Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации Государственные санитарно-эпидемиологические правила _ и    нормативы_

2.1.6. АТМОСФЕРНЫЙ ВОЗДУХ И ВОЗДУХ ЗАКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИЙ. САНИТАРНАЯ ОХРАНА ВОЗДУХА

Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест

Гигиенические нормативы ГН 2.1.6.1763—03

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания

МУК 4.2.1767—03 МУК 4.2.1768—03 МУК 4.2.1769—03 МУК 4.2.1770—03 МУК 4.2.1771—03 МУК 4.2.1772—03 МУК 4.2.1773—03 МУК 4.2.1774—03 МУК 4.2.1775—03

Издание официальное

Минздрав России Москва • 2004

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания

МУК 4.2.1767—03 МУК 4.2.1768—03 МУК 4.2.1769—03 МУК 4.2.1770—03 МУК 4.2.1771—03 МУК 4.2.1772—03 МУК 4.2.1773—03 МУК 4.2.1774—03 МУК 4.2.1775—03

Содержание

Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов

в атмосферном воздухе населенных мест. ГН 2.6Л 763—03............................ 5

Метод микробиологического измерения концентрации клеток Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177 - продуцента глюкоамилазы в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1767—03...... 9

Метод микробиологического измерения концентрации клеток Aspergillus terreus 44-62 - продуцента ловастатина

в атмосферном воздухе населенных мест. МУК 4.2.1768—03....................... 16

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus subtUis 65 - продуцента нейтральной протеиназы и амилазы в атмосферном воздухе населенных мест

МУК 4.2.1769—03................... 23

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus subtilis 72 - продуцента щелочной протеазы в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1770—03....... 30

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus subtilis 103 (4-15) - продуцента нейтральной протеазы в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1771—03.......................... 37

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus licheniformis 1001 - продуцента бацитрацина в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1772-03.................................. 44

Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1773—03....................... 51

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium eanescens F- 832 ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1774—03............................... 58

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44—11—62/3 -продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест.

МУК 4.2.1775—03...... ...64

ББК51.21

M54

M54 Методические указания. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 66 с.

ISBN 5—7508—0510—7

1.    Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к. б. н. Н. И. Шеиной).

2.    Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3.    Введены в действие с I декабря 2003 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.21

ISBN 5—7508—0510—7

€> Минздрав России, 2004 €> Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004

МУК 4.2.1775—03

УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Triehoderma viride 44—11—62/3 -продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания МУК 4.2.1775—03

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Triehoderma viride 44—11—62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксила-наза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563—96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

64

МУК 4.2.1775—03

2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3

На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5—6 ° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0—5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.

Систематическое положение микроорганизма Класс    Fungi imperfecti

Порядок    Hyphomycetales

Род    Trichoderma

Вид    viride

Штамм    44-11-62/3

Штамм Trichoderma viride 44—11—62/3 получен во ВНИИбио-технология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмо-чевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.

Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс цел-люлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин ГЗх. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед/мл, ксиланазы - 42 ед/мл.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36— 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5—6 °Б, pH среды - 5,0—6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 100 до 5 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

65

МУК 4.2.1775—03

4. Метод измерений

Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции цешполазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818

(щелевой прибор Кротова)    ТУ 64-12791—77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический    ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 Лупа с увеличением хЮ Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл Секундомер Барометр

66

МУК 4.2.1775—03

Марля медицинская    ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая    ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агаризованное пивное сусло 5—6 °Б

для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, pH 5,0—6,0,

режим стерилизации 1,1—1,2 ати в течение 30 мин)

Молочная кислота,

синоним-альфа-оксипропионовая

кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды

сусло-агар для подавления посторонней

бактериальной флоры)    ГОСТ 490-79

Бенгальский розовый

Диметил сульфоксид

Спирт этиловый ректификат    ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: КН2РО4 - 1 г; MgS04 7НЮ - 0,5 г;

(NH4)2S04- 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар -18 г; вода дистиллированная - до 1 000 мл.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:

6.1.    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2.    Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3.    «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4.    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

67

МУК 4.2.1775—03

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630—800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5—20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30—50 колоний на чашке).

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50—60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

68

МУК 4.2.1775—03

При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют д ля контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С ( для интенсификации развития гриба). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культуральноморфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод), как результат продукции целлюло-литических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

„ ЛМ000    .    з

X =-кл/м    ,    где

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

У - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1 ООО - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V- объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Протокол № количественного микробиологического анализа штамма-продуцент a Trichoderma viride 44—11—62/3 в атмосферном воздухе населенных мест

1.    Дата проведения анализа_

2.    Место отбора пробы_

3.    Название лаборатории_

4.    Юридический адрес организации_

69

МУК 4.2.1775—03

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы Определяемый микроорганизм Концентрация, к л/м3

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1.    Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186—96. М., 1991. 693 с.

2.    ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3.    Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980.27 с.

4.    Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977.7 с.

5.    ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

6.    Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.

70