“УТВЕРЖДАЮ”

ПРИРОДНЫХ, ПИТЬЕВЫХ, ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВЫХ, ХОЗЯЙСТВЕННО-БЫТОВЫХ СТОЧНЫХ, ОЧИЩЕННЫХ СТОЧНЫХ, СТОЧНЫХ, ТАЛЫХ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ вод ЭКСПРЕСС - МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПРИБОРА СЕРИИ «БИОТЕСТЕР»

ФР. 1.39.2015.19242

(взамен ФР. 1.31.2005.01881 (ред. 2010 г.)

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПРОБ ПРИРОДНЫХ, ПИТЬЕВЫХ, ХОЗЯЙСТВЕННО-ПИТЬЕВЫХ, ХОЗЯЙСТВЕННО-БЫТОВЫХ СТОЧНЫХ, ОЧИЩЕННЫХ СТОЧНЫХ, СТОЧНЫХ, ТАЛЫХ, ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ВОД ЭКСПРЕСС - МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПРИБОРА СЕРИИ «БИОТЕСТЕР»

ПНДФТ 14.1:2:3:4.2-98 (ред. 2015г.)

2015

2

Право тиражирования и реализации принадлежит разработчику.

Настоящее издание методики введено взамен предыдущего издания 2010 г. и действует до выхода нового издания.

Разработчик: ООО ¹‘Спектр-М”

Адрес: 191167, г. Санкт-Петербург, а/я 86

т/факс (812) 232-39-42 E-mail - info@biotester.ru ²

СОДЕРЖАНИЕ

НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ.........................................................5

1.    ПРИНЦИП МЕТОДА.............................................................................................5

2. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ...............................6

3.    СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА,

ПОСУДА, РЕАКТИВЫ, МАТЕРИАЛЫ...................................................................7

4.    УСЛОВИЯ БЕЗОПАСНОГО ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ.......................................8

5.    ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРОВ......................................9

6.    УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ........................................................9

7.    ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЯ...........................................9

8.    ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.................................................................................10

9.    ОБРАБОТКА И ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................12

10.    ОЦЕНКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ......................13

11.    ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТА АНАЛИЗА...............................14

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное).............................................................................14

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТ-ОБЪЕКТА.................................................................14

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное)...........................................................................15

ВЫРАЩИВАНИЕ КУЛЬТУРЫ...............................................................................15

ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное)..........................................................................17

ПОДГОТОВКА ИНФУЗОРИЙ К АНАЛИЗУ........................................................17

ФОРМА ПРОТОКОЛА БИОТЕСТИРОВАНИЯ....................................................19 ¹

НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий документ устанавливает методику определения острой токсичности воды по реакции инфузорий, предназначенную для оперативного контроля токсичности проб природных, питьевых, хозяйственно-питьевых, хозяйственно-бытовых сточных, очищенных сточных, сточных, талых, технологических вод с использованием в качестве тест-объекта инфузорий— Paramecium caudaium (в дальнейшем инфузории).

Параметры поведенческой реакции инфузорий определяются с помощью приборов серии “Биотестер” (Биотес гер, Бнотестер-2, Биотестер-2м, Биотестер-С и др.)

1. ПРИНЦИП МЕТОДА

1.1. Метод определения токсичности водных сред основан на способности тест-объектов реагировать на присутствие в водной среде веществ, представляющих опасность для их жизнедеятельности, и направленно перемешаться по градиенту концентраций (в направлении изменения концентраций) этих веществ (хемотаксическая реакция), избегая их вредного воздействия.

Хемотаксическая реакция реализуется при условии наличия стабильного во времени градиента концентраций химических веществ. Подобный градиент создается путем наслоения в вертикальной кювете (пробирке) на взвесь инфузорий в загустителе испытуемой жидкости, полученной поп.8.1. При этом в измерительной кювете образуется стабильная граница раздела, сохраняемая в течение всего времени биотестирования. Эта граница не препятствует свободному перемещению инфузорий в предпочтительном для них направлении и при этом предотвращает перемешивание жидкостей из нижней и верхней зон. После создания в кювете двух зон в течении 30 минут происходит перераспределение инфузорий по зонам. Важная особенность поведенческой реакции инфузорий — массовое перемещение организмов в верхние слои жидкости. В случае, если анализируемая проба не содержит токсических веществ, в кювете будет наблюдаться концентрирование клеток инфузорий в верхней зоне. Наличие в анализируемой пробе токсических веществ приводит к иному характеру перераспределения инфузорий в кювете, а именно: чем выше токсичность пробы, тем меньшая доля инфузорий перемещается в верхнюю зону (анализируемую пробу).

1.2. Критерием токсического действия является значимое различие в числе клеток инфузорий, наблюдаемых в верхней зоне кюветы в пробе, не содержащей токсических веществ (контроль), по сравнению с этим показателем, наблюдаемым в анализируемой пробе (опыт).

1.3. Количественная оценка параметра тест-реакции, характеризующего

токсическое действие, производится путем расчета соотношения числа клеток инфузорий, наблюдаемых в контрольной и анализируемой пробах (согласно п. 9.1), и выражается в виде безразмерной величины — индекса токсичности (Т).

2.МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДИКИ

2.1.Методика обеспечивает получение результатов с погрешностью не превышающей значений, приведенных таблице I.

Таблица 1 - Значения показателей повторяемости, воспроизводимости и точности

Наимено вание объекта Показатель повторяемости (среднее квадратическое отклонение повторяемости). Показатель воспроизводи мости (среднее квадратическое отклонение воспроизводи мости), Показатель точности (границы абсолютной погрешности при доверительной вероятности Р = 0, 95), Or OR 5 Вода природная, питьевая, хозяйсгеенно-пнтъевая. хозяйственно-бытовая сточная, очищенная сточная, сточная . талая, технологическая 0,06 Т 0,14 Т 0,27 Т

Т — результат определения (измерения) токсичности пробы в условных единицах (индекс токсичности).

2.2.    За результат токсикологического анализа (Т) принимают среднее арифметическое значение результатов 3-х параллельных определений, расхождение между которыми нс превосходит значений норматива оперативного контроля повторяемости (г), приведенных в таблице 2.

2.3.    Расхождения между результатами токсикологического анализа, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R). При выполнении этого условия приемлемы оба результата, и в качестве окончательного может быть использовано их

6

общее среднее значение. Значения предела воспроизводимости (R) приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Значения предела повторяемости, воспроизводимости.

Предел повторяемости Критическая разность Предел (допускаемые (допускаемые воспроизводимости расхождения расхождения (допускаемые для трех результатов для шести результатов расхождения для параллельных параллельных двух результатов определений). определений). измерений, полученные в разных лабораториях), г CRo.9s(6) R 0,20 Т 0,24 Т 0, 39 Т

При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

2.4. Качество тест-культуры определяется следующими показателями:

—    порог чувствительности к модельному токсиканту (C11SO4X5H2O) -0,01 мг/дм³;

—    диапазон реагирования на модельный токсикант находится в пределах 0,01—1,0 мг/дм³.

3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, ПОСУДА, РЕАКТИВЫ, МАТЕРИАЛЫ

—    прибор серии «Биотестер», например, Биотестер-2м (№46149-10 в Государственном реестре средств измерений);

—    весы лабораторные II класса точности, предел взвешивания ЮОг, дискретность отсчета 1 мг по ГОСТ Р 53228;

—    микроскоп бинокулярный с увеличением 10-^50;

—    термометр жидкостный стеклянный 0-50°С с ценой деления шкалы ГС по ГОСТ 28498:

—    часы сигнальные;

—    пипетки вместимостью 1.2. 5, 10 см ’ тип 3 по ГОСТ 29228;

—    колбы мерные 2-25-2; 2-50-2; 2-100-2; 2-500-2; 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

—    цилиндры 3-100-2, 3-250-2 по ГОСТ 1770;

—    баня водяная объемом воды от 1 л, точность установки

7

температуры 5°С, температуры воды от 80°С;

—    холодильник бытовой, обеспечивающий подержание температуры (8 ± 4)°С;

—    посуда для культивирования из химически инертного материала, например, химические стаканы, стаканчики для взвешивания, конические широкогорлые колбы, чашки Петри по ГОСТ 25336;

—    лабораторные стаканы Н-2-100; В-2-100 по ГОСТ 25336;

—    банки широкогорлые из стекла с притертыми или винтовыми пробками вместимостью 500-1000 см¹ для отбора и хранения проб ТУ 6-19-45;

—    дистиллированная вода по ГОСТ 6709;

—    натрий хлористый по ГОСТ 4233;

—    калий хлористый по ГОСТ 4234;

—    кальций хлористый 2-водный ;

—    магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;

—    натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201;

—    медь сернокислая (II) 5-водная но ГОСТ 4165;

—    поливиниловый спирт ПВС— марка П/2, высший сорт по ГОСТ 10779;

—    фильтры бумажные обеззоленные (белая лента) ТУ 6-09-1678;

—    дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 54731;

Все используемые реактивы должны быть марки х.ч. или ч.д.а. Возможно применение иных средств измерения, вспомогательного

оборудования, технических средств, посуды,    и реактивов с

характеристиками не хуже, чем у вышеуказанных.

4. УСЛОВИЯ БЕЗОПАСНОГО ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ

4.1.    Требования электробезопасности при работе с электроустановками соответствуют ГОСТ 12.1.019.

4.2.    Специалисты, выполняющие анализы, должны пройти обучение безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

4.3.    Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям

пожарной безопасности по ГОСТ    12.1.004 и    иметь средства

пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.4.    Специальных мер по охране окружающей среды не требуется, поскольку приборы серии “Биотестср’' и принадлежности не содержат ртути и других материалов, опасных для человека и окружающей среды при хранении, транспортировке и использовании прибора. Инфузории-гуфсльки не имеют форм, опасных для человека и окружающей среды.

4.5.    При работе с химическими веществами соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.007 и методические рекомендации ПНД Ф

12.13.1.

8

Определение токсичности по настоящей методике выполняет лаборант со средним профессиональным образованием, имеющий опыт работы нс менее 1 года в химико-аналитической, биологической или близкой по профилю лаборатории

6.    УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Измерения проводятся в следующих условиях:

Температура окружающего воздуха, град. С - от + 15° до +28°;

Относительная влажность воздуха, %    -    не    более    80    (    при    25    °С);

Атмосферное давление, кПа    -    от 84 до 106.7 (630-800мм рт.ст.);

Напряжение питающей сети, В    -    (220    ±    22);

Частота питающей сети. Гц    -    (50    ±    1).

7.    ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЯ

7.1.    Отбор и хранение проб

7.1.1 Общие процедуры отбора проб определены в следующих документах:

—    ГОСТ 17.1.5.05-85 “Охрана природы. Гидросфера. Общие требования отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферны осадков”;

—    ГОСТ 31862-2012 “Вода питьевая. Отбор проб”;

—    НВН 33-5.3.01-85 Инструкция по отбору проб для сточных вод;

Для выполнения анализа отбирают 50 см³ водной пробы.

Пробы, поступившие в лабораторию на исследование, должны бьп документально оформлены и маркированы. Сопроводительными документам являются описание водной пробы, даты и времени отбора. Маркировка пре осуществляется в произвольной форме, но с обязательным занесение обозначений в лабораторный журнал.

7.1.2. Биотестирование проб воды проводят нс позднее 6 часов после и отбора. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы вод охлаждают. Не допускается консервирование проб с помощью химически консервантов. Хранить пробы следует не более 24 часов после отбора пр температуре (8 ± 4) °С.

7.2.    Приготовление взвеси клеток инфузории и растворов

7.2.1.    Используется взвесь клеток инфузорий, полученная луге выращивания тест - объекта в определенных условиях (см. приложение Б отмытая от продуктов метаболизма и корма (см. приложение В) и доведенш до рабочей концентрации (плотности) (1000 ± 500) кл/см'.

7.2.2.    Среда для культивирования и разбавления - среда Лозина-Лозинско/

9

( в дальнейшем Л-Л) готовится на дистиллированной воде. Возможно использование водопроводной воды, которая должна быть соответствующим образом обработана (дехлорирована отстаиванием в течении 5-10 суток), или иной заведомо нетоксичной воды (но не дистиллят!).

Для приготовления концентрата среды Л-Л в 1дм³ воды растворяют следующие соли: NaCI — 1,0 г, КС1 — 0,1г, MgS0₄— 0,1 г. CaCU— 0,1 г. NaHC0₃— 0,2 г. Такой раствор можно хранить в холодильнике до 7 суток при температуре 8 ± 4°С. Для работы используется среда Л-Л, полученная десятикратным разбавлением водой исходного концентрата. Разбавленная среда Л-Л не хранится. Разбавляющая среда и среда для культивирования должны быть идентичны и обеспечивать выживаемость инфузории в течение 5 суток.

7.2.3.    Модельный токсикант готовится на основе меди сернокислой. Навеску 5-водной сернокислой меди 10,0 мг растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 1 дм³. Раствор хранится 7 дней. Рабочие концентрации меди сернокислой готовят в день проведения анализа разбавлением концентрата, причем растворы с концентрациями до 1 мг/дм³ готовят разбавлением дистиллированной водой, а с концентрациями 0,1 мг/дм³ и меньше — средой Л-Л. 7.3.4.

7.2.4.    Раствор ПВС в среде Л-Л: 5%-ный раствор используют в качестве нейтрального загустителя. Для приготовления раствора ПВС 0,5 г порошка ПВС смешивают с 9,5 см³ среды Л-Л. Смесь нагревают на водяной бане при температуре (85 ± 5)°С до растворения порошка. Используют раствор в течение суток.

7.3. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре взвеси тест-объекта.

Инфузории не переносит резких перепадов температуры !

8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

8.1. Заполнение кювет

При определении токсичности и в контрольных и в анализируемых пробах используются кюветы строго одного типа: 2Т3.993.065 (13x13x45 мм) или 2ТЗ.993.066 (12,5x12,5x45 мм).

В кювету вносят 2,0 см³ взвеси инфузорий в рабочей концентрации, предварительно проверенной по двум параметрам: по чувствительности к модельному токсиканту (см. приложение В п. 3.2) и по характеру выхода в разбавляющую среду. К взвеси добавляют 0,35 см³ 5%-ного раствора ПВС, все тщательно перемешивают, непременно увлажнив стенки кюветы, и наслаивают пипеткой 1,6 см³ анализируемой жидкости, не допуская перемешивания с нижним слоем

При большом количестве примесей и, следовательно, высокой

10

1

2