рд

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ 52.18.682-

2006

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Определение токсичности вод и донных отложений

Методика выполнения измерений индекса токсичности методом биотестирования по реакции перекисного окисления липидов липосом

2007

РД

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ 52.18.682-

2006

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Определение токсичности вод и донных отложений

Методика выполнения измерений индекса токсичности методом биотестирования по реакции перекисного окисления липидов липосом

2007

Таблица1

Наименование объекта Диапазон измерения индекса токсичности Показатель повторяемости (относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости) аг. % Показатель воспроизводимости (относительное среднее квадратическое отклонение воспроизводимости) о., % Поверхностная вода Очищенная сточная вода Донные отложения (водная вытяжка) От 10 до 300 9 13

5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, устройства, материалы и реактивы

5.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, устройства, материалы:

весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 100 г и пределом допускаемой погрешности ± 3 мг - по ГОСТ 24104-2001;

спектрофотометр любого типа, имеющий спектрофотометрический диапазон от 400 до 800 нм (далее - спектрофотометр);

холодильник бытовой, обеспечивающий температурные режимы от минус (18±1)°Сдо плюс4°С;

- сушильный электрический шкаф общелабораторного назначения с температурой нагревания от 40 °С до 180 °С;

приборы и устройства для отбора проб воды объемом от 500 до 1000см³ -по ГОСТ 17.1.5.04-81;

пробоотборник донных отложений любого типа; баня водяная любого типа;

микроцентрифуга лабораторная - по ТУ 5.375-4261-76; шейкер пробирочный регулируемый на 30 мест; колбы исполнения 2, 2-го класса точности, вместимостью 25; 100; 1000 см³ - по ГОСТ 1770-74;

4

РД 52.18.682-2006

пипетки типа 1, исполнения 1, 1-го класса, вместимостью 0,5; 1; 2; 5; 10 см³ - по ГОСТ 29227-91;

-    пипет-дозатор П1 объемом 0,02 см³,0,05 см³,0,1 см³,0,5 см³ - по ТУ 64-1-3329-81;

пробирки исполнения 1, вместимостью 10 см³ с ценой деления 0,2 см³ - по ГОСТ 1770-74;

-    пробирки типа П1 диаметром 16 мм, высотой 150 мм - по ГОСТ 25336-82;

склянки и банки стеклянные с винтовым горлом, с прокладкой и крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 500; 1000 см³ - по ТУ 6-19-6-70;

флаконы и банки цилиндрические полиэтиленовые с навинчивающимися крышками для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 100; 250; 500; 1000 см³ - по ТУ 6-19-45-74;

ступка № 4 с наибольшим наружным диаметром 110 мм - по ГОСТ 9147-80;

-    сита капроновые (хозяйственные) с диаметром отверстий (1 ± 0,1) мм;

воронки лабораторные типа В, диаметром 75 мм, высотой 110 мм-по ГОСТ 25336-82;

фильтры обеззоленные «синяя лента» - по ТУ 6-09-1678-83; карандаш - по ТУ 480-11-59;

Примечание - Допускается использование других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, устройств и материалов, в том числе импортного, с характеристиками, указанными в 5.1.

5.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:

-    спирт этиловый ректификованный технический - по ГОСТ 18300-87;

аскорбиновая кислота - по Р.73.941.9;

вода дистиллированная - по ГОСТ 6709-72;

железо (II) сернокислое 7-водное хч - по ГОСТ 4148-78;

ионол (4-метил-2,6-дитретбутилфенол) хч (импортный препарат);

калий двухромовокислый хч - по ГОСТ 4220-75;

кислота серная хч - по ГОСТ 4204-77;

-    лецитин яичный ч - по ТУ 6-09-10-289-77; малеиновая кислота чда - по ГОСТ 9803-75; натрия гидроокись хч - по ГОСТ 4328-77; тиобарбитуровая кислота чда - по ТУ 6-09-2538-77;

5

РД 52.18.682-2006

трис(оксиметил)амююметан гидрохлорид ч - по ТУ 6-09-2477-78;

- трихлоруксусная кислота чда - по ТУ 6-09-1926-77; хлороформ чда - по ГОСТ 20015-88.

Примечание - Допускается использование других реактивов, в том числе импортных, с квалификацией не ниже указанной в 5.2.

6 Принцип метода

6.1 Методика определения токсичности методом биотестирования основана на проведении реакции ПОЛ, инициированной железо-аскор-батной системой, в растворах липосом, приготовленных на КВ и ТВ. В результате реакции образуется конечный продукт перекисного окисления - малоновый диальдегид (далее - МДА), который при добавлении тиобарбитуровой кислоты (далее - ТБК) и осуществлении ТБК-реакции превращается в окрашенный триметиновый комплекс. Схема реакции представлена на рисунке I.

Примечание-В качестве КВ используют дистиллированную воду.

о о о II II II с С С О о / \ / \ / \ \\ У HN СН HN С - СН - СН - СН - С NH С-СН2-С +2 1 II 1 II 1 1 / \ С С-ОН — С с-он o=c c=s н н /\ / //\ / \ /

S N    S    N    N

	н	н н
МДА	ТБК	Триметиновый комплекс

Рисунок 1 - Схема реакции образования триметинового комплекса

6.2    ТБК-реакцию осуществляют при температуре от 90 °С до 100 °С.

6.3    Триметиновый комплекс поглощает при длине волны Х= 532 нм с молярным коэффициентом экстинции е = 1,56 Ю’моль^дм^см*'.

6.4    Критерием токсичности ТВ является величина индекса токсичности, которая рассчитывается как соотношение разности оптических плотностей получившихся растворов ТВ и КВ до и после проведения реакции ПОЛ (раздел 12).

6

РД 52.18.682-2006

Если величина индекса токсичности менее 80 % или более 120 %, то ТВ оказывает токсическое воздействие (является токсичной).

Если величина индекса токсичности находится в интервале значений от 80 % до 120 %, то ТВ не оказывает токсического воздействия.

7    Требования безопасности и охраны окружающей среды

7.1    При проведении биотестирования следует соблюдать требования безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007 и правилами [3].

7.2    Помещение, в котором проводится биотестирование, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией согласно ГОСТ 12.4.021, должно соответствовать требованиям пожарной безопасности согласно ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения согласно ГОСТ 12.4.009.

7.3    Безопасность при работе с электроустановками должна обеспечиваться согласно ГОСТ 12.1.019.

7.4    Методика определения токсичности экологически безопасна.

8    Требования к квалификации аналитика

К проведению биотестирования допускаются лица (инженер, техник или лаборант со средним специальным образованием), прошедшие соответствующую подготовку, освоившие методические приемы водной токсикологии, имеющие навыки работы в химической лаборатории и изучившие руководство по эксплуатации спектрофотометра.

9    Условия проведения биотесгирования

При проведении биотестирования должны соблюдаться следующие условия:

-    температура окружающего воздуха ................................(20    ±    5)    °С;

-    атмосферное давление .. от 84 до 106 кПа (от 630 до 795 мм рт.ст);

-    относительная влажность окружающего воздуха от 30 % до 80 %;

-    напряжение питающей сети переменного тока ............220    ±    22)    В;

-    частота переменного тока ................................................(50    ±    2)    Гц.

7

РД 52.18.682-2006

10 Подготовка к проведению биотестирования

10.1    Подготовка посуды для отбора, хранения проб и проведения бнотестирования

10.1.1    Для отбора и хранения проб должна использоваться посуда из пластмассы, а при наличии в воде нефти, углеводородов, моющих средств и пестицидов - посуда из темного стекла.

10.1.2    Посуду для отбора, хранения проб и проведения биотестирования подготавливают следующим образом:

промывают хромовой смесью; тщательно моют водопроводной водой;

3-4 раза ополаскивают дистиллированной водой; посуду для отбора проб сушат на воздухе; посуду для биотестирования, за исключением мерной, сушат в сушильном шкафу при температуре (160 ± 10) °С не менее 1 ч.

10.1.3    Подготовленную согласно 10.1.2 посуду закрывают стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками и хранят в защищенных от проникновения пыли местах.

10.2 Отбор, транспортирование и хранение проб

10.2.1    Отбор, транспортирование и хранение проб воды

10.2.1.1    Пункты наблюдения и места отбора проб воды устанавливают в соответствии с ГОСТ 17.1.3.07 и методическими указаниями [1].

Примечания

1    Отбор проб поверхностных и очищенных сточных вод следует производить в местах наибольшего перемешивания.

2    Пробы воды на очистных сооружениях следует отбирать до системы хлорирования.

10.2.1.2    Отбор проб воды следует производить в соответствии с ГОСТ Р 51592, методическими указаниями [1] и рекомендациями [4].

10.2.1.3    Пробы воды отбирают с помощью пробоотборников, изготовленных согласно ГОСТ 17.1.5.04, в посуду из стекла или пластмассы вместимостью от 500 до 1000 см³.

10.2.1.4    Перед отбором проб воды посуду не менее трех раз ополаскивают водой из водоема (водотока), из которого предстоит отбирать пробу воды.

10.2.1.5    На посуду, содержащую пробу воды, наклеивают этикетку с указанием номера пробы воды, места и даты отбора.

8

РД 52.18.682-2006

10.2.1.6    Не допускается консервирование проб воды, предназначенных для исследования на токсичность.

10.2.1.7    Биотестирование проб воды проводят не позднее 24 ч после их отбора.

10.2.1.8    При невозможности проведения анализа в срок, указанный в 10.2.1.7 пробы воды охлаждают до температуры плюс (4 ± 2) °С и хранят поверхностные воды не более 5 сут, очищенные сточные воды - нс более 2 сут.

10.2.1.9    Допускается замораживание проб воды при температуре минус (18 ± 2) °С и их хранение не более 14 сут.

Примечание - Следует помнить, что после размораживания токсичность воды может измениться.

10.2.1.10    Перед биотестированием предварительно охлажденные или замороженные пробы воды доводят до температуры (20 ± 5) °С.

10.2.2 Отбор, транспортирование и хранение проб донных отложений

10.2.2.1    Отбор проб донных отложений проводят согласно ГОСТ 17.1.5.01.

10.2.2.2    Пробы донных отложений, отобранные для биотссти-рования, помещают в пластиковые мешки или в специальную посуду из стекла или полиэтилена, в которых их хранят и транспортируют.

10.2.2.3    Биотестирование проб донных отложений проводят не позднее 24 ч после отбора.

10.2.2.4    При невозможности проведения биотестирования в срок менее 24 ч, пробы донных отложений охлаждают при температуре плюс (4 ± 2) °С и хранят в холодильнике.

10.3 Подготовка проб донных отложений для биотестирования

10.3.1    Приготовление воздушно-сухой пробы производят следующим образом:

-    пробу донных отложений выдерживают в сушильном шкафу при температуре (105 ± 5) *С не менее 1 сут;

-    высушенную пробу донных отложений растирают в ступке и просеивают через сито с диаметром отверстий (1 ±0,1) мм.

10.3.2    Для приготовления водной вытяжки к 50 г воздушно-сухой

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН    Государственным учреждением «Научно-производственное объединение «Тайфун», Институтом биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

2    РАЗРАБОТЧИКИ И.В. Семенова, канд. биол. наук, Л.С. Эрнестова, доктор хим. наук, Е.В. Штамм, доктор хим. наук, С.Н. Харитонова

3    СОГЛАСОВАН с начальниками УМЗА Росгидромета 19.06.2006 и ЦКБ ГМП Росгидромета 06.02.2006

4    ОДОБРЕН    Центральной методической комиссией Росгид

ромета 16.04.2003, Протокол №1

5 УТВЕРЖДЕН    Заместителем Руководителя Федеральной службы по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды 20.06.2006

6    СВИДЕТЕЛЬСТВО ОБ АТТЕСТАЦИИ МВИ выдано ГУ «НПО «Тайфун» от 03.07.2005 №5.18-2005

7    ЗАРЕГИСТРИРОВАН ЦКБ ГМП за номером РД 52.18.682 - 2006

8    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

II

РД 52.18.682-2006

Содержание

Введение.......................................................................................................V

1    Область применения..................................................................................1

2    Нормативные ссылки.................................................................................1

3    Термины и определения ..........................................................................2

4    Характеристики погрешности измерений................................................

35 Средства измерений, вспомогательное оборудование, устройства,

материалы и реактивы...............................................................................4

6    Принцип метода.........................................................................................6

7    Требования безопасности и охраны окружающей среды.......................7

8    Требования к квалификации аналитика...................................................7

9    Условия проведения биотестирования.....................................................7

10 Подготовка к проведению биотсстирования ........................................8

10.1    Подготовка посуды для отбора, хранения проб и проведения

биотестирования..............................................................................8

10.2    Отбор, транспортировка и хранение проб ....................................8

10.3    Подготовка проб донных отложений для биотестирования........9

10.4    Приготовление и хранение растворов .........................................10

10.5    Подготовка спектрофотометра.....................................................12

11    Проведение биотсстирования...............................................................12

12    Вычисление результатов биотестирования.........................................14

12.1    Вычисление индекса токсичности пробы....................................14

12.2    Проверка приемлемости результатов параллельных

определений....................................................................................14

12.3    Представление результатов...........................................................16

12.4    Определение токсичности пробы.................................................16

III

РД 52.18.682-2006

13 Контроль качества результатов измерений.........................................16

13.1    Перечень процедур контроля качества результатов

измерений и периодичность их проведения................................15

13.2    Определение диапазона реагирования тест-системы

на эталонный токсикант...............................................................17

13.3    Оперативный контроль внутрилабораторной

прецизионности.............................................................................17

Приложение А (рекомендуемое). Форма рабочего журнала регистрации

результатов при проведении биотестирования проб.......................19

Библиография..............................................................................................20

IV

РД 52.18.682-2006

Введение

В настоящее время наблюдение за откликом биоценоза на действие возмущающих факторов (физических, гидрологических, химических и др.) рассматривается как обязательная составляющая экологического гидромониторинга. Для оценки степени проявления токсических эффектов, своевременного выявления источников опасного загрязнения объектов окружающей среды, способных оказать неблагоприятное действие на живые организмы, определения интенсивности их воздействия и оценки возможных экологических последствий, используют методы биотестирования с применением различного рода тест-объектов. Требования к режимным наблюдениям за загрязнением поверхностных вод суши сети Государственной службы наблюдений (ГСН) Росгидромета предусматривают оценку токсикологического состояния водных объектов с использованием биотестирования [1].

В Рекомендации [2] включено порядка 6-8 различных методов биотестирования, а в мировой практике их разработано более 100. Однако из-за сложного состава водной среды и большого разнообразия возможных откликов со стороны гидробиоценоза на антропогенное воздействие проблема разработки чувствительных и информативных методов биотестирования по-прежнему остается одной из актуальных задач водной токсикологии. При этом с одной стороны, целесообразно вести поиск таких тест-систем, которые могут использоваться в качестве экспресс-методов для оценки состояния свежеотобранных проб воды, с другой стороны, используемые тесты должны быть чувствительными и интегральными, что позволяло бы судить об общей степени загрязнения водной среды.

Известно, что молекулярно-клеточный уровень наиболее чувствителен к изменениям химического состава окружающей среды. Поражение клеточных мембран лежит в основе токсического действия многих химических и физических факторов. Стабильность мембранных структур во многом определяется процессами перекисного окисления ненасыщенных остатков жирных кислот фосфолипидов, являющихся основным компонентом биомембран. Простейшей моделью клеточных мембран являются липосомы, состоящие из природных фосфолипидов. Перекис-ное окисление липидов липосом - это неферментативный свободно-радикальный процесс, скорость которого зависит от температуры, состава жирных кислот, а также от веществ, присутствующих в среде инкубации. В поверхностной воде, очищенной сточной воде и в донных отложениях

могут присутствовать вещества, способные как ускорять, так и тормозить реакцию окисления липидов. В зависимости от активности и соотношения этих веществ вода может обладать либо прооксидантными, либо антиоксидантными свойствами. В связи с этим изменение скорости пе-рскисного окисления липидов липосом под влиянием компонентов поверхностных вод, очищенных сточных вод и водных вытяжек донных отложений можно рассматривать как чувствительную тест-реакцию для оценки их токсичности.

VI

РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Определение токсичности вол и донных отложений

Методика выполнения измерений индекса токсичности методом биотестирования по реакции перекисного окисления липидов липосом

Дата введения - 2008-01-01

1    Область применения

1.1    Настоящие методические указания устанавливают методику определения токсичности проб поверхностных вод, очищенных сточных вод и донных отложений (далее - проба) методом биологического тестирования с использованием реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) липосом.

1.2    Методика определения токсичности проб основана на выполнении измерений индекса токсичности. Диапазон измерения индекса токсичности составляет от 10 % до 300 %.

Примечание - При биологическом тестировании проб с индексом токсичности менее 10 % и более 300 % необходимо проводить соответствующее разбавление пробы контрольной водой (КВ).

1.3    Настоящие методические указания предназначены для использования в лабораториях, выполняющих измерения в области мониторинга загрязнения окружающей среды, контроля качества поверхностных и очищенных сточных вод и для проведения специальных токсикологических исследований.

2    Нормативные ссылки

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требова-

ния

1

РД 52.18.682-2006

ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 ССБТ. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 17.1.3.07-82 Охрана природы. Гидросфера. Правила контроля качества воды водоемов и водотоков

ГОСТ 17.1.5.01-80 Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб донных отложений водных объектов для анализа на загрязненность

ГОСТ 19179-73 Гидрология суши. Термины и определения

ГОСТ 27065-86 Качество вод. Термины и определения

ГОСТ Р 51592-2000 Вода. Общие требования к отбору проб

Примечание - Ссылки на остальные стандарты приведены в разделе S.

3 Определения

В настоящих методических указаниях применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    биологическое тестирование воды (далее - биотестирование): Оценка качества воды по ответным реакциям водных организмов, являющихся тест-объектами (ГОСТ 27065).

3.2    биотест: Совокупность приемов получения информации о токсичности воды (донных отложений) для гидробионтов на основании регистрации реакций тест-объекта [2].

3.3    донные отложения: Донные наносы и твердые частицы, образовавшиеся и осевшие на дно в результате внутриводоемных физико-химических процессов, в которых участвуют вещества, как естественного происхождения, так и антропогенного.

3.4    индекс токсичности: Показатель, на основании которого оценивают степень загрязненности пробы и дают оценку ее токсичности.

3.5    инкубация: Время воздействия тестируемой воды на тест-объект.

3.6    критерий токсичности: Признак (показатель), на основании которого оценивают токсичность [2].

2

РД 52.18.682-2006

3.7    липиды: Жирные кислоты и их производные.

3.8    липосома: Простейшая модель клеточной мембраны (полая частица, содержимое которой ограничено липидной мембраной).

3.9    поверхностные воды: Воды, находящиеся на поверхности суши в виде различных водных объектов (ГОСТ 19179).

3.10    очищенная сточная вода: Вода, отводимая после использования в бытовой и производственной деятельности человека, прошедшая очистку и предназначенная для сброса в естественный или искусственный водоемы (реки, моря, озера, водохранилища).

3.11    тест-объект: Биологическая система, которую используют при биотестировании.

3.12    тест-реакция: Реакция тест-объекга, используемая для определения токсичности водной среды [2].

3.13    тестируемая вода; ТВ: Проба воды или водной вытяжки донных отложений, используемая для биотестирования.

3.14    токсикологический эксперимент: Эксперимент, в ходе которого оценивают влияние ria тест-объект ТВ. Токсикологический эксперимент состоит из двух серий: опыт (с воздействием тестируемой воды) и контроль (без воздействия, но в тех же условиях) [2].

3.15    токсичность: Свойство воды, обусловленное наличием в ней токсичных веществ и степень проявления ядовитого действия различных соединений и их смесей, которые повреждают, ингибируют, стимулируют, вызывают генетические изменения или убивают организмы в воде, донных отложениях, почве, воздухе.

3.16    эталонный токсикант: Вещество с известными токсическими свойствами, используемое для определения чувствительности тсст-объ-екта и для проверки пригодности тест-объекта к биотестированию.

4 Характеристики погрешности измерений

Значения показателей повторяемости и воспроизводимости методики измерения индекса токсичности при доверительной вероятности Р=0,95 соответствуют характеристикам, приведенным в таблице 1.

3