ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение содержания витамина D

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение холекальциферола (D₃) или эргокальциферола (D₂)

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Вызначэнне змяшчэння вп-амшу D

метадам высокаэфектыунай вадкаснай храматаграфМ.

Вызначэнне холекальцыферолу (D₃) або эргакальцыферолу (D₂)

(EN 12821:2009, ЮТ)

Издание официальное

as

УДК 664:543.645.5(083.74)(476)    МКС    67.050    КП    06    ЮТ

Ключевые слова: пищевые продукты, витамин D, холекальциферол D₃, эргокальциферол D₂, высокоэффективная жидкостная хроматография

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации».

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС)

ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 28 мая 2012 г. № 26

3    Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 12821:2009 Foodstuffs - Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography - Measurement of cholecalciferol (D₃) or ergocalcif-erol (D₂) (Продукты пищевые. Определение содержания витамина D методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение холекальциферола (D₃) или эргокальциферола (D₂)).

Европейский стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Перевод с английского языка (еп).

Официальные экземпляры европейского стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и европейского стандарта, на который дана ссылка, имеются в Национальном фонде ТИПА.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© Госстандарт, 2012

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

СТБ EN 12821-2012

Приложение А

(справочное)

Примеры применяемых полупрепаративных систем высокоэффективной жидкостной хроматографии

Таблица А.1 - Примеры полупрепаративных систем ВЭЖХ, которые использовались для очистки анализируемых растворов проб участниками сертификационных испытаний витамина D по EU МАТ (Программа измерений и испытаний Европейского союза) [8]

Колонка	Размеры, мм	Подвижная фаза, (V + V)	Детектор, X
Polygosil® 60, 5 мкм	250*8	изооктан + изобутанол (99 + 1)	265 нм
LiChrospher® Si 60, 5 мкм	250*4	л-гексан + 2-пропанол (99 + 1)	265 нм
LiChrospher® Si 100, 5 мкм	250*8	л-гексан + 2-пропанол (98 + 2)	265 нм
ц Porasil® silica	300 * 3,9	л-гексан + THF + 2-пропанол (98 + 1+1)	265 нм
Partisil® РАС, 5 мкм	250 * 4,6	л-гексан + изоамиловый спирт (99 + 1)	265 нм
Lichrosorb ® Si 60	250*4	л-гексан + 2-пропанол + THF (98 + 1+1)	265 нм
Lichrosorb® Si 60	250*4	л-гексан + 2-пропанол (95 + 5)	265 нм
Lichrosorb® Si 60	250*4	л-гексан + 2-пропанол (97 + 3)	265 нм
Все торговые наименования предназначены исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта. Это не является рекламой названных видов продукции со стороны CEN.

Таблица А.2 - Примеры аналитических систем ВЭЖХ, используемых для определения витамина D в растворах с исследуемой пробой, которые использовались участниками сертификационных испытаний EU МАТ [8]

Колонка	Размеры, мм	Подвижная фаза, (V + V)	Детектор, X
Hypersil® ODS, 5 мкм	250 * 4,6	метанол	265 нм
LiChrospher® 100 RP, 18,5 мкм	250*4	метанол + вода (95 + 5)	264 нм
Vydac® 201ТР54	250 * 4,6	метанол + вода (93 + 7)	265 нм
Vydac® 201ТР54	250 * 4,6	ацетонитрил + метанол (80 + 20)	265 нм
Shperisorb® ODS 2, 5 мкм	250 * 4,6	ацетонитрил + дихлорметан + метанол (93 + 4 + 3)	диодная матрица
Nucleosil® Cis, 5 мкм	250*4	ацетонитрил + метанол (70 + 30)	265 нм
Zorbax® ODS	250 * 4,6	ацетонитрил + метанол (95 + 5)	265 нм
Все торговые наименования предназначены исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта. Это не является рекламой названных видов продукции со стороны CEN.

9

Приложение В

(справочное)

Примеры применяемых условий экстракции и омыления

Приведенные в качестве примеров условия экстракции и омыления использовались участниками сертификационных испытаний EU МАТ [8] для определения витамина D. Масса проб приведена в граммах жира (для маргарина 82%-ной жирности, для сухого молока 27%-ной жирности).

Таблица В.1 - Примеры аналитических систем ВЭЖХ, которые использовались для определения витамина D в анализируемых растворах проб участниками сертификационных испытаний EU МАТ [8]

Омыление Экстракция 16 г жира + 150 мл этанола + 1 г пирогаллола + + (75 мл воды + 30 г КОН а)) + азотистое промывание; 30 мин при 70 °С РЕ Ь) + DEE 0) (9 + 1), 2 х 100 мл; промывание водой, 5 х 100 мл 8 г жира + 100 мл этанола + 1 г аскорбата натрия + 0,04 г сульфида натрия + 12 г КОН + + 50 мл воды + азотистое промывание; 30 мин при 80 °С л-гексан, 3 х 100 мл и 3 х 50 мл; промывание водой, 4 х 100 мл 8 г жира + 35 мл этанола + 2 г аскорбата натрия + + 10 г КОН + 50 мл воды; 45 мин при 100 °С л-гексан, 1 х Ю0 мл; промывание 5%-ным раствором КОН, 1 х 100 мл; промывание 30%-ным этанолом в 9%-ном растворе хлорида натрия, 1 х ЮО мл; промывание 0,9%-ным раствором хлорида натрия, 1 х 100 мл 12 г жира + 30 мл этанола + 30 мл метанола + + 0,1 г аскорбиновой кислоты + 30 мл 50%-ного раствора КОН + азотистое промывание; 30 мин при 100 °С DEE, 2 х ЮО мл; промывание водой 4 х 50 мл от 6 г до 8 г жира + 100 мл этанола + 1 г аскорбиновой кислоты + 50 мл 50%-ного раствора КОН +азотистое промывание; 20 ч при 20 °С РЕ + DEE (1 + 1), 2 х 200 мл; промывание водой, 6 х 50 мл 8 г жира + 1 г пирогаллола + 150 мл 28%-ного раствора КОН в этаноле и воде (9 + 1) + азотистое промывание; 30 мин при 100 °С, обратный поток DEE + РЕ (1 + 1), 2 х 500 мл; промывание водой, 5 х 150 мл 24 г жира + 90 мл этанола + 0,5 г аскорбата натрия + 30 мл 60%-ного КОН + азотистое промывание; 45 мин при 100 °С, обратный поток DEE, 1 х 150 мл, 3 х 75 мл; промывание водой, 5 х 200 мл a)    КОН = гидроксид калия. b)    РЕ = петролейный эфир. c)    DEE = диэтиловый эфир.

10

СТБ EN 12821-2012

Приложение С

(обязательное)

Примеры применяемых полупрепаративных и аналитических хроматограмм

X

X - время, мин; У - сигнал, условные единицы; 1 - витамин D в сухом молоке; 2 - витамин D в стандарте

Рисунок С.1 - Типичная хроматограмма нормально-фазной полупрепаративной ВЭЖХ омыленного и жидкого/сухого молока (CRM 421) и стандарта витамина D (витамин D₂ и витамин D3)

X - время, мин; Y - сигнал, условные единицы; 1 - витамин D₂; 2 - витамин D3

Рисунок С.2 - Типичная хроматограмма обращенно-фазной ВЭЖХ, полученная для экстракта сухого молока (CRM 421) в интервале времени от 11,5 до 12,5 мин на полупрепаративном этапе (см. рисунок С.1)

11

Приложение D

(справочное)

Данные по прецизионности измерений

Характеристики маргарина (CRM 122), приведенные в таблице D.1, были определены в ходе межлабораторных сличений [8] в соответствии с Руководством по сертификационным испытаниям EU МАТ, [8]. Исследование было организовано правительственной химической лабораторией, Великобритания.

Характеристики молока, жидкого детского питания, растительного масла, маргарина, сухого детского питания и рыбьего жира (см. примечание к таблице D ) были определены в ходе межлабораторных сличений [8] в соответствии с Руководящими указаниями АОАС по процедурам совместных испытаний для оценки характеристик метода анализа [13]. Исследование было организовано NMKL (Скандинавским комитетом по анализу пищевых продуктов) [11]. Применявшийся метод включает омыление, экстракцию, концентрирование, препаративную ВЭЖХ и аналитическую ВЭЖХ.

Таблица D.1 - Данные по прецизионности измерений для маргарина и сухого молока

Проба 1 2 Г од проведения межлабораторного сличения 1994 1994 Количество лабораторий 11 11 Количество проб 5 5 Количество лабораторий, после исключения выбросов 11 11 Количество выбросов (лаборатории) 0 0 Количество принятых результатов 48 47 Среднее значение х, мкг/100 г 12,30 14,30 Стандартное отклонение повторяемости (сходимости) sf мкг/100 г 0,82 0,74 Относительное стандартное отклонение повторяемости (сходимости) RSDr, % 6,7 5,2 Предел сходимости г [г =2,8 х s^], мкг/100 г 2,32 2,09 Стандартное отклонение воспроизводимости sR мкг/100 г 0,94 0,78 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 7,6 5,5 Предел воспроизводимости R[R = 2,8 х sj, мкг/100 г 2,66 2,21 Критерий Гурвица R 0,3 0,3 1    - маргарин, витаминизированный витамином D3 (CRM 122). 2    - сухое молоко, сушка распылением витаминизированного витамином D3 цельного молока (CRM 421).

Таблица D.2-Данные по прецизионности измерений для молока, жидкого детского питания, растительного масла, маргарина, сухого детского питания и рыбьего жира

Проба 1 2 3 4 5 6 Г од проведения межлабораторного сличения 1997 1997 1997 1997 1997 1997 Количество лабораторий 8 8 8 8 8 8 Количество проб 2 2 2 2 2 2 Количество лабораторий после исключения выбросов 7 8 8 7 7 8 Количество выбросов (лаборатории) 1 0 0 1 1 0 Количество принятых результатов 14 16 16 14 14 16

Окончание таблицы D.2

Проба 1 2 3 4 5 6 Среднее значение х, мкг/100 г 0,418 1,38 4,61 8,39 10,1 11,6 Стандартное отклонение повторяемости (сходимости) sr, мкг/100 г 0,019 0,08 0,34 0,54 0,2 0,3 Относительное стандартное отклонение повторяемости (сходимости) RSDf, % 4,6 5,9 7,4 6,5 2,4 2,2 Предел сходимости г [г= 2,8 х sr], мкг/100 г 0,054 0,23 0,96 1,52 0,7 0,7 Стандартное отклонение воспроизводимости Sr, МКГ/100 Г 0,038 0,17 1,11 0,57 0,7 2,1 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 9,1 12,1 24,1 6,8 7,1 17,7 Предел воспроизводимости R [R = 2,8 х sR], мкг/100 г 0,106 0,47 3,11 1,60 2,0 5,8 Восстановление, % - - 102 - 93,9 92,9 Критерий Гурвица Ra) 0,4 0,6 1,1 0,3 0,3 0,8 1    - молоко, подвергнутое высокотемпературной обработке (UHT) с низким содержанием лактозы, невитами-низированное; 2    - готовое к употреблению жидкое детское питание (жидкая каша) с заявленным на этикетке содержанием витамина D3 - 1,3 мкг/100 г; 3    - растительное масло с добавлением витамина D3 для совместного испытания; 4    - маргарин с добавлением витамина D3 для совместного испытания; 5    - сухое детское питание с добавлением витамина D3 для совместного испытания; 6    - рыбий жир с добавлением витамина D3 для совместного испытания. а) Все эти значения отличаются от значений, которые даны в [10], так как критерий Гурвица установлен на 22 % меньше, чем 122 ppb (частей на миллиард), в соответствии с [12].

13

Приложение Е

(справочное)

Дополнительный этап предварительной очистки для определения витамина D с использованием препаративной тонкослойной хроматографии

Е.1 Дополнительный этап предварительной очистки с использованием препаративной тонкослойной хроматографии (TLC)

Е.1.1 Общие положения

Описанный метод тонкослойной хроматографии широко используется для предварительной очистки экстрактов витамина D перед введением препаративной ВЭЖХ. Он был проверен на кормах для поросят с 50 мкг/кг витамина D.

Он имеет следующие преимущества:

-    зоны, содержащие витамин D, могут быть легко визуализированы с помощью UV-излучения. В зависимости от матрицы в отношении каждой пробы принимают решение о минимальном размере зоны для разделения D₂/D₃. Таким образом можно свести к минимуму помехи матрицы.

-    использование многоэтапной разработки пластин для тонкослойной хроматографии может дополнительно улучшить разделение зон D₂/D₃ и зоны матрицы.

Недостатком этого метода является то, что он не может выполняться автоматически. Время переключения является ограниченным. Более подробная информация по данному методу приведена в [11].

Е.1.2 Сущность метода

Кратная часть сырого экстракта после омыления очищается с помощью препаративной тонкослойной хроматографии. С образца, содержащего витамин D₂/D₃, делают соскоб на пластину, которую перемещают в небольшую колонку для экстрагирования витамина D₂/D₃. Объем данного экстракта уменьшают перед применением аналитической ВЭЖХ.

Е.1.3 Реактивы

Е.1.3.1 Пластины для TLC, например силикагель 60 F 254, Merck 5715 \ 0,25 мм, 20 х 20 см.

Е.1.3.2 Бутилгидрокситолуол.

Е.1.3.3 л-гексан.

Е.1.3.4 Метанол.

Е.1.3.5 Ацетон.

Е.1.3.6 Диэтиловый эфир.

Е.1.3.7 Растворитель для проявления пластины для TLC, смесь 88 мл п-гексан, 2 мл метанола, 10 мл ацетона и 10 мг бутилгидрокситолуола.

Е.1.3.8 Растворитель для элюирования изолированной зоны витамина D₂/D₃, смесь 60 мл диэтилового эфира и 40 мл л-гексана.

Е.1.3.9 Стандартный раствор витамина D₃, 250 мкг/мл в метаноле.

Е.1.4 Оборудование

Е.1.4.1 ТСХ камера 20 к 20 см для проявления пластин для TLC.

Е.1.4.2 Шприц 1 мл газонепроницаемый или подходящая система нанесения проб для TLC.

Е.1.4.3 UV-лампа, 254 нм.

Е.1.4.4 Открытая трубчатая стеклянная колонка, диаметр 1 см, длина около 15 см, запорный кран из политетрафторэтилена.

Е.1.4.5 Небольшой шпатель с острой кромкой.

Е.1.5 Методика

Наполняют проявочную камеру растворителем (Е.1.3.8) и ждут около 2 ч для пропитывания.

Выпаривают подходящую кратную часть сырого экстракта после омыления досуха при пониженном давлении и сразу же повторно растворяют его в 2 мл л-гексана. Наносят 1 мл из этого раствора

^Силикагель 60 F 254, Merc 5715 является примером подходящего продукта, доступного на рынке. Данная информация представлена исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта. Это не является рекламой названных изделий со стороны CEN.

СТБ EN 12821-2012

в нескольких навесках на пластину для TLC (Е. 1.3.1), чтобы получить зону длиной 10 см и не шире 1 см. Для локализации и идентификации наносят от 5 до 10 мкп стандартного раствора витамина D₃ (Е.1.3.9) на обе стороны этой зоны.

Проявляют пластину дважды почти до верхнего края. Для улучшения сортировки может оказаться целесообразным проявлять пластину в несколько этапов. Перед началом новой сортировки после последнего запуска растворитель выпаривают в потоке азота. Визуализируют выделенную зону витамина D2/D3, используя UV-излучение (Е.1.4.3), и отмечают карандашом (от 0,5 до 1,5 см). Соскабливают соответствующую зону шпателем (Е.1.4.5) на лист бумаги и переносят ее в открытую трубчатую колонку (Е.1.4.4), заполненную 10 мл растворителя (Е.1.3.8).

Витамин D₂/D₃ элюируют 5 раз в 10 мл растворителя (Е.1.3.8). Выпаривают комбинированные элюаты досуха при пониженном давлении и сразу же растворяют в 1 мл растворителя ВЭЖХ (раствор пробы).

Е.2 Дополнительный этап очистки с использованием колоночной хроматографии

Е.2.1 Методика

Метод очистки используют в колонке, изготовленной из полиэтиленгликоль-целита. Недостатком данного метода очистки является то, что он не может быть выполнен автоматически. Время проведения операций является ограниченным.

Е.2.2 Реактивы

Е.2.2.1 Петролейный эфир, диапазон кипения от 40 °С до 60 °С, дистиллированный.

Е.2.2.2 Петролейный эфир, диапазон кипения от 60 °С до 70 °С, дистиллированный.

Е.2.2.3 Диатомовая земля, кальцинированный поток кальцинированной соды CAS № 68855-54-9.

Е.2.2.4 Сульфат натрия.

Е.2.2.5 Полиэтиленгликоль 600.

Е.2.3 Оборудование

Е.2.3.1 Ротационный испаритель с водяной баней при 40 °С.

Е.2.3.2 Взрывозащищенный высокоскоростной измельчитель.

Е.2.3.3 Хроматографические трубки, длина 30 см, внутренний диаметр 2,5 см, оснащенные краном в нижней части для штепсельной вилки из политетрафторэтилена. Длина 10 см, внутренний диаметр 1,4 см, суженный в нижней части и оснащенный 100 мл резервуаром в верхней части.

Е.2.3.4 UV-лампа, ручная модель для длинноволнового света (366 нм).

Е.2.4 Методика

Е.2.4.1 Подготовка колонки

Готовят суспензию из 25 г диатомовой земли (Е.2.2.3) и 200 мл петролейного эфира (Е.2.2.2) в измельчителе (Е.2.3.2). При перемешивании быстро добавляют 15 мл полиэтиленгликоля (Е.2.2.5) и продолжают перемешивание в течение примерно 20 с.

Альтернативный метод подготовки суспензии с использованием метода, который производит эквивалентное измельчение в порошок полиэтиленгликоля на веществе-носителе. Наливают небольшое количество петролейного эфира (Е.2.2.2) в хроматографическую трубку (Е.2.3.3), помещают на дно деаэрированную ватную пробку и покрывают ее 1-сантиметровым слоем сульфата натрия (Е.2.2.4). Наливают суспензию в бутылку и уплотняют колонку с использованием поршня на стержне до тех пор, пока длина завершенных измерений колонки не достигнет примерно 15 см. В то же время удаляются излишки петролейного эфира. Заливают сверху 1-сантиметровым слоем сульфата натрия.

Е.2.4.2 Изготовление раствора пробы, элюирование и сбор элюата

Перекачивают экстракт из колбы с круглым дном и промывают колбу с использованием трех партий петролейного эфира (Е.2.2.2) примерно по 3 мл из каждой партии. Они также должны быть прокачены в колонку. Элюируют, используя петролейный эфир (Е.2.2.2). Удаляют первые 30 мл элюата. Собирают следующие 50 мл элюата. Продолжают этап очистки SPE (Е.З).

15

Е.З Дополнительный этап очистки с использованием SPE

Е.3.1 Методика

Настоящий раздел описывает метод очистки с использованием SPE и окиси кремния. Недостатком данного метода очистки является то, что он не может быть выполнен автоматически. Время проведения операций является ограниченным.

Е.3.2 Реактивы

Е.3.2.1 л-гептан р.а.

Е.3.2.2 Диэтиловый эфир.

Удаляет пероксиды путем ежедневной дистилляции осадка КОН после использования.

Е.3.2.3 Петролейный эфир, диапазон кипения от 40 °С до 60 °С, дистиллированный.

Е.3.3 Оборудование

Е.3.3.1 Картридж для твердофазной экстракции Silica, приблизительно 700 мг.

Е.3.3.2 Конические колбы с притертым соединением В 29.

Е.3.4 Выпаривают элюат и растворяют его в 10 мл гептана (Е.3.2.1). Активируют картридж (Е.3.3.1) с 10 мл гептана. Готовят и элюируют 10 мл экстракта пробы. Промывают, используя 10 мл 6%-ного раствора диэтилового эфира (Е.3.2.2) в гептане и элюируют с использованием 20 мл 20%-ного раствора диэтилового эфира (Е.3.2.2) в гептане. Собирают элюат в коническую колбу (Е.3.3.2), испаряют и растворяют его в 1 - 2 мл петролейного эфира (Е.3.2.3). Продолжают этап очистки TLC или полу-препартивной ВЭЖХ.

16

СТБ EN 12821-2012

Библиография

[1]    Johnson, Н., Hessel, Н. and Thorzell, К. Internal J. Vitamin and Nutr. Res., 1987, 57, 357 - 365 (Витамины и питательные вещества)

[2]    Johnson, Н., Halen, В., Hessel, Н., Nyman, A. and Thorzell, К. Internat. J. Vitamin and Nutr. Res., 1989, 59, 262-268

(Витамины и питательные вещества)

[3]    Reynolds, S. L. and Judd, H. J. The Analyst, 1984, 109, 489 - 492 (Аналитик)

[4]    Bognar, A. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1992, 194, 469 - 475 (Исследование продуктов питания)

[5]    Van den Berg, J. Agric. Fd. Chem., 1986, 34, 264 - 268

[6]    Mattila, P. J., Piironen, V., Backman, C., Asunmaa, A., Uusi-Rauva, E. and Koivistoinen, P., J. Food Comp. Anal., 1992, 5, 281 - 290

(Состав и анализ продуктов питания)

[7]    Lumley, I. D., Lawrence, P. R. J. Micronutrient Anal., 1990, 7, 301 -313 (Анализ микроэлементов в пище)

[8]    Finglas, Р. М., van den Berg, H. and de Froidmont-Gortz, I., 1997. The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: margarine (CRM 122), milk powder (CRM 421), and lyophilized Brussels sprouts powder (CRM 431). EUR-Report 18039, Commission of the European Union, Luxemburg

(Сертификация массовых долей витаминов в трех эталонных материалах: маргарин (CRM), порошковое молоко (CRM 421), лиофилизированный порошок брюссельской капусты (CRM 431))

[9]    The Pharmaceutical Codex, incorporating the British Pharmaceutical Codex, 11th Edition, The Pharmaceutical Press, 1979

[10]    Staffas, A., Nyman, A., J. AOAC Int., 2003, 86, 400 - 406

[11]    Methode 13.8.1 (Method 13.8.1): Die Bestimmung von Vitamin D - Verfahren; in: Methodenbuch 3.4. Erganzungslieferung 1997. VDLUFA Verlag Deutschland

(Определение витамина D. Метод ВЭЖХ)

[12]    Thompson, M. 2000, 125, 385 - 386

[13]    AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies p. 23 - 51 (Программа официальных методов AOAC, руководство рецензентов ассоциации по разработке, анализу, проверке и одобрению процесса. Часть IV. Руководящие указания АОАС по совместным исследованиям)

[14]    ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a

standard test method by inter-laboratory tests

(Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Определение сходимости и воспроизводимости для стандартного метода испытаний при проведении межлабораторных испытаний)

17

Ответственный за выпуск В. Л. Гуревич

Сдано в набор 24.07.2012. Подписано в печать 10.09.2012. Формат бумаги 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 2,32 Уч.-изд. л. 1,20 Тираж экз. Заказ

Издатель и полиграфическое исполнение: Научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) ЛИ № 02330/0552843 от 08.04.2009. ул. Мележа, 3, комн. 406, 220113, Минск.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Определение содержания витамина D методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение холекальциферола (D₃) или эргокальциферола (D₂)

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Вызначэнне змяшчэння в1тамину D метадам высокаэфектыунай вадкаснай храматаграфМ. Вызначэнне холекальцыферолу (D₃) або эргакальцыферолу (D₂)

Foodstuffs

Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography. Measurement of cholecalciferol (D₃) or ergocalciferol (D₂)

Дата введения 2013-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина D₃ (холекальциферол) или витамина D₂ (эргокальциферол) в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Витамин D₃ содержится преимущественно в пищевых продуктах животного происхождения, а витамин D₂ - в лесных грибах. Оба витамина могут использоваться для получения обогащенных пищевых продуктов. Настоящий стандарт не распространяется на пищевые продукты, которые содержат как витамин D₃, так и витамин D₂.

Кроме активности основных форм витамина D, витамина D₃ и витамина D₂, соответствующие метаболиты 25-гидроксивитамин D и 1,25-дигидроксивитамин D также вносят свой вклад в активность витамина D.

Настоящий стандарт распространяется только на определение витаминов D₃ или D₂.

Стандарт обеспечивает основу для аналитических методов. Он предназначается для создания схемы, согласно которой экспериментатор сможет проводить необходимые анализы в соответствии со стандартной процедурой. Данный метод был валидирован в результате проведения межлабораторных сличений на обогащенных и необогащенных образцах таких пищевых продуктов, как маргарин, молоко, сухое молоко, жидкое питание для грудных детей, молочных смесях, растительных и рыбных жирах при концентрациях от 0,4 мкг/100 г до 14 мкг/100 г. Дополнительные данные по валидации приведены в приложении D.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный стандарт. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696:1995 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний (ISO 3696:1987)

3    Сущность метода

Витамины D₂ и D₃ омыляют в пищевых продуктах с использованием спиртового раствора гидроксида калия и экстрагируют с помощью подходящего растворителя. Определение витамина D₂ или D₃ в растворе экстракта пробы осуществляют посредством полупрепаративной нормально-фазной колонки методом ВЭЖХ с последующим определением на аналитической обращенно-фазной колонке.

Если необходимо определить витамин D₃, витамин D₂ используют в качестве внутреннего стандартного вещества. При определении витамина D₂ используют в качестве внутреннего стандартного вещества витамин D₃.

Издание официальное

Содержание витамина D определяют ультрафиолетовой (UV) спектрометрией, причем пики идентифицируют на основе времени удерживания и дополнительно по спектральным UV-профилям, если для определения используется диодная матрица. Определение проводят с помощью метода внутреннего стандартного вещества, используя площадь или высоту пиков, см. [1] - [8].

4 Реактивы

4.1    Общие положения

Используют реактивы только признанной аналитической чистоты и воду не ниже 1 степени по EN ISO 3696, если иное не указано по ходу проведения анализа.

4.2    Метанол.

4.3    Этанол, объемная доля ф(С₂Н₅ОН) = 100 %.

4.4    Этанол, объемная доля ф(С₂Н₅ОН) = 96 %.

4.5    Сульфат натрия безводный.

4.6    Растворы КОН для омыления в соответствующих концентрациях, например массовая концентрация р(КОН) = 50 г/100 мл или р(КОН) = 60 г/100 мл, или спиртовые растворы, например 28 г КОН в 100 мл смеси этанол/вода с объемной долей этанола 90 %.

4.7    Антиокислительные реагенты: такие, как аскорбиновая кислота, аскорбат натрия, пирогаллол, сульфид натрия (Na₂S) или бутилгидрокситолуол (ВНТ).

4.8    Растворители и экстрагирующие растворители: эфир диэтиловый (не содержащий перекиси), дихпорметан, эфир петролейный, л-гексан, этилацетат или соответствующие их смеси.

4.9    Подвижные фазы для ВЭЖХ

4.9.1    Примеры смесей растворителей для нормально-фазной полупрепаративной ВЭЖХ

Примеры соответствующих смесей растворителей (даны в объемных долях) для нормальной фазы полупрепаративной ВЭ>Ю( включают:

л-гексан : 2-пропанол (98 : 2), (99 : 1) или (95 : 5);

л-гексан : изоамиаловый спирт (99 : 1);

л-гексан : 2-пропанол + тетрагидрофуран (98 : 1 : 1);

изоокган : изобутанол (99 : 1);

л-гептан : 2-пропанол (97 : 3).

4.9.2    Примеры растворителей и смесей растворителей для аналитической обращенно-фазной ВЭЖХ

Примеры соответствующих растворителей и смесей растворителей (даны в объемных долях) для аналитической обращенно-фазной ВЭЖХ включают: метанол;

метанол : вода (95 : 5) или (93 : 7);

ацетонитрил : метанол (80 : 20), (90 : 10) или (70 : 30);

ацетонитрил, хлороформ : метанол (93 : 4 : 3).

4.10    Стандартные вещества

4.10.1    Стандартное вещество эргокальциферол (витамин D₂), М(С₂₈Н₄₄0) = 396,7 г/моль. Стандартное вещество витамин D₂ должно иметь наивысшую степень чистоты из всех возможных

(массовая доля более 98 %) и должно храниться в соответствии с инструкциями изготовителя (в темном месте, обычно при температуре ниже 4 °С).

4.10.2    Стандартное вещество холекальциферол (витамин D₃), М(С₂₇Н₄₄0) = 384,6 г/моль. Стандартное вещество витамин D₃ должно иметь наивысшую степень чистоты из всех возможных

(массовая доля более 98 %) и должно храниться в соответствии с инструкциями изготовителя (в темном месте, обычно при температуре ниже 4 °С).

4.11    Исходные растворы

4.11.1 Исходный раствор витамина D₂

Взвешивают 100 мг витамина D₂ (4.10.1) с точностью до 1 мг и помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в этаноле (4.4) и этанолом доводят раствор до метки. Такой раствор содержит 1 мг/мл витамина D₂. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре ниже 4 °С. ¹

4.13.2 Внутренний стандартный раствор витамина D₃

Отмеряют пипеткой 1 мл исходного раствора витамина D₃ (4.12.2) и помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в этаноле (4.4) и доводят этанолом раствор до метки. Раствор готовят в день использования.

Примечание - При определении витамина D₃ витамин D2 используется в качестве внутреннего стандартного вещества. При определении витамина D2 витамин D₃ используется в качестве внутреннего стандартного вещества.

4.14    Полупрепаративный стандартный раствор витамина D₂ и витамина D₃

Отмеряют пипеткой 5 мл стандартного раствора витамина D₂ (4.12.1) и 5 мл стандартного раствора витамина D₃ (4.12.2) в колбу ротационного испарителя и осторожно удаляют растворитель (при температуре не выше 40 °С). Повторно растворяют остатки в 100 мл подвижной фазы полупре-паративной ВЭЖХ (4.9.1).

В случае необходимости концентрацию полупрепаративного стандартного раствора можно изменять в зависимости от системы ВЭЖХ (5.4 и 5.5).

4.15    Аналитический стандартный раствор витамина D₂ и витамина D₃

Пипеткой переносят 5 мл стандартного раствора витамина D₂ и 5 мл стандартного раствора витамина D₃ в колбу ротационного испарителя и тщательно удаляют растворитель (при температуре не выше 40 °С). Повторно растворяют остатки в 50 мл подвижной фазы аналитической ВЭЖХ (4.9.2).

5    Аппаратура

5.1    Общие положения

Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:

5.2    UV-спектрометр, предназначенный для измерения при длине волны 265 нм.

5.3    Ротационный испаритель с водяной баней и вакуумным устройством.

Примечание - Для заполнения вакуума рекомендуется использовать азот.

5.4    Полупрепаративная система ВЭЖХ, состоящая из насоса, приспособления для инжектирования пробы, детектора ультрафиолетового излучения, приспособлений для сбора установленных кратных порций элюента колонки и самописца или интегратора.

5.5    Аналитическая система ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для инжектирования пробы, UV-детекгора и самописца интегратора или аналогичного устройства для сбора данных.

5.6    Колонки ВЭЖХ

5.6.1    Колонка полупрепаративной нормальной фазы, например силикагелевая или с циано-аминовой сшивкой, размер частиц - 5 мкм, диаметр - от 4,0 до 8,0 мм, длина - от 250 до 300 мм. Более подробная информация приведена в приложении А.

5.6.2    Колонка аналитическая обращенно-фазная, например, с обращенной фазой С₁₈, размер частиц - 5 мкм, диаметр - от 4,0 до 4,6 мм, длина - 250 мм. Более подробная информация приведена в приложении А.

5.6.3    Наполнители

Можно использовать другие размеры частиц и параметры колонки, чем указанные в настоящем стандарте, но аналитик должен быть уверен в том, что обеспечивается необходимое отделение витаминов D от примесей и что будут получены эквивалентные результаты.

5.7    Фильтровальное устройство

Фильтровальные устройства в крупногабаритном или малогабаритном исполнении для фильтрования, соответственно, подвижных фаз ВЭЖХ и растворов проб, имеющие, например, поры размером приблизительно 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрование подвижной фазы, а также раствора пробы через мембранный фильтр перед использованием или инжектированием обычно увеличивает срок службы колонок.

6    Проведение анализа

6.1 Общие положения

Витамин D₂ и витамин D₃ чувствительны к ультрафиолетовому излучению и окисляющим воздействиям (например, воздействию атмосферного кислорода). Поэтому необходимо исключить ультра- ²

СТБ EN 12821-2012

фиолетовое излучение, используя лабораторную посуду из янтарного стекла, алюминиевую фольгу или материалы, поглощающие UV-излучение. К растворам, содержащим экстрагированные витамины, следует добавлять антиокислительные реагенты, а также использовать ток азота. Растворители должны испаряться при пониженном давлении с использованием ротационного испарителя при температуре не выше 40 °С.

6.2    Подготовка пробы для анализа

Анализируемую пробу гомогенизируют. Крупный материал полностью измельчают и гомогенизируют в блендере для пищевых продуктов. Чтобы проба в течение длительного времени не подвергалась воздействию высоких температур, в целях предосторожности ее заранее охлаждают. После этой подготовки следует незамедлительно проводить анализ пробы. Пробы следует защищать от света.

6.3    Приготовление анализируемого раствора пробы

6.3.1 Омыление

Навеску исследуемого образца массой 10 - 30 г помещают в колбу, добавляют этанол (4.4), воду, антиокислительный реагент (4.7) и раствор гидроксида калия (4.6), хорошо перемешивают. Омыление проводят в токе азота. Антиокислительные реагенты следует добавлять перед добавлением раствора гидроксида калия. Можно также добавлять сульфид натрия (4.7) во избежание окислительных каталитических воздействий от следов металлов.

При определении витамина D₃ в колбу для омыления добавляют пипеткой соответствующее количество внутреннего стандартного раствора витамина D₂ (4.13.1). Количество добавленного внутреннего стандартного раствора витамина D₂ должно соответствовать количеству витамина D₃, ожидаемого в пробе. Если определяют содержание витамина D₂, тогда в качестве внутреннего стандарта добавляют стандартный раствор витамина D₃ (4.13.2).

В ходе выполнения процедуры анализа следует производить отбор пробы, которая не содержит внутренний стандарт, чтобы не происходило наложения матрицы пробы во время удерживания внутреннего стандарта.

В таблице 1 приведены примеры применяемых количественных соотношений реактивов:

Таблица 1 - Примеры количественных соотношений реактивов

Проба Этанол Пирогаллол Аскорбиновая кислота/ аскорбат натрия Гидроксид калия От 10 до 30 г 100 мл От 0,5 до 1 г От 1,0 до 2,5 г 50 мл раствора 50 г/100 мл

Обычное время омыления составляет от 20 до 45 мин при температурах от 70 °С до 100 °С. Омыление можно проводить также в течение ночи (примерно 16 ч) при комнатной температуре, при этом остальные условия должны остаться неизменными.

Если после омыления и охлаждения на поверхности омыленной смеси присутствует жир или масло, то необходимо добавить дополнительное количество раствора гидроксида калия в этаноле и увеличить время омыления.

Примечание - Условия, подходящие для омыления пробы маргарина и пробы сухого молока, приведены в приложении В.

6.3.2    Экстрагирование

Во избежание образования эмульсий в подвергнутый омылению раствор пробы следует добавить столько воды, чтобы соотношение спирта и воды в конечном растворе составляло 1:1.

Экстрагируют витамины D₂ и D₃ из охлажденной омыленной смеси, используя подходящий растворитель или смесь растворителей (4.8) и повторяют данную процедуру от двух до четырех раз с объемами в диапазоне от 100 до 200 мл. Промывают водой объединенные экстракты до нейтральной реакции pH (обычно 5 раз с объемами от 50 л до 100 мл).

Примечание - Некоторые методы предписывают промывание до нейтральной реакции 3%-ным или 5%-ным раствором гидроксида калия в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, которому приданы буферные свойства раствором ацетата натрия (2,6 моль/л) (pH = 7) или похожими смесями. Условия экстрагирования, которые оказались подходящими для пробы маргарина и пробы сухого молока, приведены в приложении В.

6.3.3    Концентрирование

Экстракты проб выпаривают в ротационном испарителе (5.3) при сниженном давлении и максимальной температуре не выше 40 °С. Перед выпариванием в экстракт пробы рекомендуется доба-

5

вить антиокислительный реагент (например, 2 мл бутилгидрокситолуола (ВНТ) в л-гексане с концентрацией 1 мг/мл).

В концентрированный экстракт пробы необходимо добавлять абсолютный этанол (4.3) или безводный сульфат натрия (4.5), чтобы способствовать удалению следов воды (азеотропная дистилляция).

На данной стадии проведения анализа с целью исключения потенциальных посторонних воздействий можно провести дополнительную очистку экстракта пробы. В этом случае необходимо использовать полностью валидированную (утвержденную) методику.

Примечание - Приложение Е устанавливает три различных метода дополнительной очистки. Всегда полезно комбинировать метод дополнительной очистки с использованием колоночной хроматографии (Е.2) и метод с использованием SPE (solid phase extraction - твердофазная экстракция) (Е.З), как было показано для пищевых продуктов, например для маргарина и растительного масла. Метод дополнительной очистки с использованием препаративной тонкослойной хроматографии TLC (thin layer chromatography) (Е.1) предпочтительнее использовать для кормов и добавок, например, в таблетках или капсулах. При испытаниях добавок он может применяться при необходимости с Е.З.

6.3.4    Разведение

Остаток повторно растворяют в небольшом заданном количестве растворителя, который совместим с полупрепаративной системой ВЭЖХ. Добавление небольшого количества безводного сульфата натрия устраняет оставшиеся следы воды.

6.4    Калибровка

Для калибровки полупрепаративной (5.6.1) и аналитической (5.6.2) систем ВЭЖХ, а также для оценки пригодности этих систем используют стандартные растворы витамина D (4.12.1) и витамина D₃ (4.12.2).

6.5    Обеспечение пригодности системы ВЭЖХ

Хроматографируют смешанный полупрепаративный стандартный раствор витаминов D₂ и D₃ (4.14), используя полупрепаративную систему ВЭЖХ (5.6.1) до тех пор, пока единственный пик витамина D не будет элюирован с воспроизводимым временем удержания. Это позволяет точно установить диапазон фракции витамина D из экстрактов пробы.

Хроматографические условия полупрепаративной ВЭЖХ должны устанавливаться так, чтобы достигалось оптимальное отделение витамина D от токоферолов и других примесей из исходного пищевого продукта. Примеры хроматограмм указаны в приложении С.

Хроматографируют смешанный аналитический стандартный раствор витаминов D₂ и D₃ (4.15), используя аналитическую систему ВЭЖХ, и настраивают хроматографические условия так, чтобы разделение витаминов D₂ и D₃ составляло как минимум 98 % (т. е. коэффициент разделения должен составлять более 1,0) и чтобы эти витамины были отделены от всех примесей из исходного пищевого продукта.

6.6    Определение

6.6.1    Полупрепаративная ВЭЖХ

Инжектируют кратную порцию концентрированного экстракта пробы в полупрепаративную систему ВЭЖХ (5.6.1) и собирают фракцию витамина D в заданном отрезке диапазона. Временной интервал для сбора фракции должен быть заранее установлен с использованием стандартного раствора витамина D (6.5). Диапазон должен быть достаточно широким для сбора всех фракций витамина D, но при этом достаточно узким для исключения попадания токоферолов или других примесей.

Типичная полупрепаративная хроматограмма показана в приложении С.

6.6.2    Аналитическая ВЭЖХ

Фракцию из заданного отрезка диапазона для полупрепаративной ВЭЖХ выпаривают до сухого состояния и повторно растворяют в растворителе, совместимом с подвижной фазой аналитической ВЭЖХ.

Кратные порции экстракта пробы инжектируют в аналитическую систему ВЭЖХ, после чего идентифицируют пики витаминов D₂ и D₃ (6.6.3). Пики витаминов D₂ и D₃ должны быть отделены от примесей из исследуемой пробы пищевого продукта.

Типичная аналитическая хроматограмма показана в приложении С.

6

СТБ EN 12821-2012

6.6.3    Идентификация

Идентифицируют витамины D₂ и D₃, сравнивая время удержания на хроматограммах анализируемого раствора пробы со временем удержания стандартных растворов при одинаковых хроматографических условиях (6.5). Использование детектора диодной матрицы позволяет тщательно проверить ультрафиолетовые спектры пиков витамина D и оценить чистоту пиков. Эту проверку можно также осуществлять путем повторной хроматографии экстракта пробы при различных длинах волн UV-детекгора.

6.6.4    Количество определений

Следует проводить не менее двух независимых определений.

6.7 Метод внутреннего стандарта и коэффициент чувствительности

Рассчитывают коэффициент чувствительности R_f витамина D₃ в сравнении с D₂ по методу внутреннего стандарта, используя заданные стандартные концентрации (4.13) по формуле

^етп₃ Ч Р

ⁿSTD2 4PSTD3

где j4_Std3 - полученная для стандартного раствора витамина D₃ площадь пика или высота пика; A_STD2 - полученная для стандартного раствора витамина D₂ площадь пика или высота пика; Pstd2 - массовая конце трация витамина D₂ в стандартном растворе, мкг/мл;

Pstd3 - массовая конце трация витамина D₃ в стандартном растворе, мкг/мл.

7 Расчет

Массовую долю витамина D₃ w_D3, мкг/100 г, рассчитывают по формуле

_w _^sd₃4/_s4100 ⁰³ A_SD24R_f4 т’

где Is - масса в испытуемом образце внутреннего стандарта витамина D₂, мкг; т - масса пробы, взятой для омыления, г;

R_f - см. уравнение (3); j4_SD3 - полученная для витамина D₃ площадь пика или высота пика в растворе пробы; ^sd2 ~ полученная для витамина D₂ площадь пика или высота пика в растворе пробы.

8 Прецизионность

8.1    Краткий статистический обзор

Данные прецизионности различных методов ВЭЖХ для определения витамина D₃ были получены в 1994 г. при проведении международных сличительных испытаний, организованных по Программе измерений и испытаний стандартов Европейской комиссии, на пробе маргарина (сертифицированный референсный материал - CRM 122) и на пробе сухого молока (CRM 421) и позволили получить статистические данные, указанные в приложении D.

Данные по прецизионности, полученные на овсяной каше и сухом молоке, были получены при проведении межлабораторных сличений посредством метода, использующего расчеты, основанные на внешнем стандарте в соответствии с ISO 5725:1986, и приведены в приложении D.

Данные по прецизионности, полученные на молоке, жидких молочных смесях для питания грудных детей, растительном масле, маргарине, молочных смесях для питания грудных детей и рыбьем жире, были установлены в межлабораторных сличениях в соответствии с Руководящими указаниями АОАС по процедурам совместных испытаний для утверждения метода анализа (см. приложение D).

Данные, полученные в ходе проведения этих сличительных испытаний могут оказаться неприменимыми для других диапазонов концентрации определяемого вещества и матриц проб, отличающихся от приведенных в приложении D.

8.2    Повторяемость (сходимость)

Абсолютная разность между двумя отдельными результатами, полученными одним наблюдателем на идентичном анализируемом материале с помощью одной и той же аппаратуры в течение как можно более короткого отрезка времени, не должна превышать значения предела сходимости г более чем в 5 % случаев.

7

СТБ EN 12821-2012

Это следующие значения: Маргарин: х =12,3 мкг/100 г г = 2,32 мкг/100 г Сухое молоко: х =14,3 мкг/100 г г = 2,09 мкг/100 г Молоко: х = 0,418 мкг/100 г г = 0,054 мкг/100 г Жидкие молочные смеси: х =1,38 мкг/100 г г = 0,23 мкг/100 г Растительное масло: х = 4,61 мкг/100 г г = 0,96 мкг/100 г Маргарин: х = 8,39 мкг/100 г г = 1,52 мкг/100 г Молочные смеси: х = 10,1 мкг/100 г г = 0,7 мкг/100 г Рыбий жир: х =11,6 мкг/100 г г = 0,7 мкг/100 г 8.3 Воспроизводимость Абсолютная разность между двумя отдельными результатами, полученными двумя лаборатори ями на идентичном анализируемом материале, не должна превышать значения предела воспроизводимости R более чем в 5 % случаев. Это следующие значения: Маргарин: х =12,3 мкг/100 г R = 2,66 мкг/100 г Сухое молоко: х =14,3 мкг/100 г R = 2,21 мкг/100 г Молоко: х = 0,418 мкг/100 г f? = 0,106 мкг/100 г Жидкие молочные смеси: х =1,38 мкг/100 г R = 0,47 мкг/100 г Растительное масло: х = 4,61 мкг/100 г R = 3,11 мкг/100 г Маргарин: х = 8,39 мкг/100 г R = 1,60 мкг/100 г Молочные смеси: х = 10,1 мкг/100 г R = 2,0 мкг/100 г Рыбий жир: х =11,6 мкг/100 г R = 5,8 мкг/100 г

9 Протокол анализа

Протокол анализа должен содержать как минимум следующие данные:

a)    всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b)    ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c)    результаты и единицы измерения, в которых они выражены;

d)    дату и метод отбора проб (если он известен);

e)    дату поступления проб;

f)    дату проведения анализа;

д) любые особенности, отмеченные в ходе проведения анализа;

h) любые наблюдения, не установленные настоящим методом или рассматриваемые в качестве дополнительных, которые могут повлиять на результаты.

8

1

2