - D.

Применение метода AACt (порогового цикла) обосновано только в том случае, если эффективность амплификации пробы, специфической для целевого таксона, и пробы, специфической для ГМО, очень близка.

7.5    Требования к обеспечению качества

Для получения достоверных оценок количества целевой последовательности желательна согласованность между измерениями. Однако для установления достоверности изменений необходимо знание относительного стандартного отклонения воспроизводимости метода (подробности см. в ISO серии 5725). Для расчета относительного стандартного отклонения воспроизводимости число отдельных измерений на лабораторный образец может превышать то, что допустимо на практике в приемлемых ценах. Следовательно, если наличие указанной, происходящей из ГМО ДНК (в процентах) запротоколировано, возможное решение требует как минимум:

a)    согласовать в пределах части исследуемого образца:

-    через отбраковку измерений меньших, чем предел количественного определения;

-    через максимальное отклонение, наблюдаемое между разбавлениями и индивидуальными измерениями, равное ожидаемой величине, исходя из соответствующего фактора разбавления, ±33 %;

b)    согласовать между рабочими частями образца:

-    определенные относительные концентрации происходящей из ГМО ДНК, полученные с учетом пункта а), для каждой части исследуемого образца не должны различаться на значение более чем от минус 50 % до +100 % значения определенного количества (ACt = 1 при ПЦР в реальном времени) (т. е. для двух рабочих частей образца приемлемы результаты измерений 1,0 % и 2,0 %, в то время как 0,9 % и 2,1 % неприемлемы).

3

Для того чтобы гарантировать точность измерений, для количества исследуемого события должен выбираться и анализироваться эталонный материал, предпочтительно сертифицированный, с соответствующим уровнем метрологической надежности и с надлежащим сходством вещества продукта. В отсутствие СЭМ может быть приготовлен эталонный материал собственного производства с помощью процедуры, обеспечивающей стабильность, однородность и единство измерений и гарантирующей отсутствие систематической погрешности. Количественно оцененная погрешность должна удовлетворять требованиям для калибровки (см. ISO Guide 32).

8    Оценка

Результаты ПЦР могут быть:

a)    пригодными для количественной оценки целевой последовательности при условии, что:

-    результат положительный в соответствии с ISO 21569:2005 (8.1);

-    наблюдаемое ингибирование реакции незначительно;

-    аналитические процедуры дают недвусмысленные величины измерений;

-    количество целевой последовательности находится в пределах динамического диапазона метода;

-    проведена калибровка аналитической процедуры соответствующим образом (см. 7.3).

b)    непригодными для количественной оценки целевой последовательности, если любое из вышеперечисленных условий не было соблюдено.

Погрешность измерения должна быть достаточно мала, для того чтобы лаборатория могла дать обоснованное заключение.

В приложениях А - D описаны измерения количества целевой ДНК. Эти количества могут быть использованы для расчета количества ГМО. Эти расчеты обычно принимают во внимание такие относящиеся к делу биологические факторы, как гомо- и гетерозиготность целевых последовательностей.

Если количество целевой ГМ-последовательности или последовательности, специфической для целевого таксона, ниже предела количественного определения, результат должен выражаться только качественно.

Примечание - Утверждение, что количество происходящей из ГМО ДНК ниже предела количественного определения, сопровождающееся спецификацией этого предела количественного определения, рассматривается как качественное выражение результата.

9    Выражение результата

Результаты должны ясно констатировать количество целевой ГМ-последовательности относительно последовательности, специфической для целевого таксона.

Результаты должны также содержать значения погрешности измерения, такие как стандартное отклонение или относительное стандартное отклонение. Кроме того, должны приводиться значения предела обнаружения и предела количественного определения метода и фактические пределы обнаружения и количественного определения.

Целевая последовательность может быть, а может и не быть обнаружена или количество по крайней мере одной из них может быть ниже предела количественного определения. В таблице 1 указаны четыре альтернативных случая и соответствующее им выражение результата, которые должны быть включены в отчет по испытанию.

Таблица 1 - Выражение результатов

Результат

Выражение результата

Последовательность, специфическая для целевого таксона, не обнаружена

См. ISO 21569.

«Для вида XДНК не обнаружена»

Последовательность, специфическая для целевого таксона, обнаружена, но не обнаружена целевая последовательность, происходящая из ГМО

В соответствии с ISO 21569.

«Для вида X ДНК, происходящая из ГМО, не обнаружена».

В надлежащих случаях, кроме того, добавляется «Фактический предел обнаружения составляет X %» (указываются использованные единицы)

4

1

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация представлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

7

2

   Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

3

   Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

9

4

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

5

   Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

6

   Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

11

7

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

8

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

13

9

Приведены примеры доступных коммерческих продуктов. Информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является подтверждением соответствия указанного продукта требованиям ISO. Допускается использование эквивалентных продуктов в случае, если доказано, что будут достигнуты аналогичные результаты.

14