Поправка к ГОСТ Р 52174-2003

ГОСТ Р 52174-2003

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биологическая безопасность

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 «Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля»

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. № 403-ст

3    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4    ИЗДАНИЕ (июнь 2005 г.) с Поправкой (ИУС 9-2005)

© ИПК Издательство стандартов, 2004 © Стандартинформ, 2005

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

ИЗМЕНЕНИЯ, УТВЕРЖДЕННЫЕ К НАЦИОНАЛЬНЫМ СТАНДАРТАМ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

65 СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО

ОКС 65.140, 65.160, 67.060, 67.080, 67.100, 67.120, 67.140, 67.140.30, 67.160, 67.180, 67.190,

67.200, 67.220 Группа Н11, Н13, Н17, Н23,

Н31—Н34, Н36, Н41—Н43, Н51-Н56, Н62, Н65, Н68, Н72-Н74, Н81, Н97, С11, С23—С25, С32—С36, С41—С45, С52 Изменение № 1 ГОСТ Р 52174-2003 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Утверждено и введено в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метролоти от 25.12.2008 № 731-ст

Дата введения 2009—07—01

Разделы 1 (первый абзац), 5. Заменить слова: «пищевое сырье» на «продовольственное сырье»;

дополнить абзацем:

«Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением технологии FLASH изложен в обязательном приложении Д».

Пункт 4.1. Исключить слова: «или «Био-1» [23]».

Пункт 4.2. Исключить слова: «или «Евробио-ВТО» [24]».

Пункт 6.2.1 дополнить абзацем:

«6.2.1 Дополнительно готовят отрицательную контрольную пробу. Для этого в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³ помещают 50 мм³ особо чистой воды по 4.30 и 400 мм³ буфера экстракции по 6.1.8. Дальнейшее приготовление и хранение отрицательной контрольной пробы — в соответствии с требованиями 6.2.2—6.2.6 настоящего стандарта¹».

Пункт 8.1. Исключить слова: «или «Био-1» [23]».

Приложение Д изложить в новой редакции:

«Приложение Д (обязательное)

Метод идентификации генетически модифицированных источников

(ГМИ) растительного происхождения с применением технологии FLASH

Д.1 Сущность метода

Метод основан на технологии FLASH, то есть проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфической гибридизацией флуоресцентномеченых зондов в процессе амплификации и последующей детекции продуктов амплификации при помощи ПЦР-детектора «Джин». Чувствительность метода — не менее 100 копий ДНК на реакционный объем.

Д.2 Определения

Д.2.1 ПЦР-детектор «Джин»: Специализированный флуориметр, предназначенный для регистрации результатов ПЦР при использовании комплектов реагентов, основанных на принципах флуоресцентной детекции.

Д.3 Аппаратура, материалы и реактивы — в соответствии с разделом 4 настоящего стандарта со следующими дополнениями:

Д.3.1 Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин» [23].

Д.3.2 ПЦР-детектор «Джин» [24] или ПЦР-детектор «Джин-4» [25].

Д.3.3 Четыре комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК в микроцентрифужных пробирках для амплификации — «СКАН-355», «CKAH-g&s», «СКАН-ят» и «СКАН-я^Г» [26], каждый из которых включает:

-    50 микроцентрифужных пробирок для амплификации, запечатанных парафином, содержащих по 20 мм³ смеси, включающей ПЦР-бу-фер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентномеченые зонды, внутренний контрольный образец ДНК;

-    500 мм³ раствора Taq-полимеразы — одна микроцентрифужная пробирка;

-    200 мм³ буферного раствора «ПЦР-буфер» — одна микроцентри-фужная пробирка;

-    1,0 см³ минерального масла — одна микроцентрифужная пробирка;

-    положительная контрольная проба ДНК, 150 мм³ — одна микро-центрифужная пробирка.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных в приложении Д и разделе 4 настоящего стандарта.

Д.4 Отбор проб

Отбор проб — в соответствии с требованиями раздела 5 настоящего стандарта.

Д.5 Подготовка к проведению анализа

Д.5.1 Приготовление растворов

Приготовление растворов осуществляется в соответствии с 6.1 настоящего стандарта.

Д.5.2 Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК) — в соответствии с требованиями 6.2 настоящего стандарта

Д.6 Проведение анализа

Д.6.1 Растворы ДНК, подготовленные в соответствии с Д.5 и 6.2, анализируют при помощи комплектов для амплификации ДНК: «СКАН-355», «СКАН-gus», «СКАН-лог» и «СКАН-лр*» по Д.3.3.

Д.6.2 Маркируют микроцентрифужные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации по Д.3.3 в количестве, соответствующем количеству анализируемых растворов ДНК. Дополнительно маркируют:

-    две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К+» (положительный контроль);

-    две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К—» (отрицательный контроль);

-    две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «ФОН».

Д.6.3 В промаркированные микроцентрифужные пробирки по Д.6.2, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», не повреждая слой парафина, микродозатором по 4.12 настоящего стандарта вносят по 10 мм³ раствора Taq-полимеразы по Д.3.3, тщательно перемешанного на аппарате для встряхивания по 4.10 настоящего стандарта. В мик-роцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» по Д.6.2, микродозатором вносят по 10 мм³ ПЦР-буфера по Д.3.3.

Д.6.4 Во все микроцентрифужные пробирки по Д.6.3 микродозатором вносят по 20 мм³ минерального масла по Д.3.3, плотно закрывают пробирки крышками.

Д.6.5 В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», «К—» и «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм³ анализируемого раствора ДНК по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.6 В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» и «К—» по Д.6.4, не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм³ отрицательной контрольной пробы по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.7 В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, промаркированные как «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм³ положительной контрольной пробы из состава соответствующего комплекта реагентов для амплификации ДНК по Д.3.3.

Д.6.8 Все микроцентрифужные пробирки, подготовленные по Д.6.5 — Д.6.7, плотно закрывают крышками и центрифугируют на настольной микроцентрифуге по 4.8 настоящего стандарта при частоте вращения 1000 мин^-1 в течение 5—10 с и сразу же используют для проведения анализа.

Д.6.9 Все микроцентрифужные пробирки по Д.6.8 помещают в ампли-фикатор ДНК по 4.3 настоящего стандарта и проводят ПЦР по программе, указанной в таблице Д.1. При запуске программы указывают объем реакционной смеси, равный 35 мм³.

Т а б л и ц а Д.1 — Программа проведения ПЦР

Шаг программы Температура Время инкубации Число циклов 1 94 °С 1 мин 1 94 °С 5 с 2 67 °С 15 с 5 94 °С 1 с 3 67 °С 15 с 40 4 10 °С Режим хранения

Д.6.10 Все определения должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. При проведении анализа каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции — сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром по 4.14 настоящего стандарта.

Д.7 Обработка результатов анализа

Д.7.1 После прохождения реакции амплификации все микроцентри-фужные пробирки по Д.6.9 помещают в ПЦР-детектор «Джин» по Д.3.2 для проведения регистрации результатов ПЦР. В соответствии с руководством по эксплуатации к ПЦР-детектору «Джин» проводят регистрацию результатов ПЦР (пороговые значения для продукта амплификации и для внутреннего контрольного образца указаны в инструкции к комплектам реагентов для амплификации ДНК).

Д.7.2 Учет и интерпретация результатов

Д.7.2.1 Учет и интерпретация результатов анализа осуществляется автоматически при помощи компьютерной программы «Gene» [23]. Результаты анализа отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рисунок Д.1).

Д.7.2.2 За положительный результат принимают отображение символа «+» на красном фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Положительный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-355», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-яр?» для анализируемых проб, содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 355, промотора nos, гена gus, гена nptll, соответственно.

Д.7.2.3 За отрицательный результат принимают отображение символа «—» на зеленом фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Отрицательный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-355», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-яр?» для проб, не содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 355, промотора nos, гена gus, гена nptll, соответственно.

Пример оформления протокола испытания — в соответствии с приложением Г настоящего стандарта.

Д.7.2.4 За недостоверный результат принимают отображение символа «нд» на оранжевом фоне или символа «?» на желтом фоне (на рисунке Д.1 желтый фон отсутствует) напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы.

Это может быть вызвано несоблюдением условий анализа или несоблюдением условий выделения ДНК. В случае получения недостоверного результата определение повторяют.

Д.7.2.5 В случае отображения символа «+» на красном фоне напротив обозначения отрицательной контрольной пробы в графе «Результат» таблицы, результаты анализа считают ложноположительными.

Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае определение повторяют с заменой реактивов на свежеприготовленные.

Д.8 Требования безопасности

При проведении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с разделом 9 настоящего стандарта». Стандарт дополнить приложением — Е:

«Приложение Е (справочное)

Библиография

[1] Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [2] ТУ 9443-001-02699501—2003 [3]    ТУ 9452-001-4648062—98 [4]    ТУ 42-619-61 [5]    Корпорация «Эппендорф», кат. № 5425 000.014 [6]    Корпорация «Хеликон», кат. № MSH-300 [7]    Корпорация «Хеликон», кат. № FV-2400 [8]    Корпорация «Хеликон», кат. № RP-30 и RP-80 [9]    Корпорация «Хеликон», кат. № FA 104; FA 108; FA 111; FA 113N [10]    ТУ 6-09-11-1721-83 [11]    ТУ 6-09-4292-76 [12] Корпорация    «Сигма    Алдрич» («Sigma»), кат. № L-6026 [13] Корпорация    «Сигма    Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 1806

Компьютерная программа «Imageware» для анализа изображений, полученных при помощи «Чипдетектора-03» Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чипдетектор-03» Амплификатор «Терцик МС-2» Термостат суховоздушный ТВР-25 Микроцентрифуга настольная 5415С, 13000 мин-1 Мешалка магнитная с подогревом Аппарат для встряхивания (центрифуга — вортекс) Штативы под микроцентри-фужные пробирки Наконечники с фильтром для микропипеток Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат Трис(оксиметил)аминометан [N^QC^OH^] Додецилсульфат натрия (SDS) Фермент Taq-полимераза 5 Ед.акт./мм3

---

[14]    Корпорация «Хеликон», кат. № Am-038-0.5 [15]    Корпорация «Хеликон», кат. № Am-0485-01 [16]    Корпорация «Хеликон», кат. № Н-4044-0.4 [17]    ИФР РАН [18] ИФР РАН [19]    ТУ 46-22-603-75 [20]    Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [21]    Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [22]    Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения [23]    ООО «НПО ДНК-Технология» [24]    ТУ 9443-005-46482062—2003 [25]    ТУ 9443-001-96301278—2007 [26]    ООО «БИОМАСТЕР-ПРОМ»

Гуанидин тиоцианат [CH3N3 -HSCN] ^[2-оксиэтил]пиперазин-№-[2-этансульфоновая    кислота] (HEPES) [C8H17N2J4SNa] Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по 25 мМ каждого Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Раствор водный праймеров «ПР-1» Микрочипы гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами Государственный Комитет Сан-эпиднадзора Российской Федерации; № 06-19/52-17 от 15.06.95 Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин» ПЦР-детектор «Джин» ПЦР-детектор «Джин-4» Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК «СКАН-355», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt»

---

(ИУС № 4 2009 г.)

65 СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО

ОКС 65.140, 65.160, 67.060, 67.080, 67.100, 67.120, 67.140, 67.140.30, 67.160, 67.180, 67.190, 67.200, 67.220

Изменение № 2 ГОСТ Р 52174-2003 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Утверждено и введено в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22.11.2013 № 1896-ст

Дата введения — 2014—07—01

Раздел 1. Второй абзац. Заменить слова: «пяти» на «десяти», «10^-12 г (1 пг)» на «10^-9 г (1 нг, ~10³ геном-эквивалентов тотальной растительной ДНК/1 мкл пробы)».

Раздел 2 дополнить ссылкой:

«ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия».

Пункты 4.1, 4.2 изложить в новой редакции:

«4.1 Универсальный аппаратно-программный комплекс (УАПК) для анализа биологических микрочипов с компьютерной программой для анализа полученных результатов [1].

4.2 Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.».

Пункт 4.3. Заменить ссылку: [3] на [2].

Пункт 4.4. Заменить ссылку: [4] на [3].

Пункт 4.8. Заменить ссылку: [5] на [4].

Пункт 4.9. Заменить ссылку: [6] на [5].

Пункт 4.10. Заменить ссылку: [7] на [6].

Пункт 4.13. Заменить ссылку: [8] на [7].

Пункт 4.14. Заменить ссылку: [9] на [8].

Пункт 4.24. Заменить ссылку: [10] на [9].

Пункт 4.25. Заменить ссылку: [11] на [10].

Пункт 4.28 изложить в новой редакции:

«4.28 Цетилтриметиламмоний бромид [11]».

Пункт 4.31 изложить в новой редакции:

«4.31 Фермент термостабильный HotTaq-полимераза для ПЦР с «горячим стартом», оптимум активности при температуре 70 °С — 72 °С [12]».

Пункты 4.33—4.36 изложить в новой редакции:

«4.33 Буфер гибридизационный [13].

4.34    Баня водяная [18].

4.35    Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дУТФ, дЦТФ с молярной концентрацией по 2 мМ каждого [14].

4.36    Раствор флуоресцентного субстрата ФС [15]».

Пункт 4.37. Заменить ссылку: [17] на [16].

Пункт 4.38. Заменить ссылку: [18] на [17].

Пункты 4.39—4.41 изложить в новой редакции:

«4.39 Раствор водный праймеров «ПР-1» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [19]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена RBCL, кодирующего большую субъединицу рибуло-зы-7,5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы (Асс. № Z95552, поз. 160—720);

-    праймеры для амплификации фрагмента гена лектина LE1 (Асс. № К00821М30884, поз. 1080— 1720);

-    праймеры для амплификации фрагмента гена IVR1, кодирующего бета-фруктозидазу (Асс. № U16123, поз. 300—1090);

-    праймеры для амплификации фрагмента 358-промотора вируса мозаики цветной капусты (Асс. № FM 177585, поз. 3560—3870);

-    праймеры для амплификации фрагмента 358-терминатора вируса мозаики цветной капусты (Асс. № FM177585, поз. 1260—1590);

-    праймеры для амплификации фрагмента 358-промотора каулимовируса мозаики норичника (FMV, Асс. № Х06166, поз. 6260—6630);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена белка теплового шока пшеницы (Асс. № Х58279, поз. 10—210);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена BAR, определяющего устойчивость к фосфинотрицину (Асс. № AY310901, поз. 380—920);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: (Acc. № FM177585, поз. 10—370).

4.40    Раствор водный праймеров «ПР-2» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [20]:

-    праймеры для амплификации фрагмента гена фосфорилазы УДФ-глюкозы (UDP-GP) (Асс. № D00667, поз. 50—310);

-    праймеры для амплификации фрагмента гена фосфат-синтазы риса (8P8) (Асс. № U33175, поз. 5910—6250);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена nptll из транспозона Тп5 бактериального происхождения (Асс. № EU886197, поз. 9792—10145);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens (Асс. № AJ311872, поз. 5050—5240);

-    праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена RBC8 гороха (Асс. № FM177582.1, поз. 5782—5920);

-    праймеры для амплификации фрагмента промотора гена актина риса АСТ1 (Асс. № S44221, поз. 12—380);

-    праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена gus из бактерии Escherichia coli (Асс. № EU503042, поз. 2770—3140).

4.41    Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, назначение которых приведено в таблице 1 (название олигонуклеотида соответствует изображенному на рисунке 1) [21]:

Т а б л и ц а 1 — Обозначение и назначение олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биологическом микрочипе

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Назначение олигонуклеотида pIDNA (rbcL) ген RBCL Зонд для идентификации ДНК растительного происхождения в анализируемом материале GM/8T1(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои и/или картофеля ZM1(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы O81(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК риса 8T12(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля GM2(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои ZM/O82(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы и/или риса 8T2(RBCL) ген RBCL Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля Le1(Gm) ген лектина (LE1) Специфичный зонд для идентификации ДНК сои Zein(Zm) ген IVR1 Специфичный зонд для идентификации ДНК кукурузы

Окончание таблицы 1

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Назначение олигонуклеотида UDP-GP (8t) ген фосфорилазы УДФ-глюкозы Специфичный зонд для идентификации ДНК картофеля 8P8 (Os) ген фосфат-синтазы риса Специфичный зонд для идентификации ДНК риса nptll ген npt Специфичный зонд для идентификации маркерного гена nptll из транспозона Тп5 358_p CAMV промотор 358 Специфичный зонд для идентификации 358 промотора вируса мозаики цветной капусты 358_p FMV промотор FMV Специфичный зонд для идентификации 358 FMV промотора каулимовируса мозаики норичника Act1_p ген актина АСТ1 Специфичный зонд для идентификации промотора гена актина риса Gus ген gus Специфичный зонд для идентификации маркерного гена gus nos_t терминатор nos Специфичный зонд для идентификации терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens 358_t CAMV терминатор 358 Специфичный зонд для идентификации 358 терминатора вируса мозаики цветной капусты rbc8t Терминатор гена RBC8 Специфичный зонд для идентификации терминатора гена RBC8 гороха Ocs_t Терминатор Ocs Специфичный зонд для идентификации терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens Bar ген BAR Специфичный зонд для идентификации маркерного гена BAR

Рисунок 1 — Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения Обозначение ячеек приведено в соответствии с назначением иммобилизованного в ней зонда, указанного в таблице 1.

Биологический микрочип представляет собой пластиковую подложку, выполненную в формате предметного стекла по ГОСТ 9284, на поверхности которой в определенном порядке расположена 31 ячейка полиакриламидного геля в форме полусферы диаметром 100 мкм (обозначены кружками на рисунке 1). 22 из них содержат индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (перечень и назначение олигонуклеотидов приведены в таблице 1). Пять ячеек с индексом «0» не содержат перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Четыре ячейки с индексом «М», содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для автоматического вычисления интенсивности флуоресценции ячеек биологического микрочипа после гибридизации. Поверхность биологического микрочипа должна быть закрыта специальной составной крышкой с отверстиями, которая вместе с подложкой образует гибридизационную камеру, предназначенную для проведения реакции гибридизации анализируемых ПЦР-продуктов с иммобилизованными на биологическом микрочипе олигонуклеотидами, и исключающую возможность испарения реакционной смеси в процессе гибридизации. Диагностическая специфичность при идентификации растительной ДНК сои, картофеля, кукурузы, риса составляет не менее 95 %.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше».

Пункт 6.1.2. Заменить слова: «186,12 г/дм³» на «74,4 г/дм³», «18,61 г» на «7,44 г», «гидроокиси натрия» на «NaOH».

Пункты 6.1.4—6.1.9 изложить в новой редакции:

«6.1.4 Приготовление раствора Трис-HCI массовой концентрации 242,2 г/дм³

В колбу вместимостью 100 см³ помещают 24,22 г трис(оксиметил)аминометана по 4.25 [10] и растворяют приблизительно в 80 см³ особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5 ед. рН, а объем — до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.1.5    Приготовление раствора NaCI массовой концентрации 146,2 г/дм³

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14,62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70—80 см³ особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.6    Приготовление ЦТАБ-буфера

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2,0 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], далее добавляют 5 см³ раствора Трис-HCI, приготовленного по 6.1.4, 56 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5, и 10 см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли.

Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.7    Приготовление ЦТАБ-раствора

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,5 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], и добавляют 1,6 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5. Объем раствора доводят до 100 см³ особо чистой стерильной водой.

Срок хранения при температуре 4 °С — 5 °С — не более месяца, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С — до одного года.

6.1.8    Приготовление разведенного раствора NaCI

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 48 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5, и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.

Срок хранения при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.1.9    Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 °С не более шести месяцев. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С».

Пункты 6.2.1—6.2.6 изложить в новой редакции:

«6.2.1 Две параллельные пробы анализируемого продукта массой около 100 мг каждая помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1,5 см³, добавляют по 500 мм³ ЦТАБ-буфера, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания по 4.10 [6] в течение 2 мин и выдерживают 15—20 мин при температуре 65 °С в термостате для микропробирок.

6.2.2    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [4] при частоте вращения 13000 мин^-1 в течение 10 мин.

6.2.3    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.2, отбирают микродозатором (обычно по 500 мм³) и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015. Содержимое перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 2 мин и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин^-1.

6.2.4    Верхнюю жидкую фазу из смеси, полученной по 6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробирки добавляют два объема ЦТАБ-раствора, приготовленного по 6.1.7, аккуратно перемешивают, переворачивая пробирки вручную, и выдерживают 60 мин при комнатной температуре.

6.2.5    Смесь, полученную по 6.2.4, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин^-1. Надосадочную жидкость тщательно удаляют микродозатором, а осадок растворяют в 350—600 мм³ (в зависимости от объема осадка) разведенного раствора NaCI, приготовленного по 6.1.8, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015, перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 сек и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин^-1.

6.2.6    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.5, отбирают микродозатором и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропилового спирта по 4.27, аккуратно перемешивают содержимое пробирок вручную и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре».

Подраздел 6.2 дополнить пунктами 6.2.7—6.2.9:

«6.2.7 Смесь, полученную по 6.2.6, центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин^-1, надосадочную жидкость аккуратно сливают, а к осадку ДНК добавляют 1 см³ 70%-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 °C — 4 °С, перемешивают и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин^-1.

6.2.8    Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

6.2.9    Осадок ДНК, полученный по 6.2.8, перерастворяют в 40—50 мм³ особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР.

Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С — до одного года».

Пункт 6.3.1.1 изложить в новой редакции:

«6.3.1.1 Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1,5 см³ и маркируют их «М1» и «М2».

В пробирку «М1» микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм³ 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14], 2 мм³ фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм³)², 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм³ водного раствора праймеров «ПР-1» по 4.40 [19].

В пробирку «М2» микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм³ 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14],

2 мм³ фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм³)*, 1 мм³ флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм³ водного раствора праймеров «ПР-2» по 4.41 [20].

Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 20 мм³ (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках «М1» и «М2» для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38)».

Пункты 7.1.1—7.1.4 изложить в новой редакции; дополнить пунктами — 7.1.5, 7.1.6:

«7.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят 2 чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см³, маркируя их «N₁» и «N₂», где N — номер анализируемой пробы.

7.1.2    Реакционные смеси для амПЦР «М1» и «М2», полученные по 6.3.1.1—6.3.1.2, микродозатором вносят в микроцентрифужные пробирки по 20 мм³ в каждую таким образом, чтобы смесь «М1» была распределена по пробиркам с индексом «N-,», а смесь «М2» — по пробиркам с индексом «N₂».

7.1.3    Анализируемую ДНК пробы N, выделенную по 6.2, вносят микродозатором по 5 мм³ в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.2, маркированные, соответственно, «N.,» и «N₂». При использовании амплификатора ДНК [2] без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм³ вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.

7.1.4    В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм³ раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).

7.1.5    Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм³ раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).

7.1.6    Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 7.1.3—7.1.5, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.

Т а б л и ц а 2 — Программа проведения амПЦР

Шаг программы Температура, °С Время инкубации Число циклов 1 95 12 мин 1 2 95 30 с 55 51 30 с 72 30 с 3 72 10 мин 1

Подраздел 7.2 изложить в новой редакции:

«7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

7.2.1    Для проведения этапа гибридизации готовят N+2 микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,5 или 1,5 см³ (N — количество анализируемых проб, две другие пробирки нужны для анализа положительного и отрицательного контроля).

7.2.2    В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 18 мм³ гибридизационного буфера 4.33 [13]. К гибридизационному буферу в пробирку «N» добавляют по 9 мм³ водной фазы ПЦР-смесей из пробирок «N₁» и «N₂», полученных в результате проведения амПЦР по 7.1.6 и перемешивают в течение 20—30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой вращения не менее 1500 мин^-1 для получения гибридизационной смеси.

7.2.3    Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 мм³ гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате по 4.4 [3] при температуре 37 °С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16—18 ч.

7.2.4    После окончания гибридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочипа. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 мм³ дистиллированной воды по ГОСТ 6709, предварительно прогретой до температуры 37 °С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 минуты, затем отбирают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709, этиловым спиртом по 4.26, дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и высушивают при комнатной температуре.

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении Б».

Раздел 8 изложить в новой редакции:

«8 Обработка и интерпретация результатов анализа

8.1    Результаты гибридизации регистрируют с помощью универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (УАПК) [1]. Инсталляция и эксплуатация комплекса осуществляется в соответствии с руководством по эксплуатации УАПК.

8.2    Производят запуск программного обеспечения, поставляемого вместе с комплексом (файл imageware.exe). При запуске на мониторе появляется схема биочипа с указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов соответствуют указанным в таблице 1 и на рисунке 1.

8.3    Биологический микрочип после проведения гибридизации, промывки, удаления гибридизационной камеры, ополаскивания и высушивания помещают в держатель УАПК «лицевой» стороной (содержащей гелевые ячейки) вверх.

8.4    Нажимают пиктограмму с надписью «Пуск» в верхней части диалогового окна «Снимок». При этом происходит возбуждение флуоресценции ячеек биочипа лазерами с длиной волны 640 нм, захват флуоресцентного изображения, его обработка и выдача отчета о присутствии в исследуемом образце ДНК растительного происхождения, идентификации видоспецифичной ДНК (соя, кукуруза, картофель, рис) и наличии/отсутствии генетических элементов, используемых как детерминанты трансгенности. Применение универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа биологических микрочипов [1] позволяет автоматизировать все этапы регистрации и интерпретации результатов и получать заключение о наличии/отсутствии ДНК растительного происхождения в исследуемом образце, а также о наличии/отсутствии генетических детерминант трансгенности.

8.5    Анализ биологических микрочипов с прогибридизованными ПЦР-продуктами, полученными при амплификации ДНК, выделенной из различных образцов, начинают с регистрации и интерпретации гибри-дизационных картин положительного (заведомо трансгенной ДНК) и отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК).

8.6    Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биочипе, представлен в приложении В.

8.7    В случае, если при использовании заведомо нетрансгенной ДНК регистрируют сигнал в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям фрагментов векторных конструкций и маркерных генов, это свидетельствует о получении ложноположительного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть загрязнение (контаминация) ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты по ГОСТ 3118 (0,1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. В случае отсутствия сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к различным генетическим детерминантам трансгенности, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, делают заключение об отсутствии контаминации и проводят анализ образцов ДНК согласно протоколу.

8.8    Отсутствие флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL, при использовании нетрансгенной растительной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Наличие сигнала в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к ДНК растительного происхождения, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, свидетельствует об эффективно проведенной амПЦР и гибридизации на биочипе. При этом анализ образцов ДНК проводят далее согласно протоколу».

Приложение Б изложить в новой редакции:

«ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное)

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения с использованием биологического микрочипа

Рисунок Б.1

А — мультиплексная асимметричная амплификация ДНК образца «N» в двух независимых пробирках «N.,» и «N₂» с уникальным набором праймеров для получения преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных фрагментов;

Б — гибридизация ПЦР-продуктов, полученных в независимых пробирках «N.,» и «N₂» со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе;

В — регистрация и интерпретация флуоресцентной картины гибридизации на биологическом микрочипе».

Приложение В изложить в новой редакции:

«ПРИЛОЖЕНИЕ В

(обязательное)

Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биологическом микрочипе

(флуоресцентная картина гибридизации, полученная в результате анализа ДНК генетически модифицированной сои и распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа)

Рисунок В.1

А—схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника растительного происхождения;

Б — гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК сои, содержащей 358-промотор, терминатор nos. Стрелками обозначены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы.

В — распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа. Жирным шрифтом выделены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы».

Приложение Г изложить в новой редакции:

«ПРИЛОЖЕНИЕ Г

(рекомендуемое)

Пример оформления протокола испытания

Наименование организации (испытательная лаборатория)

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

№_от «_»_201 г.

Даты: поступления на испытание « »_201_ г.

конца испытаний « »__201_ г.

Продукция: _Котлеты «Московские»_

Производитель сырья или продукции:    ООО    «Вымпел»_

Предъявитель сырья или продукции:_Орган сертификации «Биотест-М»_

Отбор проб произведен _по ГОСТ 11856-89_

в соответствии с нормативным документом на соответствующую однородную группу сырья или продукции Акт отбора проб и техническое задание на испытания № 118 от 08.02.2013 Испытания проведены на основании требований ГОСТ Р 52174-2003

Номер образца: _6/кс, 7/кс, 8/кс и 9/кс_

Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штриховка): Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ в образцах № 6/кс, 7/кс и 8/кс отсутствует, а в образце № 9/кс присутствует.

Маркировка:_—_

Годен до:    —    Штриховой    код:_—_ Результаты испытаний Т а б л и ц а 1 — Нетрансгенные видоспецифичные последовательности

Последовательности Номер образца 6/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии ген RBCL + + + + GM/ST1(RBCL) + + + + ZM1(RBCL) - - - - OS1(RBCL) - - - - ST12(RBCL) + + - - GM2(RBCL) - - + + ZM/OS2(RBCL) - - - - ST2(RBCL) + + - - Le1(Gm) - - + + Zein(Zm) - - - - UDP-GP (St) + + - - SPS (Os) - - - -

Результат анализа: В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие растительные компоненты: в образце 6/кс и 7/кс обнаружено присутствие ДНК сои, а в образцах 8/кс и 9/кс обнаружено присутствие

ДНК картофеля.

Т а б л и ц а 2 — Трансгенные видоспецифичные последовательности

Последовательности Номер образца 6/кс 7/кс 8/кс 9/кс При наличии nptll - + - - 35S_p CAMV - + - + 35S_p FMV - - - - Act1_p - - - - Gus - - - - _t os n - - - + 35S_t CAMV - - - - rbcSt - - - - Ocs_t - - - - Bar - - - -

Результат анализа:    В    образцах    7/кс    и    9/кс    обнаружены    следующие трансгенные компоненты: в

образце 7/кс обнаружен гомолог гена nptll; промотор 35S CaMVи терминатор nos, а в образце 9/кс обнаружены промотор 35S CaMV и терминатор nos. В образцах 6/кс и 8/кс трансгенные компоненты не обнаружены. Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ, в образце 7/кс отсутствует, а в образце 9/кс присутствует.

Вывод: Все образцы содержат растительную ДНК, образец 6/кс содержит нетрансгенную ДНК сои; образец 7/кс содержит трансгенную ДНК сои; образец 8/кс содержит нетрансгенную ДНК картофеля; образец 9/кс содержит трансгенную ДНК картофеля.

Исполнители:

__Иванов И.И.

подпись    Фамилия,    инициалы

__Петров П.П.

подпись    Фамилия, инициалы

Руководитель испытательной лаборатории_

подпись

МП    ______

Фамилия, инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания».

Приложение Д изложить в новой редакции:

«ПРИЛОЖЕНИЕ Д (справочное)

Библиография

[1]    ТУ 9443-004-02699501—2006 ООО «Биочип-ИМБ» [2]    ТУ 9642-001-4648062—98 [3]    ТУ 42-619—61 [4]    Корпорация «Эппендорф», кат. № 5425 000.014 [5]    Корпорация «Хеликон», кат. № MSH-300 [6]    Корпорация «Хеликон», кат. № CV-1500 [7]    Корпорация «Хеликон», кат. № RP-30 и RP-80 [8]    Корпорация «Хеликон», кат. № FA104; FA108; FA 111; FA 113N [9]    ТУ 6-09-11-1721—83 [10]    ТУ 6-09-4292—76 [11]    Корпорация «Хеликон», кат. № Am-0833 [12]    Корпорация «Силекс», кат. № Е0320 [13]    ТУ 9398-003-02699501—2006 [14]    Корпорация «Силекс», кат. № N1101 [15]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) [16]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) [17]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) [18]    ТУ 46-22-603—75 [19]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) [20]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) [21]    Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) [22]    Государственный Комитет Санэпиднадзора Российской Федерации; № 06-19/52-17 от 15.06.95 [23] ЗАО «НПФ ДНК-Технология»

Универсальный аппаратно-программный комплекс для анализа биологических микрочипов (УАПК) Амплификатор «Терцик МС-2» Термостат суховоздушный ТВР-25 Микроцентрифуга настольная 5415С, 13000 мин-1 Мешалка магнитная с подогревом Аппарат для встряхивания (центрифуга — вортекс) Штативы под микроцентрифужные пробирки Наконечники с фильтром для микропипеток Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат Т рис(оксиметил)аминометан ^Н2С(СН2ОН)3] Цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) [C19H42NBr] Фермент HotTaq-полимераза 5 Ед. акт. в мм3 Буфер гибридизационный Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по 25 мМ каждого Флуоресцентный субстрат «ФС» Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Раствор водный праймеров «ПР-1» Раствор водный праймеров «ПР-2» Биологические микрочипы (биочипы) гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин»

---

[24]    ТУ 9443-005-46482062—2003 [25]    ООО «БИОМАСТЕР-ПРОМ»

ПЦР-детектор «Джин» Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК «CKAH-35S», «CKAH-gus», «CKAH-nos» и «CKAH-npt». (ИУС № 4 2014 г.)

---

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Биологическая безопасность

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа

Biological safety. Raw and food-stuffs. Method for the identification of genetically modified organisms (GMO)

of plant origin by using biological microchip

Дата введения 2004—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее — продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.

Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее — амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК. Чувствительность метода — не менее 10^_12 г (1 пг) ДНК.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислотасоляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 13646-68 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    биологическая безопасность: В соответствии с приложением А.

3.2    генетически модифицированные источники: Сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.

3.3    генетически модифицированный организм: Организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.

3.4    генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

3.5    биологический микрочип: Микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.

3.6    праймер: Последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции.

3.7    асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: Полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Компьютерная программа «Imageware» для анализа изображений, полученных с помощью «Чипдетектора-03» [1] или «Био-1» [23].

4.2    Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов типа «Чипдетектор-03» [2] или «Евробио-ВТО» [24].

4.1, 4.2 (Поправка).

4.3    Амплификатор ДНК типа «Терцик» под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 см³ со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [3].

4.4    Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры ±1°С [4].

4.5    Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности (условное обозначение (II)) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,0001 г.

4.6    Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

4.7    Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.8    Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения не менее 13000 мин^-1 [5].

4.9    Мешалка магнитная с подогревом [6].

4.10    Аппарат для встряхивания типа CV-1500 с частотой вращения не менее 1500 мин^-1 [7].

4.11    рН-метр с набором электродов, с погрешностью измерений ±0,1 рН.

4.12    Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5—10,0 мм³ (шаг — 0,1 мм³, точность ±2,5 % — 10,0 %, воспроизводимость 3 %—7 %); 5,0—50,0 мм³ (шаг — 0,5 мм³, точность ±2,0 %—5,0 %, воспроизводимость 2,5 %—5 %); 20,0—200,0 мм³ (шаг — 1,0 мм³, точность ±1,5 %—

2,0 %, воспроизводимость 2 %—3 %); 100—1000 мм³ (шаг — 5 мм³, точность ±1,0 %—1,5 %, воспроизводимость 1 %—2 %).

4.13    Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [8].

4.14    Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 мм³ [9].

4.15    Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см³ стерильные.

4.16    Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см³.

4.17    Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 см³.

4.18    Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50—1000 см³.

4.19    Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.

4.20    Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21    Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

4.22    Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.23    Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

4.24    Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [10].

4.25    Трис(оксиметил)аминометан [11].

4.26    Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.

4.27    Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, х.ч.

4.28    Додецилсульфат натрия (SDS) [12].

4.29    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.30    Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз.

4.31    Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности при 70 °С—72 °С [13].

4.32    ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 дм³ Трис-HCI, рН 8,8; 37,28 г в 1 дм³ КС1, 5 % Твин-20, 50 % формамид; 142,83 мгв 1 дм³ MgC1₂).

4.33    Гуанидинтиоцианат[14].

4.34    М-[2-оксиэтил]пиперазин-1-[2-этансульфоновая кислота] (НЕРЕ6) [15].

4.35    Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.36    Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждого [16].

4.37    Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/мм³ или 10⁶ копий/мм³) [17].

4.38 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/мм³ или 10⁶ копий/мм³) [18].

4.39    Баня водяная [19].

4.40    Раствор водный праймеров «ПР-1» для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров:

праймеры на промотор 356 вируса мозаики цветной капусты:

^56_п    5' ССТ ССТ CGG АТТ ССА ТШ ССС AG    (23 н.о.)

^56_оф    5' GTC САТ СТТ TGG GAC САС TGT С**    (24 н.о.)

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

gus^    5' AAG CCG GGC AAT TGC TGT GCC A    (22 н.о.)

gus^    5' GAC CGC ATC GAA ACG CAG CAC G    (22 н.о.)

праймеры на промотор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

nos_п    5' СGA TGA CGC GGG ACA AGC CGT    (21 н.о.)

nos^    5' GAC CTT AGG CGA CTT TTG AAС GCG С    (25 н.о.)

праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Tn5 бактериального происхождения:

npt_п    5' GTG TTC CGG CTG TCA GCG CAG G    (22 н.о.)

пр_оф    5' CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG    (21 н.о.)

праймеры на терминатор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

ocs^    5' GCG AGA CGC CTA TGA TCG CAT GAT    (24 н.о.)

ocs^    5' GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC    (24 н.о.)

Примечание — В обозначениях праймеров индекс «_п» означает «прямой», индекс «_оф» означает «обратный флуоресцентномеченый»; н.о. — нуклеотидные остатки [20].

4.41    Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, приведенными в таблице 1 [21]:

Таблица 1 — Олигонуклеотиды, иммобилизованные на биологическом микрочипе

Наименование олигонуклеотида Детектируемая мишень Последовательность олигонуклеотида 356_и Промотор 35S 5' GCC АТС ATT GCG АТА AAG G gus^ Ген gus 5' CTG GTA TCA GCG CGA A яояи Промотор nos 5' GCT AAG CAC ATA CGT CAG AA при Ген nptll 5' GGC AGC GCG GCT ATC ocs^ Терминатор ocs 5' TTC TGT TGT GCA CGT TGT A Примечание — Индекс «и» означает «иммобилизованный».

Рисунок 1 — Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения

Биологический(микрочип(представляет(собой(стандартное(предметное(стекло(по(ГОСТ(9284 для световой микроскопии, на поверхности которого в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек (рисунок 1), заполненные полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (35S, gus, nos, npt или ocs). Три ячейки с индексом «НК» не содержат ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Две ячейки с индексом «М» содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации биологического микрочипа. Поверхность биологического(микрочипа(с(ячейками(должна(быть(закрыта(пластиковой(крышкой(с(отверстиями, которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство, предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

(Поправка).

5    Отбор проб

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья (в том числе посевного и посадочного материала), пищевых продуктов, цветов.

6    Подготовка к проведению анализа

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/дм³

В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³ помещают 4,0 г сухой гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 и растворяют в 100 см³ особо чистой стерильной воды по 4.30. После(охлаждения(раствора(до(комнатной(температуры(его(переливают(в(специальную(щелочеу-стойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.2    Приготовление раствора ЭДТА концентрации 186,12 г/дм³

В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ помещают 18,61 г ЭДТА по 4.24, растворяют(в(80(см³(особо(чистой(стерильной(воды(при(интенсивном(перемешивании(на(магнитной мешалке [6]. Затем раствором гидроокиси натрия по 6.1.1 доводят рН раствора до 8,0. Полученный раствор переливают в мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см³ и особо чистой стерильной водой доводят объем этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре 4 °С—5 °С — не более 6 мес.

6.1.3    Приготовление 70 %-ного раствора этилового спирта

В мерную колбу вместимостью 200 см³ по ГОСТ 12738 вносят 140 см³ 96 %-ного этилового спирта высокой степени очистки по ГОСТ Р 51652, добавляют 52 см³ особо чистой стерильной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре 4 °С—5 °С — не более 6 мес.

6.1.4    Приготовление гибридизационного буфера

В стеклянный стакан или плоскодонную колбу вместимостью 300—500 см³ помещают точно отмеренные количества: 44,33 (±0,01) г гуанидин тиоцианата — по 4.33 [14], 4,88 (±0,01) г 1-[2-гид-роксиэтил]пиперазин-1'-[2-этансульфоновой кислоты] натриевой соли (НЕРЕ6) по 4.34 [15]. Затем стеклянной пипеткой по ГОСТ 29227 вместимостью 5 см³ приливают 3,75 (±0,05) см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2, и цилиндром вместимостью 250 см³ добавляют 200 см³ особо чистой стерильной воды. Стакан с раствором помещают на магнитную мешалку по 4.9 [6] и перемешивают до полного растворения компонентов. Доводят значение рН буфера до 7,5 (±0,1) добавлением раствора гидроокиси натрия, приготовленного по 6.1.1. Полученный раствор из стакана переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, доводят объем до метки особо чистой стерильной водой и разливают по 50 см³ в плоскодонные колбы с притертыми пробками. Срок хранения при температуре 2 °С—8 °С — не более 12 мес.

6.1.5    Приготовление раствора Трис-НС1 концентрации 242,2 г/дм³

В колбу вместимостью 100 см³ помещают 24,22 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.25 [11] и растворяют приблизительно в 80 см³ особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, а объем — до 100 см³ особо чистой стерильной водой. Срок хранения при комнатной температуре — не более 6 мес.

6.1.6    Приготовление раствора NaCI концентрации 146,2 г/дм³

В плоскодонную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14,62 г хлористого натрия по

ГОСТ 4233, растворяют в 70—80 см³ особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и особо чистой стерильной водой доводят до метки. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.7    Приготовление раствора 20 %-ного додецилсульфата натрия (SDS) [12]

В стеклянную колбу вместимостью 100 см³ помещают 20 г сухого додецилсульфата натрия по

4.27 и добавляют 80 см³ особо чистой стерильной воды. Растворяют при плавном перемешивании на магнитной мешалке и одновременном нагревании до температуры 40 °С—50 °С до полного растворения. Срок хранения при комнатной температуре — не более одного года.

6.1.8    Приготовление буфера экстракции

В мерной колбе вместимостью 50 см³ смешивают 5 см³ раствора Трис-НС1, приготовленного по 6.1.5, 5 см³ раствора NaCI, приготовленного по 6.1.6, 1,25 см³ раствора 20 %-ного SDS, приготовленного по 6.1.7, и 2,5 см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2; каждый раствор отбирают отдельной стеклянной пипеткой. Объем раствора доводят до 50 см³ особо чистой стерильной водой. Срок хранения при температуре 4 °С—5 °С — не более двух недель, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С — не более одного года.

6.1.9    Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 °С не более одного года. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С.

6.2 Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

6.2.1    Две навески каждого анализируемого продукта массой 60—80 мг помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1,5 см³, в течение 15—20 с доводят до состояния однородной смеси пестиком по ГОСТ 21400 при комнатной температуре и сразу микродозатором добавляют по 400 мм³ буфера экстракции, приготовленного по 6.1.8.

6.2.2    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, интенсивно встряхивают в течение 5 с на аппарате для встряхивания по 4.10 [7], быстро нагревают на водяной бане

[19] до температуры 65 °С и выдерживают при этой температуре 15—20 мин, периодически осторожно перемешивая содержимое.

6.2.3    Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.2, центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [5] при частоте вращения 13000 мин^-1 в течение 5 мин.

6.2.4    Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.3, отбирают по 300 мм³ и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, содержащие по 300 мм³ изопропилового спирта по ГОСТ 9805. Содержимое перемешивают, выдерживают 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют

5 мин при частоте вращения 13000 мин^-1.

6.2.5    Надосадочную жидкость по 6.2.4 тщательно удаляют микродозатором, а осадок ДНК, полученный по 6.2.4, промывают 1 см³ 70 %-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 °С—4 °С, центрифугируют аналогично 6.2.4. Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.

6.2.6    Осадок ДНК, полученный по 6.2.5, перерастворяют в 40—50 мм³ особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР. Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С — не более одного года.

6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР

6.3.1    Приготовление реакционной смеси для амПЦР³

6.3.1.1    В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³ микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 3 мм³ 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 3 мм³ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.36 [16], 2,5 мм³ фермента Taq-полимеразы по 4.31

[13] (концентрацией 5 Ед. акт/мм³)⁴, а также водный раствор праймеров по 4.40 [20] в следующих концентрациях (нг/дм³):

^56_п/^56_оф — 15,32/81,02; gus_п/gus_оф — 3,75/37,59;

nos_п/nos_оф — 3,61/84,74;

npt^/npt^ — 7,51/36,01;

ocs_п/ocs_оф — 8,18/41,41.

Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 27 мм³ (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3—5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционной смеси для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольный проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).

6.3.1.2    Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.1, осаждают кратковременным (10—15 с) центрифугированием на настольной центрифуге при частоте вращения 1500—3000 мин^-1 и сразу же используют для проведения анализа.

6.3.2    Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. Для проведения амПЦР допускается использовать только стерильную лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При проведении амПЦР каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром.

7 Проведение анализа

7.1    Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР

7.1.1    Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.2, микродозатором вносят в чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см³ по 27 мм³ в каждую.

7.1.2    Анализируемую ДНК, выделенную по 6.2, вносят микродозатором по 3 мм³ в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1. 1. При использовании амплификатора ДНК по 4 . 3 [3] без подогрева крыпшки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм³ вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР . В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы .

7 .1 . 3 В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 3 мм³ раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль) и раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль) .

7 . 1 . 4 Все микроцентрифужные пробирки со смесями, полученными по 7 . 1 . 2, и растворами, подготовленными по 7 .1 . 3, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2 .

Таблица 2 — Программа проведения амПЦР

Шаг программы Температура, °С Время инкубации Число циклов 1 95 5 мин 1 2 95 30 с 37 62 30 с 72 30 с 3 72 5 мин 1

7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе

7 . 2 .1 В необходимое количество микроцентрифужныгх пробирок микродозатором вносят по 24 мм³ гибридизационного буфера, приготовленного по 6 . 1 . 4 . Затем к гибридизационному буферу добавляют по 12 мм³ водной фазы ПЦР-смеси, полученной в результате проведения амПЦР по 7 .1 . 4, и перемешивают в течение 20—30 с на аппарате для встряхивания по 4 .10 с частотой вращения не менее 1500 мин^-1 для получения гибридизационной смеси .

7 . 2 . 2 Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 28 мм³ гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7 .2 .1, и всю смесь помещают на поверхность биологического микрочипа через отверстие в пластиковой крышке . Гибридизацию проводят в термостате [4] при температуре 37 °С в течение 18 ч .

7    . 2 .3 После окончания гибридизации пластиковые крышки снимают, каждый биологический микрочип трижды1 промыгвают дистиллированной водой по ГОСТ 6709 при температуре 25 °С и высушивают при комнатной температуре .

Схема метода идентификации генетически модифицированные источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении Б .

8    Обработка результатов анализа

8 .1 Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чипдетектор-03» [2] и компьютерной программы «Imageware» [1] или «Био-1» [23] .

(Поправка).

8 . 2 Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК) . Пример гибридизационной картины флуоресцентных продуктов амПЦР в гелевых ячейках биологического микрочипа приведен в приложении В . Наличие высокого уровня специфического флуоресцентного сигнала в гелевые ячейках биологического микрочипа, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и nos, терминатора ocs, генов gus или nptll), свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т . е . о трансгенности анализируемой ДНК . Низкий уровень флуоресцентных сигналов в гелевых ячейках биологического микрочипа после гибридизации, сравнимый с уровнем фоновой флуоресценции отрицательного контроля, но не выше установленного порога чувствительности в программе Imageware, указывает на отсутствие конкретные чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т . е . о нетрансгенности анализируемой ДНК.

8.3 Интерпретация результатов

8 . 3 .1 Высокий уровень флуоресценции одной, нескольких или всех пяти гелевых ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, превышающий заданный в программе Imageware [1] порог чувствительности, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников (ГМИ) в анализируемом продукте .

8 . 3 . 2 Низкий уровень флуоресценции всех пяти гелевый ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, близкий к фоновой флуоресценции отрицательные контролей и не достигающий заданного в программе «Imageware» порога чувствительности, свидетельствует об отсутствии генетически модифицированные источников (ГМИ) в анализируемом продукте

8 . 3 . 3 Высокий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноположительного результата . Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования . В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторные столов и оборудования раствором соляной кислоты (1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ . Полученный при повторном анализе низкий уровень флуоресценции гелевые ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который является окончательным .

8    . 3 . 4 Низкий уровень (отсутствие) флуоресцентного сигнала при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата . Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе . В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ . Полученный при повторном анализе выгсокий уровень флуоресценции гелевые ячеек при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который является окончательным .

9    Требования безопасности

9 .1 При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1 .007 .

9 . 2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточновытяжной вентиляцией по ГОСТ 12 . 4 .021 . Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1 .005 .

9 . 3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12 .1 . 019 . Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1 .004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 .

Определение термина

биологическая безопасность: Защищенность человека, общества и окружающей среды от негативного воздействия токсических, аллергенны1х, канцерогенные, мутагенны1х биологических веществ и соединений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах.

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное)

Схема метода идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения

А — амПЦР с использованием флуоресцентно-меченных праймеров (индекс «_оф»);

Б — гибридизация ПЦР продуктов со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе (индекс «_и»)

Рисунок Б.1

Пример гибридизационной картины на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР (Гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированного картофеля, содержащего промотор 35S, гены gus и nptll и промотор nos)

А — схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника растительного происхождения;

Б — гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК, содержащей промотор 35S, гены gus и nptll, а также промотор nos. Пунктиром обозначены гелевые ячейки биологического микрочипа с уровнем флуоресценции, близким к фоновой, не достигающим заданного в программе Imageware порога чувствительности

Рисунок В. 1

Пример оформления протокола испытания

Наименование организации (испытательная лаборатория)

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

№_от «_»_200_г.

Даты: поступления на испытание «_»_ 200_г.

конца испытаний «_»_ 200_г.

^    Картофель семенной

Продукция: _

Производитель сырья или продукции _

тт    «Биотест-М»

Предъявитель сырья или продукции _

Отбор проб произведен _ГОСТ П856—8

(в соответствии с нормативным документом на соответствующую однородную группу сырья или продукции)

Акт отбора проб и техническое задание на испытания №    ⁵ от    0L¹².²⁰⁰    г.

Испытания проведены на основании требований ГОСТ Р ⁵²¹74^—2°°3

Номер образца _6/2004, 7/2004, 8/2004 и 9/2004_

Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки,

штриховка)    ^—_

Маркировка _—_

Годен до_Штриховой код

Результаты испытаний

Номер образца	Трансгенные последовательности
	35S	gus	nos	nptll	ocs
6/2004	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
7/2004	Присутствует	Присутствует	Отсутствует	Присутствует	Присутствует
8/2004	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
9/2004	Присутствует	Отсутствует	Присутствует	Отсутствует	Отсутствует

Результат анализа: В образцах 7/2004 и 9/2004 обнаружены следующие трансгенные компоненты: в образце № 7/2004 обнаружены гомологи генов gus и nptll; промоторы 35S, ocs, а в образце № 9/2004 обнаружены промоторы 356 и nos. В образцах № 6/2004 и 8/2004 трансгенные компоненты не обнаружены. Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ в образцах № 6/2004, 7/2004 и 8/2004 отсутствует, а в образце № 9/2004 присутствует._

Исполнители

подпись    фамилия,    инициалы

подпись    фамилия,    инициалы

Руководитель испытательной лаборатории _

подпись

МП

фамилия, инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.

Библиография

[1]    Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [2]    ТУ 9443-001-02699501—2003 [3]    ТУ 9642-001-4648062—98 [4]    ТУ 42-619—61 [5]    Корпорация «Эппендорф», кат. № 5425000.014 [6]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    MSH-300 [7]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    CV-1500 [8]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    RP-30 и RP-80 [9]    Корпорация «Хеликон», кат. № FA 104; FA 108; FA111; FA 113N [10]    ТУ 6-09-11-1721—83 [11]    ТУ 6-09-4292—76 [12]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № L-6026 [13]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 1806 [14]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    Am-038-0.5 [15]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    Am-0485-01 [16]    Корпорация «Хеликон»,    кат.    №    Н-4044-0.4 [17]    ИФР РАН [18]    ИФР РАН [19]    ТУ 46-22-603—75 [20]    Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [21]    Центр биологических микрочипов ИМБ РАН [22]    Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения [23]    ООО «Биоконтроль» [24]    ООО «Биоконтроль»

Компьютерная программа «Imageware» для анализа изображений, полученных с помощью «Чипдетектора-03» Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чипдетектор-03» Амплификатор «Терцик МС-2» Термостат суховоздушный ТВ3-25 Микроцентрифуга настольная 5415С, 13000 мин-1 Мешалка магнитная с подогревом Аппарат для встряхивания (центрифуга-вортекс) Штативы под микроцентрифужные пробирки Наконечники с фильтром для микропипеток Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат Трис(оксиметил)аминометан [NH2C(CH20H)3] Додецилсульфат натрия (SDS) Фермент Taq-полимераза 5 Ед.акт./мм3 Гуанидин тиоцианат [CH3N3-HSCN] 1-[2-оксиэтил]пиперазин-1'-[2-этансульфоновая кислота] (HEPES) [C8H17N204SNa] Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по 25 мМ каждого Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм3 или 106 копий/мм3 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Раствор водный праймеров «ПР-1» Микрочипы гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами Государственный комитет Санэпиднадзора Российской Федерации; № 06-19/52-17 от 15.06.95 Компьютерная программа «Био-1» Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции «Евробио-ВТО»

---

ПРИЛОЖЕНИЯ Б—Д (Поправка).

ОКС 65.140 Н11 65.160 Н13 67.060 Н17 67.080 Н23 67.100 Н31—Н34 67.120 Н36 67.140 Н41—Н43 67.140.30 Н51—Н56 67.160 Н62 67.180 Н65 67.190 Н68 67.200 Н72—Н74 67.220 Н81 Н97

С11 ОКСТУ 9109 С23—С25 9209 С32—С36 9709 С41—С45 С52

---

Ключевые слова: идентификация, сырье и продукты пищевые, генетически модифицированные источники, асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция, биологический микрочип, гибридизация, праймер, олигонуклеотиды, последовательность ДНК, нетрансгенная ДНК, трансгенная ДНК, интенсивность флуоресценции

Редактор В.Н. Копысов Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор А.С. Черноусова Компьютерная верстка Е.Н. Мартемьяновой

Подписано в печать 19.07.2005. Формат 60х84¹/8. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,60. Тираж 859 экз. Зак. 460. С 1521.

ФГУП «Стандартинформ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ruinfo@gostinfo.ru Набрано в ИПК Издательство стандартов на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «Стандартинформ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

1

Отрицательную контрольную пробу по 6.2.1 подготавливают только при применении технологии FLASH (приложение Д).

2

Срок хранения Тад-полимеразы после разведения при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 2 ч.

3

Реакционную смесь для амПЦР готовят непосредственно перед анализом при температуре не выше

20 °С.

4

Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 °Сдо 8 °С — не более 2 ч.