Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в богве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3510—17

Издание официальное

Москва • 2018

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3510—17

7.4.3.4. Раствор N9 4 с концентрацией 0,05 + 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до подвижной фазой.

Основные растворы азоксистробина и Z-азоксистробина можно хранить в холодильнике при температуре 0—4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения азоксистробина и Z-азокси-стробина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация азоксистробина и его метаболита в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации азоксистробина и его метаболита в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент СК) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

1^Ю0<Д„_,где

С - аттестованное значение массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

С_к — результат контрольного измерения массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

^контр.

норматив контроля градуировочного коэффициента, % {Контр = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения азоксистробина и его метаболита на патроне для твердофазной экстракции В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора азоксистробина и его метаболита с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон. Промывают патрон 3 см³ элюента № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют азоксистробин и его метаболит 10 см³ элюента № 2 со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие азоксистробин и его метаболит объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб свеклы производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 52647-06 «Свекла сахарная. Технические условия». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке.

9. Проведение определения

9.1. Определение азоксистробина и его метаболита в ботве и корнеплодах свеклы Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 10 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см\ переносят в центрифужную пробирку вместимостью

15 см³, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 1 см³, упаривают досуха в токе воздуха при температуре не более 40 °С. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции Диапак С (п. 9.2).

9.2. Очистка па патроне для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1), растворяют в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 3 см³ элюента № 1. Азоксистробин и его метаболит элюируют 5 см³ элюента № 2. Элюат переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстроскани-рующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45 : 55. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание азоксистробина и его метаболита в пробе (А', мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика азоксистробина или его метаболита на хроматограмме испытуемого образца (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств азоксистробина и его метаболита в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор азоксистробина с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

2-|*,-*,|-100 (х,+х_:)    ~^г'

X_lt Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг; г - значение предела повторяемости (г = 2,8о>).

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± Д), мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

6 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где * 0,05 мг/кг - предел обнаружения азоксистробина в корнеплодах свеклы).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1.    Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.    Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода «добавок».

Величина добавки Со должна удовлетворять условию:

= А,.* + А . ,., где

± Д, _х (± Д_{л х},) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

А, = ± 0,84 А А - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

д - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

К_к = Х'~ Х-Се, где X, Х_у C₍i - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

К = Ja]_x. + А]_х    (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

\К_к\<К    (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (/?):

Xh Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3510—17

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 24.12.18 Формат 60x88/16    Псч.    л. 1,0

Тираж 100 экз.    Заказ    79

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Федеральным центром гишены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Реализация печатных изданий, тел.: 8 (495) 633-86-59

ББК 51.23 0-60

0-60 Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—15 с.

ISBN 978-5-7508-1669-9

1.    Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (И. А. Цибульская, Т. Д. Чсрмснская, А. А. Далинова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

ISBN 978-5-7508-1669-9

© Роспотребнадзор, 2018

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

29 декабря 2017 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания _МУК    4.1.3510—17_

Свидетельство об аттестации методики измерений №01.5.04.237/ 01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0,05—0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Азоксистробин

Метил (Е)-2- {2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил} -3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная фориула:

СИ,

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C22H17N3O5.

Бесцветное кристаллическое вещество без цвета и запаха.

Температура плавления: 116°С. Давление паров: 1,1 х Ю"⁷ МПа (20 °С). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP = 2,5 (20 °С).

Растворимость в воде (20 °С): - 6 мг/дм³. Растворимость (г/дм³, 20 °С): в гексане - 0,057, в толуоле - 55, ацетонитриле - 340, метаноле -20, октаноле - 20, ацетоне - 86. Гидролитически стабилен при комнатной температуре при pH 3—10. Фотолиз азоксистробина протекает с образованием Z-изомсра.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс ЛД50 > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность ЛД50 > 2 000 мг/кг, ингаляционная токсичность ЛК₅₀ > 0,7 мг/м³. Малотоксичен для пчел и шмелей.

Область применения. Фунгицид системного и контактного действия, имеет длительный защитный эффект, высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, пятнистости листьев зерновых, ржавчины и корневых гнилей на рисе, томате, картофеле и др.

Z-азоксистробин

Метил (2)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил>-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная фориула:

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C22H17N3O5.

Кристаллическое вещество желтого цвета, физико-химические свойства близки к свойствам азоксистробина.

Гигиенические нормативы для азоксистробина в России: МДУ в овощах со съедобными клубнями и корнями (кроме картофеля) -1,0 мг/кг.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности

Р = 0,95 нс превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анали зируе мый объект	Диапазон опреде ляемых концен траций, мг/кг	Показатель точности^ (границы относительной погрешности (Р = 0,95), ±ё, %	Показатель повторяемости (относительное средне-квадратическое отклонение повторяемости), <7Г, %	Показатель воспроизводимости (относительное сред-неквадра-тичсское отклонение воспроизводимости), (Jr% %	Предел повторяемости (значение до-пустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), г,%	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), /?, %(Р = 0,95)
Азоксистробин
Ботва	0,05—0,5	25	11	15	31	42
Корне плоды	0,05—0,5	25	11	15	31	42
Z-азоксистробин
Ботва	0,05—0,5	25	11	15	31	42
Корне плоды	0,05-0,5	25	11	15	31	42
*) соответствует расширенной неопределенности Ц**, (в относительных единицах) при коэффициенте охвата к = 2

Таблица 2 Полнота извлечения азоксистробина и Z-азоксистробина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для п = 20,Р= 0,95

Анализируемый объект Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг 11олнота извлечения, % Стандартное отклонение, S Доверительный интервал среднего результата, ± % Азоксистробин Ботва 0,05 0,05—0,5 88,5 4,73 2,07 Корнеплоды 0,05 0,05—0,5 85,6 3,68 1,61 Z-азоксистробин Ботва 0,05 0,05—0,5 88,4 5,77 2,53 Корнеплоды 0,05 0,05—0,5 84,3 4,24 1,86

2. Метод измерений

Метод основан на определении азоксистробина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии цитратного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции и на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация азоксистробина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерении

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг Дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм³ и от 100 до 1 000 мм³ Колбы мерные на 100, 500 и 1 000 см³ Цилиндры мерные на 50 и 100 см³

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Z-азоксистробин, с содержанием основного вещества 97,3 %

Азоксистробин, с содержанием основного вещества 99,3 %

Ацетон, осч    ТУ 2633-048-7811997

Ацетонитрил для ВЭЖХ    ТУ 2634-002-04715285—12

Вода для лабораторного анализа (бидистил-лированная, деионизованная)

Гексан, чда

Динатрия цитрат сесквигидрат, 99 %

Кислота ортофосфорная 98 %, хч Магний сернокислый безводный, 99 % Натрий сернокислый безводный, хч Натрий хлористый, чда Натрия цитрат двуводный, 99 %

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, с постоянной активностью 0,6 г

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005М ортофосфорной кислоты в соотношении 45 : 55 Смесь первичных и вторичных аминов,

№ 5982-5753

Элюент№ 1: гексан-ацетон в соотношении 4 : 1 по объему

Элюент№ 2: гексан-ацетон в соотношении 2 : 1 по объему

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции Воздушный испаритель Пробирки полипропиленые центрифужные с крышками объемом 50 и 15 см³ Устройство перемешивающее (50—200 колебаний в минуту)    ТУ 4389-007-44330709—11

Центрифуга со скоростью вращения 4 000 об./мин

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313—03 и ГН 2.2.5.2308—07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.

4.3.    При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

-    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

-    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1—0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2,5 см³ элюента № 2, затем 3 см³ элюента № 1.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1.    0.005Мраствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1.    Основной раствор азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску азоксистробина (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см , растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2.    Основной раствор Z-азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску Z-азоксистробина (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.3.    Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями азоксистробина и Z-азоксистробина 0,05 + 0,05; 0,1 + 0,1; 0,2 + 0,2; 0,5 + 0,5 мкг/см³ соответственно, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

7.4.3.1.    Раствор № I с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,1 см³ основного раствора азоксистробина и 0,1 см³ основного раствора Z-азоксистробина и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3.2.    Раствор № 2 с концентрацией 0,2 + 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.3.3.    Раствор № 3 с концентрацией 0,1 + 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.