Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков

Методические указания МУК 4.2.2602—10

Издание официальное

Москва • 2010

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков

Методические указания МУК 4.2.2602—10

МУК 4.2.2602—10

3.12. Предполагаемый штамм не должен угнетать рост представителей нормофлоры: зона угнетения роста должна быть менее 10 мм.

4. Методы исследования биологических свойств предлагаемых штаммов

4.1. Идентификация штамма до вида по фено~ и генотипическим признакам

Дифференциация и идентификация бактерий - определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов - наиболее ответственный этап микробиологического исследования. Он осуществляется на основании изучения комплекса свойств микроорганизмов: фенотипических и генотипических.

Фенотип - совокупность внешних признаков организма.

Генотип - совокупность генов определенного организма.

Организмы, обладающие одинаковыми генотипами, в разных условиях могут отличаться по фенотипу, т. е. может наблюдаться некоторое разнообразие фенотипов.

Определяется ряд фенотипических признаков: морфологические, тинкгориальные, культуральные, специфические ферментативные свойства, антигенные особенности, спектр чувствительности к антибиотикам, фагам и бактериоцинам, а также генотип: определение нуклеотидного состава ДНК и содержание ГЦ-пар в ДНК, уровень гомологии ДНК, профиль плазмидной ДНК, электрофоретип, степень вирулентности, патогенности.

Классически идентификацию штаммов по генотипическим признакам проводят на основе данных ДНК-ДНК гибридизации и содержания Г + Ц пар оснований ДНК. В настоящее время приемлемым способом является ПЦР-анализ с видо- и типоспецифическими праймерами для генов 16SpPHK, выявляющих нуклеотидные консервативные последовательности исследуемых микроорганизмов.

Для дифференцирования патогенных и апатогенных штаммов внутри вида информативным является обнаружение в составе ДНК бактериальной клетки геномных «островков» патогенности. Повышенная их лабильность связана с тем, что они могут входить в состав транспо-зонов, плазмид и включаться в геном баюериофагов, формируя у разных непатогенных видов бактерий вирулентность.

Исследования должны быть выполнены в аккредитованной лаборатории с использованием современного оборудования и технологий.

МУК 4.2.2602—10

4.2. Изучение морфологии и тинкториальных свойств культур

4.2.1, Микроскопия живых бактерий

Живые микробы исследуют в препаратах, приготовленных методом «раздавленной» и «висячей» капли.

Приготовление препарата «раздавленной» капли используют для выявления активной подвижности микробов. На предметное стекло наносят каплю 16—24-часовой бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным 0,9 %-м раствором натрия хлорида, т. к. наличие большого количества микробных тел в поле зрения затрудняет наблюдение за отдельными бактериями и их подвижностью. Нанесенную на предметное стекло каплю «раздавливают», накладывая на нее покровное стекло. При «раздавливании» капли нужно избегать образования в ней пузырьков воздуха. Для этого покровное стекло накладывают не сверху, а ставят на ребро у края капли и опускают постепенно, вытесняя воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами. Если часть жидкости выходит за края покровного стекла, ее отсасывают фильтровальной бумагой, зажатой браншами пинцета, и затем бумагу с культурой помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Препарат «раздавленной» капли, предназначенной для выявления подвижности микробов, рассматривают под микроскопом с увеличением (объектив х40 или х50, окуляр х10 или х15, при опущенном конденсоре).

При приготовлении «висячей» капли на середину обезжиренного покровного стекла наносят небольшую с четкими краями каплю бульонной культуры. После этого покровное стекло переворачивают каплей вниз и осторожно накладывают на предметное стекло с вышлифованным углублением-лункой так, чтобы капля не касалась дна.

«Висячую» каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (х8) находят край капли, отчетливо видимый в затемненном поле зрения. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильное увеличение (х40) или иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Подвижные бактерии проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения микроскопа, вращаясь вокруг своей оси. Неподвижные бактерии постоянно колеблются между двух близлежащих точек. Колебания эти обусловлены броуновским движением.

11

МУК 4.2.2602—10

4.2.2. Исследования бактерий в окрашенном виде

Готовят мазок из микробных культур на обезжиренном предметном стекле, высушивают и фиксируют мазок над пламенем горелки или химическим способом. Под микроскопом изучают мазки, окрашенные по Граму - для выявления грамотрицательных и грамположительных бактерий; по методу Циля-Нильсена - для окрашивания кислотоустойчивых бактерий и выявления спор; по способу Бурри или Гинса - для выявления наличия капсул; по способу Ожешко или Пешкова - для выявления спор; по способу Нейссера - для выявления зерен валютина; по способу Романовского-Гимзе - для изучения структуры протоплазмы и ядра клеток (при необходимости).

Наличие у исследуемых микроорганизмов капсул также выявляют негативным контрастированием, применяя жидкую черную тушь или 10 %-й водный раствор нигрозина. Эти красители не проникают в капсулу и поэтому она хорошо видна на общем темном фоне препарата. Каплю исследуемой суспензии микроорганизмов помещают в каплю разбавленного раствора фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом (х40).

Наличие спор можно обнаружить при изучении живых клеток: споры характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При обнаружении спор подготовленный препарат следует изучить с помощью фазово-контрастного устройства.

В отличие от вегетативных форм клеток споры обладают высокой термоустойчивостью и после пастеризации (температура прогрева выше 80 °С) остаются жизнеспособными.

Для идентификации культур следует описать вид спорообразования, расположение спор в клетке и их размеры.

Методы окрасок культур изложены в прилож. 1.

Предлагаемые штаммы не должны иметь капсулы.

4.3. Изучение культуральных свойств штамма

Культуральные свойства характерны для каждого вида бактерий, поэтому являются важным дифференцирующим признаком. Культуральные признаки бактерий определяют характером их роста на плотных, жидких и полужидких селективных и производственных питательных средах. Посев культуры на плотные питательные среды осуществляют методом Дригальского, чтобы получить изолированные колонии.

В паспорте на штамм следует описать размер, форму колоний, характер контура края, рельеф и поверхность колонии, цвет, структуру и

МУК 4.2.2602—10

консистенцию колонии. Подробно описать характер роста культуры на жидких и полужидких средах. Рост культуры следует изучить при минимальной, оптимальной и максимальной температуре роста, при выращивании в аэробных, анаэробных или условно анаэробных условиях.

При правильном отборе и селекции штамма не должно быть признаков диссоциации культуры (клеток и колоний) и не допускается присутствие в исследуемых культурах клеток и колоний, отличающихся по морфологическим свойствам от клеток и колоний предлагаемого штамма.

4.4. Изучение физиолого-биохимических свойств штамма

4.4. 7. Тест на сахаролитические ферменты Предназначен для дифференциальной диагностики микроорганизмов. Сахаролитическую активность предлагаемого штамма изучают с помощью зарегистрированных диагностических тест-систем для идентификации бактерий.

Предлагаемый производственный штамм должен полностью соответствовать по этим свойствам типовым штаммам видовой принадлежности согласно современной классификации «Определителя бактерий Берджи». Штаммы с неясной характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных.

4.4.2. Протеолитические свойства бактерий В процессе культивирования микроорганизмы выделяют во внешнюю среду различные протеолитические ферменты, которые можно разделить условно на две группы: в первую группу следует отнести ферменты, принимающие участие в обмене веществ микроорганизмов (дыхании, питании). Они расщепляют углеводы, белки, пептиды, аминокислоты, в результате чего образуются легкоусвояемые микроорганизмами продукты питания и продукты метаболизма - кислоты, перекиси, индол, сероводород и др. Во вторую группу следует включить ферменты, относящиеся к факторам патогенности (например: гиалуронидаза, фибрино-лизин, плазмокоагулаза, гемолизин, лицитиназа С, лизоцим, нейрамидаза).

Для оценки протеолитических свойств первой и второй групп чаще всего используются нижеприведенные методы.

Ферменты, относящиеся к факторам патогенности Тест на каталазную активность

Каталазная активность свойственна большинству патогенных аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и многие микро-аэрофилы каталазу не образуют.

13

МУК 4.2.2602—10

Каталаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода:

н₂о₂ -> н₂о + о₂

Для выявления каталазной активности наносят каплю 10 %-го раствора пероксида на колонию или суспензию клеток. Выделение 0₂, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции штаммами каталазы.

Предлагаемый штамм должен быть каталозоотрицательным.

Тест на продукцию лецитиназы

Готовят бульон с яичным желтком: один яичный желток асептически вносят в 400 мл стерильного МПБ, хорошо размешивают, разливают в стерильные пробирки по 4—5 мл и выдерживают в термостате при (37 ± 1) °С в течение 24 ч для проверки на стерильность (среда в пробирках не должна мутнеть).

В пробирку с бульоном вносят 1 петлю суточной культуры с плотной питательной среды и инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации регистрируют наличие беловатой мути и всплывающих хлопьев, свидетельствующих о продукции микроорганизмом лецитиназы.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать летициназу.

Определение плазмокоагулазной активности

Плазмокоагулазную активность изучают, используя сухую нитратную кроличью плазму или плазму крови, взятую из сердца. Перед исследованием сухую плазму разводят 1 : 5 стерильным 0,9 %-м раствором хлорида натрия, затем 0,5 мл разведенной плазмы вносят в стерильную пробирку и в ней суспендируют одну петлю 18—20-часовой агаровой культуры. Пробирки помещают в термостат при (37 ± 1) °С и через 1, 2, 3, 18 и 24 ч проверяют наличие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. В качестве контроля ставят реакцию со стафилококком, обладающим и не обладающим плазмокоагулазой. Одновременно у испытуемого штамма можно установить наличие фибринолитической активности.

Определение фибринолитических свойств

В стерильные пробирки вносят 0,1 мл цитратной плазмы, по 0,4 мл 0,9 %-го хлорида натрия, 0,25 мл 18—20-часовой бульонной культуры испытуемого штамма, 0,25 мл 0,25 %-го раствора СаС1₂* Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 ± 1) °С на 15—20 мин. Если в пробирке образуется сгусток (так же как в контрольной, куда вместо бульонной культуры добавляют питательную среду),

МУК 4.2.2602—10

то испытуемая культура не обладает фибринолитическими свойствами. Если отмечается разжижение сгустка через 2ч- культура характеризуется наличием фибринолизина. При дополнительном выдерживании реакции при (37 ± 1) °С и обнаружении растворения сгустка можно заключить, что культура обладает фибринолитической активностью.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать плазмокоагулазу и фибриноцим.

Тест на лизоцим (мурамидазу)

Лизоцимную активность штамма определяют микробиологическим методом, основанном на способности лизоцима расщеплять Ь-(1-4)-гликозидные связи мукополисахаридного комплекса клеточной стенки эталонного тест-штамма Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus).

Готовят плотную среду, содержащую убитую культуру Micrococcus luteus UBCR 2665. Для этого предварительно культуру Micrococcus luteus выращивают на чашках Петри, содержащих МПА, в течение 16 ч при температуре (37 ± 1) °С. Выросшую культуру смывают 0,9 %-м раствором натрия хлорида (Змл на чашку), автоклавируют 15 мин при 120 °С и сохраняют впрок при 4 °С (срок хранения суспензии - не более 1 года). В стерильные чашки вносят расплавленную плотную питательную среду, содержащую автоклавированную суспензию микрококка в концентрации 2 млрд в 1 мл по ОСО 42-28-59-85-П мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Испытуемые штаммы выращивают в жидкой (или плотной) питательной среде, используемой для их культивирования. Культуру 2-го пассажа засевают по одной посевной петле (диаметром 2—3 мм) бляшками на подготовленную подсушенную плотную среду, содержащую убитую культуру микрококка. На одну чашку наносят не более 5 штаммов, посевы инкубируют в течение 2—4 суток при температуре (37 ± 1) °С в аэробных, анаэробных или микроаэрофильных условиях в зависимости от вида испытуемого штамма и регистрируют зону лизиса микрококка вокруг выросших макроколоний испытуемых штаммов.

О степени лизоцимной активности судят по ширине зоны просветления: низкая - 1—3 мм, средняя - 4—7 мм, 8 мм и более - высокая.

Перед экспериментом целесообразно проверить тест-штамм Micrococcus luteus на лизируемость лизоцимом. Для этого, используя отраслевой стандарт мутности, готовят микробную взвесь с содержанием в 1 мл 10⁹ микр. кл. и разливают ее в 2 пробирки по 1 мл. В одну (опытную) добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл физиологического раствора, создавая конечную концентрацию фермента 4 мкг/мл.

15

МУК 4.2.2602—10

Во вторую (контрольную) прибавляют 1 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия. Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за этот период в опытной пробирке произойдет полный лизис клеток микрококка.

Примечание: некоторые виды нормальной микрофлоры (например, L. fermentum\ при отсутствии других факторов патогенности продуцируют лизоцим, что считается положительным свойством микроорганизма для воздействия на патогенную и условно-патогенную микрофлору.

Тест на гемолизин

Некоторые бактерии продуцируют гемолизины (вещества, разрушающие эритроциты), относящиеся к факторам патогенности. В связи с этим продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности.

На кровяном агаре выросшие колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и, соответственно, размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света. Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов. Виды гемолиза подразделяют на:

а-гемолиз - разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленовато-коричневую окраску;

р-гемолиз - полное разрушение эритроцитов с ферментативным обесцвечиванием гемоглобина. Колонии бактерий окружены прозрачными зонами гемолиза различного размера;

у-гемолиз - эритроциты остаются без изменения.

Гемолитические свойства микробов проявляются по-разному на средах с дефибринированной кровью человека, барана, кролика, морской свинки.

Проведение теста. В расплавленный и охлажденный до 48—50 °С 1,5 % МПА или в другую питательную среду прибавляют 5 % дефибринированной крови. После розлива среды в чашки Петри тонким слоем (1,5—2 мм) на застывшую и подсушенную поверхность штрихом делают посев 18-часовой культуры для получения изолированных колоний. Чашки инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 24—48 ч, после чего проводят учет результатов.

Для предохранения гемолизинов от разрушения кислородом посев культуры штрихом можно вначале произвести на питательный агар без

МУК 4.2.2602—10

крови. Затем на первый слой наслоить 10 мл агара (при 48—50 °С) с 5 % крови. Вокруг погруженных в агар колоний гемолиз проявляется более четко. В некоторых случаях гемолиз лучше выявляется, если после 24— 48-часовой инкубации чашек в термостате их помещают на 18—24 ч в холодильник.

При проведении реакции необходимо учитывать возможное воздействие на эритроциты образующихся в процессе жизнедеятельности ряда бактерий органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной и др.), которые могут вызывать изменения гемоглобина, сходные с гемолизом, т. е. давать ложноположительную реакцию гемолиза. Поэтому следует представить фактические данные, подтверждающие, что данный штамм не продуцирует гемолизины (отсутствие плазмид или участка гена, кодирующих синтез гемолизина).

Предлагаемые штаммы не должны давать зон гемолиза.

Определение гиалуронидазы

Определение гиалуронидазы устанавливают внутрикожной инъекцией животным смеси исследуемого фильтрата культуральной жидкости с трипановым синим. Сравнением площади распространения красителя, введенного в смеси с фильтратами, и самой краски устанавливают наличие диффузного фактора. Для исключения влияния на распространение краски местного воспаления опыты ставят не только на коже живого кролика, но и снятой (предварительно депилированной) коже. Животным - кроликам или морским свинкам - вводят 0,1 мл испытуемого фильтрата и 0,1 мл 10 %-го раствора трипанового синего. Результаты учитывают по отношению площади распространения краски в опыте и контроле - индекс диффузии.

Предлагаемый штамм не должен продуцировать гиалуронидазу.

Ферменты, участвующие в обмене веществ

Тест на продукцию желатиназы

1.    К питательной среде добавляют желатин (из расчета 10—15 г на 100 мл), разливают в пробирки столбиком. Посев испытуемой культуры осуществляют уколом, погружая петлю с культурой вглубь питательной среды. Засеянную культуру инкубируют в термостате при оптимальной для нее температуре в течение 1—2 сут. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят две пробирки с незасеянной культурой для контроля. При регистрации результатов учитывают интенсивность роста и форму разжижения желатиновой среды.

2.    О продукции желатиназы судят по обесцвечиванию полоски фотопленки, помещенной в пробирку с исследуемой культурой.

17

МУК 4.2.2602—10

Полоски фотопленки размером 25 х 3 мм, освещенной и проявленной, прокладывают кусками фильтровальной бумаги, помещают в чашку Петри и автоклавируют при 110 °С (0,5 атм.) в течение 30 мин.

Исследуемую культуру бактерий засевают в пробирки с МПБ, под пробку пробирки вставляют полоску стерильной фотопленки так, чтобы верхняя часть ее оставалась не погруженной в среду. Посевы инкубируют в термостате при (37 ± 1)°С. Если культура разжижает желатину, погруженная часть пленки становится прозрачной, а черная пыль редуцированного серебра выпадает на дно пробирки. Большинство бактерий, продуцирующих желатиназу, обесцвечивают полоску в течение суток. При отрицательных результатах посевы оставляют в термостате до 7 суток.

Предлагаемый штамм не должен разжижать желатину.

Тест на продукцию протеазы

У некоторых видов патогенных бактерий продукция протеазы является одним из факторов патогенности.

О продукции протеазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем казеин.

Приготовление агара с казеином. Готовят 2 %-й раствор казеина на 0,1 М трис-HCl буфере (pH 7—8). Раствор подогревают до (55 ± 0,5) °С и смешивают в равных объемах с раствором 2 %-го агара Дифко, охлажденного до той же температуры. Полученный казеиновый агар разливают в условиях стерильности по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара высевают культуру штрихом и инкубируют в термостате при (37 ± 1) °С в течение 18 ч. По окончании инкубации в чашки наливают 5 мл 5 %-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдают в течение 3 мин за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре.

Тест на продукцию амилазы

О продукции амилазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в картофельном агаре.

Приготовление картофельного агара. Очищенный от кожуры сырой картофель промывают, нарезают ломтиками, заливают водой из расчета 130 г на 1л воды, кипятят 30 мин, фильтруют и к фильтрату добавляют 20 г агара и 2 г NaCl. Нагревают, помешивая стеклянной палочкой до полного расплавления агара, если необходимо снова фильтруют, разливают в пробирки по 5 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве 30 мин при 110 °С (0,5 атм.) в течение 30 мин.

Готовый картофельный агар разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара культуру засевают штрихом, инкуби-

МУК 4.2.2602—10

руют в термостате при (37 ± 1) °С в течение 24 ч. Культуру в чашках заливают 5 мл раствора Люголя. Наблюдают в течение 5 мин за появлением светлых зон вокруг посевов.

Тест на продукцию липазы

О продукции липазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем ТВИН-20.

Готовят 2 %-й агар на 0,06 М фосфатном буфере (pH 7,4—7,6). ТВИН-20 нагревают на водяной бане до (55 ± 5) °С и вносят в расплавленный агар до конечной концентрации 1 %. Быстро перемешивают встряхиванием и добавляют 10 %-й раствор СаС1₂ до конечной концентрации 0,1 %. Тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют на водяной бане в течение 40 мин. Разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

Культуру, выращенную на МПБ при (37 ± 1) °С в течение 18—24 ч, высевают штрихом на агаровую среду с ТВИН-20 и инкубируют при (37 + 1) °С в течение 24 ч. По истечению срока инкубации регистрируют появление или отсутствие прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре.

Тест на продукцию аргениндегидрогеназы

Продукцию аргениндегидрогеназы изучают на среде Шеррис. Пробирку со средой Шеррис и контрольную (без аргинина) засевают 18-часовой культурой и заливают стерильным вазелиновым маслом. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 5 дней. О разложении аргинина свидетельствует появление фиолетовой окраски в опытной пробирке.

Для оценки этих свойств чаще всего используют желатин, молоко.

Тест на редукцию нитратов

Редукцию нитратов определяют после роста культуры на бульоне с нитратами в течение 24—72 ч. В каждую пробирку с засеянным нитратным бульоном прибавляют по 1 мл реактива (раствор № 1: 1 г растворимого крахмала, 0,5 г KJ, 100 мл дистиллированной воды; раствор № 2: 10 %-й раствор химически чистой H₂S0₄. Перед постановкой реакции равные части растворов смешивают. Реактив используется в течение 15 мин). Если нитрат восстановлен в нитрит, то наблюдается темносинее окрашивание. Для этих целей можно использовать реактив Грис-са. В присутствии нитратов отмечается розовое окрашивание.

Реакция Фогес-Проскауэра

Реакция Фогес-Проскауэра определяет наличие в среде ацетона. Для постановки реакции Фогес-Проскауэра культуру выращивают на среде Кларка 1—3 суток при температуре (37 ± 1) °С. Затем 1 мл куль-

19

ББК 35.66

С34

С34 Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.—60 с.

ISBN 978—5—7508—0945—5

1.    Разработаны ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (Н. В. Медуницын, А. А. Мовсесянц, Р. П. Чупринина, И. Г. Осипова,

В. Ф. Евлашкина, А. В. Ладыгина, Н. В. Терйшкина, М. В. Абрамцева).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.12.09 Ха 3).

3.    Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 21 апреля 2010 г.

4.    Введены в действие с момента утверждения.

5.    Введены впервые.

ББК 35.66

Редакторы Н. В. Кожока, Е. В. Николаева Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в печать 01.10.10 Формат 60x88/16    Печ.    л. 3,75

Тираж 200 экз.    Заказ    75

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения

Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел./факс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2010 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010

МУК 4.2.2602—10

туральной жидкости переносят в пробирку и добавляют 0,6 мл а-наф-тола (5 % раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл 40 %-го раствора КОН и взбалтывают. При положительной реакции через 2—5 мин наблюдается розовое окрашивание. В случае отрицательной реакции розового окрашивания не наблюдается и раствор принимает цвет меди.

Тест на гидролиз мочевины

О способности к гидролизу мочевины судят по покраснению среды, содержащей мочевину.

Готовят бульон с мочевиной: к 100 мл стерильного МПБ (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл крезолового красного (1,6 %-й спиртовой раствор). Разливают по 2—3 мл в стерильные пробирки, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин.

В пробирку с бульоном, содержащим мочевину, вносят 1 петлю суточной культуры с МПА, инкубируют в термостате при (37 ± 1) °С в течение 20—24 ч. Покраснение среды свидетельствует о наличии фермента уреазы и способности культуры гидролизовать мочевину.

Тест на расщепление тирозина

О разложении тирозина судят по исчезновению кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре.

Готовят агар с тирозином: 0,5 г L-тирозина суспендируют в 10 мл дистиллированной воды, помещают в пробирку, укупоривают ватномарлевой пробкой и автоклавируют при 110°С (1,5 атм.) в течение 30 мин. Охлажденный до (50 ± 5) °С раствор тирозина в стерильных условиях смешивают с 100 мл расплавленного стерильного МПА и разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара культуру высевают на чашки штрихом и инкубируют в термостате при (37 ± 1) °С в течение 24 ч. Наблюдают за исчезновением кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре.

Тест на утилизацию цитрата

Штамм должен утилизировать цитрат. Об утилизации цитрата судят по наличию роста культуры на среде Козера.

Готовят среду Козера:

NaCl * 5 г, MgS0₄ - 0,2 г, NH₄H₂P0₄ - 1 г, К₂НР0₄ - 1 г, агар - 20 г, Na лимонно-кислого - 2 г, дистиллированной воды до 1 л. Среду помещают в бутыль вместимостью 3 л, укупоривают ватно-марлевой пробкой, оборачивают пергаментом и стерилизуют при 110 °С (0,5 атм) 30 мин. Разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

После застывания агара культуру высевают на чашки с агаризован-ной средой Козера штрихом и инкубируют в термостате при (37 ± 1) °С

20

МУК 4.2.2602—10

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................5

2.    Требования к отбору производственных штаммов и доклиническому

испытанию лекарственной формы пробиотиков.................................................6

3.    Требования к характеристике предлагаемых производственных

штаммов..................................................................................................................9

4.    Методы исследования биологических свойств предлагаемых штаммов.........10

4.1.    Идентификация штамма до вида по фено- и генотипическим

признакам......................................................................................................10

4.2.    Изучение морфологии и тинкториальных свойств культур.......................И

4.3.    Изучение культуральных свойств штамма..................................................12

4.4.    Изучение физиолого-биохимических свойств штамма...............................13

4.5.    Адгезивная активность..................................................................................22

4.6.    Определение чувствительности культур к антибиотикам..........................25

4.7.    Тест на активность кислотообразования штамма........................................26

4.8.    Определение антагонистической активности исследуемых штаммов.......27

4.9.    Определение продукции бактериоцинов и чувствительности

бактерий к его действию..............................................................................29

4.10.    Определение устойчивости штамма к действию желудочного сока.......30

4.11. Тест на устойчивость штамма к щелочной реакции среды......................30

4.12. Тест на устойчивость штамма к повышенным концентрациям соли.......30

4.13.    Выявление штаммов-антагонистов (при конструировании

комплексных препаратов)............................................................................31

4.14.    Определение наличия фагов........................................................................32

5.    Определения вирулентности, токсигенности, токсичности,

безвредности.........................................................................................................32

5.1.    Экспериментальные животные.....................................................................32

5.2.    Определение вирулентности испытуемых штаммов...................................33

5.3.    Определение токсигенности испытуемых штаммов...................................34

5.4.    Определение токсичности испытуемых штаммов.......................................34

5.5.    Определение безвредности испытуемых штаммов.....................................35

5.6.    Определение дермонекротических свойств испытуемых штаммов...........35

6.    Изучение «острой» и «хронической» токсичности штаммов и

лекарственной формы пробиотиков....................................................................36

6.1.    Экспериментальные животные.....................................................................36

6.2.    Изучение «острой» токсичности...................................................................36

6.3.    Определение «хронической» токсичности...................................................37

6.4.    Патоморфологическое исследование...........................................................39

6.5.    Фиксация и промывка материала..................................................................39

6.6.    Методика окраски срезов..............................................................................40

3

МУК 4.2.2602—10

токсичности...................................................................................................43

7.    Способы введения культуры штаммов животным.............................................44

7.1.    Внутривенный способ введения....................................................................44

7.2.    Внутрибрюшинный способ введения..................................................... 44

7.3.    Пероральное введение...................................................................................44

7.4.    Подкожный способ введения........................................................................45

7.5.    Внутри кожный способ введения...................................................................45

8.    Хранение рекомендованных к производству штаммов.....................................46

Приложение /. Способы окраски мазков................................................................47

Приложение 2. Рецепты приготовления красок и реактивов,

необходимых для окрашивания бактериальных

препаратов.......................................................................................50

Приложение 3. Состав питательных сред...............................................................54

Литература.......................... 60

4

МУК 4,2.2602—10

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

21 апреля 2010 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков

Методические указания _МУК 4.2.2602—10_

1. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания (МУК) устанавливают требования к штаммам, используемым при производстве пробиотиков, и методам предрегистрационного доклинического изучения их биологических свойств, условиям сохранения и контроля основных показателей качества предлагаемых производственных штаммов, оценке безопасности штаммов и пробиотиков.

1.2.    Соблюдение настоящих методических указаний обязательно для всех предприятий и организаций, осуществляющих разработку или производственный выпуск пробиотиков.

1.3.    Новые штаммы, используемые при производстве пробиотиков, апробирует Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора).

1.4.    ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора хранит коллекцию производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Изученные штаммы должны поступать в ФГУН ГИСК

5

МУК 4.2.2602—10

им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора с соответствующей характеристикой.

1.5. Методические указания также предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством продукции, выпускаемой соответствующими предприятиями.

2. Требования к отбору производственных штаммов и доклиническому испытанию лекарственной формы пробиотиков

К штаммам, на основе которых разрабатываются живые биопрепараты - пробиотики, предъявляются следующие требования:

2.1.    Должен быть известен источник и дата выделения штамма. Для изготовления пробиотиков целесообразно использовать штаммы, выделенные от здорового человека. Предпочтение должно быть отдано видам микроорганизмов, которые являются представителями нормальной микрофлоры человека. Штамм должен быть депонирован в национальной или международной коллекции.

2.2.    Штаммы должны относиться к виду, не вызывающему заболевания у люден.

2.3.    Культура выделенного штамма должна быть однородной по культуральным и биохимическим свойствам, не диссоциировать на используемых питательных средах.

2.4.    Выделенные штаммы должны быть идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам; генетическая характеристика штамма должна иметь сведения но содержанию (отсутствию) внехромо-сомных факторов наследственности - плазмид, транспозонов, бактериофагов. При характеристике микроорганизмов следует использовать генетические и фенотипические методы, позволяющие сравнивать последовательности генов с музейными штаммами национальных или международных коллекций и выявлять их молекулярно-генетический полиморфизм.

2.5.    Должна быть установлена природа резистентности штамма к антибиотикам, если такой факт выявлен. Для производства пробиотиков следует использовать штаммы, резистентность к антибиотикам которых обусловлена хромосомной природой.

2.6.    Для генетически модифицированных штаммов должно быть установлено отсутствие неконтролируемого переноса клонируемой ДНК

6

МУК 4.2.2602—10

«новым хозяевам», широкого распространения гибридной векторной плазмиды и вероятного нарушения микробной экосистемы, т. е. их биобезопасность. Кроме того, согласно требованиям ВОЗ штамм, используемый в качестве вектора, должен стабильно экспрессировать чужеродные антигены и не иметь маркеров антибиотикорезистетности. Должны быть представлены фактические материалы по стабильности изученных биологических свойств для рекомбинантных штаммов при многократном культивировании и длительном применении их на лабораторных животных.

2.7.    Штаммы всех видов микроорганизмов, предлагаемые для производства пробиотиков, должны быть не вирулентными, не токсиген-ными, не токсичными, безопасными для людей, включая при необходимости иммунологическую безопасность.

2.8.    Обоснование выбора штаммов должно быть подтверждено материалами исследования на лабораторных животных механизма их терапевтического действия.

2.9.    Штаммы должны обладать антагонистическими свойствами по отношению к клиническим и тест-штаммам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, не должны угнетать рост представителей нормофлоры.

2.10.    Штаммы должны быть охарактеризованы по способности продуцировать полезные для человека биологически активные вещества (например ферменты, витамины, биологически активные вещества, бак-териоцины, бактериостатины, кислоты и др.).

2.11.    Предлагаемые производственные штаммы должны быть изучены на устойчивость к действию желудочного сока, щелочи, желчи.

2.12.    Рекомендуемые для производства штаммы должны удовлетворять технологическим требованиям:

•    сохранять выработку полезных биологически активных веществ при «т> количестве пассажей штамма на используемых в производстве питательных средах;

•    при разработанной технологии изготовления пробиотиков должно быть стандартное получение жизнеспособной биомассы до и после лио-фильного высушивания или экспрессия заданных (встроенных) антигенов;

•    сохранять стандартность и стабильность всех показателей качества на протяжении срока годности.

2.13.    При разработке комплексных препаратов, включающих разные виды микроорганизмов или несколько штаммов одного вида:

7

МУК 4.2.2602—10

•    должен быть обоснован подбор штаммов для комплексного препарата (например подобранные штаммы отличаются друг от друга по ферментативным свойствам, антагонистической активности, продукции биологически активных веществ, механизму действия или другим свойствам);

•    все входящие в состав препарата ингредиенты, в т. ч. количественное соотношение производственных штаммов, должны быть лимитированы и колебаться в достаточно ограниченных пределах;

•    при количественной оценке специфической активности - показателя количественного содержания живых бактерий, входящих в состав препарата, каждый вид микроорганизмов должен быть четко идентифицирован по морфологическим и культуральным свойствам.

2.14.    Заключение о возможности испытания усовершенствованного или нового препарата на людях должно основываться на результатах доклинического изучения его токсичности, безвредности, а также сопоставления соотношения терапевтической и безопасной дозы с учетом пути введения разовой дозы для человека и схемы назначения человеку.

2.15.    В случае включения в состав готового препарата дополнительных компонентов или вспомогательных веществ (сорбентов, наполнителей и др.) на них следует представить материалы, свидетельствующие о возможности (безопасности) их введения человеку, и изучена безопасность готовой формы препарата в опытах на животных.

2.16.    Для определения терапевтической активности следует использовать лабораторные модели, позволяющие получать данные, коррелирующие в определенной степени с результатами применения препарата у людей.

2.17.    «Острую» и «хроническую» токсичность предлагаемых штаммов (каждого в отдельности, а для комплексного препарата дополнительно и смеси штаммов) следует изучать на двух видах животных с применением разных доз и способов введения (внутривенное, внутри-брюшинное, пероральное и др.) в зависимости от способа введения препарата.

2.18.    При испытании «острой» и «хронической» токсичности штаммов и лекарственной формы препарата определяют их побочное действие на внутренние органы лабораторных животных путем макроскопического и микроскопического исследования внутренних органов. При получении результатов, свидетельствующих о безопасности предполагаемых производственных штаммов, переходят на изучение терапевтической активности и безвредности лекарственной формы препарата.

МУК 4.2.2602—10

2.19. В готовой форме препарата оценивают соотношение терапевтической и безопасной дозы, подтверждают механизм действия, сохранение продукции биологически активных веществ, живых микробных клеток на протяжении срока годности препарата.

3. Требования к характеристике предлагаемых производственных штаммов

3.1.    Источником выделения штамма должен быть здоровый человек.

3.2.    Предлагаемый штамм должен быть идентифицирован до вида по фено- и генотипическим признакам, по профилю плазмидной ДНК. Штамм, имеющий плазмиды, транспозоны, бактериофаги, не может быть использован при производстве пробиотиков.

3.3.    Предлагаемый штамм не должен подвергаться генно-инженерным модификациям.

3.4.    Штамм, независимо от вида и рода, должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, культуральными свойствами без признаков диссоциации. Штамм с неясной характеристикой не должен быть рекомендован для производственных целей. Не допускается наличие слизистых колоний и капсул.

3.5.    Штамм должен быть однороден по физиолого-биохимическим свойствам, охарактеризованным с помощью регламентированных методов или с использованием зарегистрированных тест-систем. Штаммы с неясной характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных.

3.6.    Штамм не должен продуцировать ферменты, относящиеся к факторам патогенности: каталазу, гиалуронидазу, фибринолизин, гемолизин, летициназу С.

3.7.    Устойчивость штамма к антибиотикам должна быть обусловлена хромосомной природой.

3.8.    Штамм должен быть охарактеризован по способности продуцировать биологически активные вещества (например лизоцим, бакте-риоцины, антибиотикоподобные вещества и др.).

3.9.    Штамм должен обладать антагонистической активностью по отношению к клиническим свежевыделенным патогенным и условно-патогенным бактериям и к регламентируемым тест-штаммам. Зона угнетения роста тест-культур должна быть более 10 мм.

ЗЛО. Штамм не должен обладать высокими адгезивными свойствами.

3.11. Штамм не должен быть вирулентным, токсигенным, токсичным.