Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение химических соединений и элементов в биологических средах, молочной продукции и объектах окружающей среды
Сборник методических указаний МУК 4.1.3474—4.1.3482—17
Выпуск 2
Издание официальное
Москва • 2018
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
4.L МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение химических соединений и элементов в биологических средах, молочной продукции и объектах окружающей среды
Сборник методических указаний МУК 4.1.3474—4.1.3482—17
Выпуск 2
МУК 4.1.3482—17
Центрифуга лабораторная:
Скорость центрифигурирования - от 100 до 3 ООО об./мин; максимальная центрифугальная сила-до 1 900 g ГОСТ 12.2.091-02
Перемешивающее устройство: регулируемая частота колебаний платформы 0—250 кол ./мин; максимальное перемещение платформы - 25 мм; максимальная регулируемая температура нагрева платформы - 80 °С ТУ 64-1-1081—73
Встряхиватель: скорость вращения гнезда -50—4 000 о6./мин; орбитальное вращение Шкаф сушильный: диапазон рабочих температур - от 50 до 320 °С; точность измерения температуры — ± 0,5 °С Микрошприц объемом 500 мкл
Азот газообразный ГОСТ 9293-74
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4* Требования к безопасности
4.1. При выполнении измерений соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1,005—88 и по ГОСТ 12.1.007-76.
4.2. При работе с легковоспламеняющимися веществами необходимо соблюдать меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.
4.3. При выполнении измерений на жидкостном хроматографе необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.
4.4. При работе со сжатыми газами необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Ростехнадзором приказом от 25.03.2014 №116) и ГОСТ 12.2.085-02. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
4.5. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточновытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-—03 (ГН 2.2.5.2308—07).
137
4.6, Необходимо провести обучение работающих безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.
5. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
6. Требования к условиям измерений
6.1. При выполнении измерений в лаборатории должны быть выполнены следующие условия:
- температура воздуха: (20 ± 5) °С;
- атмосферное давление: 84—106 кПа (630—800 мм рт. ст.);
- относительная влажность воздуха: не более 80 %.
6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят при следующих условиях:
- напряжение питания: (220 ± 10) В;
- частота переменного тока: (50 ± 10) Гц.
6.3. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.
6.4. Для предотвращения разрушения витамина Ki анализ сыворотки и стандартов проводят, предохраняя пробы от попадания прямого солнечного света и воздействия повышенных температур. Анализ сыворотки крови необходимо проводить в течение 2—6 часов после забора крови.
7. Подготовка к выполнению измерений
При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографических колонок, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовку крови для анализа.
7J. Подготовка хроматографических колонок
На хроматограф последовательно устанавливают предколонку, колонку.
Перед проведением измерения необходимо установить скорость подачи элюента 1 см3/мин до установления равновесия в колонке, которое определяется по стабильности нулевой линии детектора.
МУК 4.1.3482—17
7,2. Приготовление растворов
Элюент для хроматографии - метанол: ацетонитрил: хлористый метилен (45: 50: 5). В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 250 см3 ацетонитрила, 25 см3 хлористого метилена и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают, дегазируют фильтрованием через воронку Шотта в колбу Бунзена, присоединенную к вакуумному насосу (или дегазируют с помощью блока автоматической дегазации и фильтрации растворителя). Срок хранения полученного раствора в холодильнике при температуре 2—8 °С в темной посуде 1 год.
Растворы витамина Kj.
Раствор А - основной раствор с массовой концентрацией витамина Kj 220 мкг/см3 В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят около Уз объема этилового спирта, закрывают пробкой и взвешивают, затем иглой вносят каплю (0,0038 г) витамина Kt и снова взвешивают. Тщательно перемешивают до полного растворения витамина, доводят до метки этиловым спиртом, затем содержимое вновь перемешивают. Полученный раствор хранят в холодильнике при температуре 2—8 °С в темной посуде не более 6 месяцев.
Раствор Б с массовой концентрацией витамина Kj 0,22 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 25 см3 с помощью дозатора вносят 0,025 см3 раствора А, доводят этиловым спиртом до метки и содержимое тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в холодильнике при температуре 2—8 °С не более 2 месяцев.
Рабочие градуировочные растворы. В мерные колбы вместимостью 10 см3 сначала вносят 2—3 см3 этилового спирта, затем с помощью дозатора вносят определенный объем раствора Б, в соответствии с табл. 2, и добавляют этиловый спирт до метки, содержимое тщательно перемешивают. Срок хранения в холодильнике при температуре 2—8 °С не более 2 недель.
Таблица 2
Приготовление градуировочных растворов витамина Kj |
№ градуировочного раствора |
Объем раствора Б (V), см3 |
Концентрация витамина Ку в градуировочном растворе (С), нг/см3 |
1 |
2,000 |
44,0 |
2 |
1,000 |
22,0 |
3 |
0,500 |
11,0 |
4 |
0,200 |
4,4 |
5 |
0,057 |
2,5 |
|
139 |
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины аналитического сигнала от массовой концентрации витамина Kj (нг/см3), устанавливают путем измерения высот пиков витамина Kj в градуировочных растворах, приготовленных по п. 7.2.
Каждый из градуировочных растворов в количестве 0,5 см3 шприцем вводят в хроматографическую систему, с помощью петлевого дозатора отсекается по ОД см3, которые анализируются без термостатирова-ния колонки в следующих условиях:
- скорость движения элюента 1 см3/мин
- длина волны спектрофотометрического детектора 248 нм
- время удерживания витамина К| 17—18 мин
Для каждого анализируемого раствора проводят 5 параллельных
измерений. По средним арифметическим значениям из пяти результатов измерения высот пиков в программе сбора и обработки хроматографических данных строится градуировочный график в координатах: «концентрация витамина (С^), нг/см3» - «высота пика витамина (Н), мВ». Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5 % от средних значений. Линейная зависимость должна соблюдаться во всем диапазоне определяемых концентраций.
7.4. Отбор и подготовка проб крови для анализа
Венозную кровь отбирают в количестве 5 см3 утром натощак. Для получения сыворотки кровь термостатируют в течение 30 мин при 37 °С, затем аккуратно обводят по всему радиусу пробирки стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 3 ООО об./мин. Далее сыворотку (верхний слой) отделяют в пробирки типа Эппендорф и используют для анализа.
В центрифужные стеклянные пробирки с притертой пробкой помещают по 0,8 см3 сыворотки, добавляют равное количество этилового спирта (для осаждения белка), встряхивают в течение 2—3 с на встряхи-вателе со скоростью вращения гнезда 2 ООО об./мин. Затем к смеси добавляют 0,8 см3 гексана, пробирки плотно закрывают пробкой и перемешивают в течение 15 мин на перемешивающем устройстве, при этом пробирки закрывают черной бумагой для предотвращения прямого воздействия света. Далее пробы центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3 000 об./мин. Аликвоты гексановых экстрактов в количестве 0,5 см3 переносят в пробирки типа Эппендорф и упаривают в токе азота досуха. Остатки растворяют в 0,5 см3 элюента. Для каждой пробы выполняют два параллельных измерения.
МУК 4.1.3482—17
Примечание. Процедуры перемешивания и центрифугирования необходимо проводить в темноте, при охлаждении.
8. Выполнение измерений
После выхода хроматографа на режим в дозирующее устройство прибора микрошприцем вводят 0,5 см3 одного из градуировочных растворов (обычно с концентрацией, лежащей в середине рабочего диапазона) и анализируют в условиях, указанных в п. 7.3. По окончании хроматографического анализа определяют время удерживания витамина Ki и высоту пика Далее величина высоты полученного пика наносится на градуировочный график (с целью корректировки градуировочной характеристики).
Затем в дозирующее устройство вводят 0,5 см3 анализируемого раствора и так же анализируют в условиях, указанных в п. 7.3. По окончании хроматографического анализа проводят ручную разметку пиков и идентификацию обнаруженных пиков. Витамин Kj идентифицируют по времени удерживания: совпадение времени удерживания витамина Кх в пробе с временем удерживания витамина К{ в градуировочном растворе (с ошибкой не более 5 %) свидетельствует о правильной идентификации.
9. Обработка результатов измерения
Количественный расчет массовой концентрации витамина Кх осуществляют с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. Используют метод абсолютной градуировки. При этом концентрация витамина К* в пробе (Спр, нг/см3) считается автоматически.
Вычисляют среднее арифметическое двух параллельных измерений Спри Спр2у расхождение между которыми не должно превышать 5 % от среднего значения:
Спр - массовая концентрация витамина К3 в сыворотке крови, нг/см3.
Результат считают удовлетворительным, если выполняется следующее неравенство:
С„-Сш <С-+С>-.. г , где (4)
max min — 200 5 4 J
Стах и Стт ~ максимальный и минимальный результат единичных измерений;
141
г - предел повторяемости (допускаемое расхождение между результатами единичных измерений), %.
Значения предела повторяемости г представлены в табл. 1.
При превышении предела повторяемости определение повторяют. При повторном превышении норматива повторяемости выясняют причины, приводящие к получению неудовлетворительных результатов, и устраняют их.
10* Оформление результатов анализа
Результат количественного анализа «С», нг/см3 представляют в виде:
С± А (р = 0,95), где А =—* С F 100
С - среднее арифметическое результатов параллельных определений, признанных приемлемыми, нг/см ,
б - относительная погрешность определения массовой концентрации витамина Кь %, приведенная в табл. L
Примечание. Числовые значения результата измерений оканчиваются цифрой того же разряда, что и значение показателя точности методики измерений (абсолютной погрешности измерений массовой доли определяемого компонента).
11* Контроль качества результатов измерений
ILL Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводится каждый раз перед началом анализа и через каждые пять проб по раствору стандартного образца. Рекомендуется, чтобы концентрация уточняющего стандарта находилась примерно в середине диапазона концентраций, в котором предполагается проводить измерения, в случае же если он заранее неизвестен, то в середине диапазона градуировочного графика.
Контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется путем сравнения данных о содержании витамина Кь полученных с помощью градуировочной характеристики, с реальным содержанием витамина К\ в контрольном растворе.
Стабильность градуировочной характеристики считают удовлетворительной, если для контрольной точки выполняется следующее условие:
с0
МУК 4.1 .3482—17
С0 - Сг - расхождение между аттестованным значением массовой концентрации раствора стандартного образца и концентрацией, определенной с помощью градуировочной характеристики, нг/см3;
С0 - концентрация раствора, приготовленного из ГСО, нг/см3;
Сг - массовая концентрация витамина Kh определенная по градуировочной характеристике, нг/см3;
Кг - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики: Кг= 1,96 • где
oR - показатель воспроизводимости, приведен в табл. 1.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если отклонение не превышает ± Кг, Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. Если результат повторного сравнения неудовлетворителен, то выясняют причины, приводящие к получению неудовлетворительных результатов контроля, и устраняют их. В случае невозможности устранения причин, приводящих к превышению норматива контроля стабильности градуировочной характеристики, градуировку проводят заново.
1L2. Контроль енутрилаборат&рной прецизионности
Для контроля внутрилабораторной прецизионности используют рабочие пробы. Две параллельные пробы анализируют в соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т. е. в разное время, разными исполнителями, с использованием разных наборов посуды.
Внутрилабораторную прецизионность результатов измерений считают удовлетворительной, если расхождение между результатами анализа, полученными в одной лаборатории (в разное время, разными исполнителями, с использованием разных партий средств измерений) не превышает предела внутрилабораторной прецизионности Ял — 0,84 R:
С -С’ <С°™+С™.r где
max тш - 200
Стах, Стт — максимальный и минимальный результаты анализа при контроле внутрилабораторной прецизионности, нг/см3;
Стах — Стт - фактическое расхождение между результатами анализа, нг/см3;
R - предел прецизионности, приведенный в табл. 1.
При удовлетворительных результатах контроля внутрилабораторной прецизионности приемлемы оба результата анализа, а в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение.
143
При превышении предела внутрилабораторной прецизионности R4 могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов анализа согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.
113, Оперативный контроль точности
Контроль точности результатов измерений проводят методом добавок в рабочие сыворотки крови.
Отобранную сыворотку крови делят на две части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат определения витамина К3 в пробе (С), нг/см3. Во вторую часть вносят добавку (Q) определяемого элемента, используя стандартные растворы. Содержание добавки должно составлять 50—150 % от содержания витамина К3 в пробе.
Результат контроля считается удовлетворительным при выполнении условия:
Кк = |(С — С)~~Сд\<К(ь где
С - результат определения массовой концентрации витамина К3 в пробе с добавкой, нг/см3;
С - результат определения массовой концентрации витамина К3 в рабочей пробе без добавки, нг/см3;
Сб - действительное содержание элемента в добавке к пробе, рассчитанное исходя из значения его содержания в стандартном образце, нг/см3.
Кд - норматив оперативного контроля точности.
Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формуле:
Ка = 0,84 • (Д, )2 + (Д2)2 , где
Д3 и Д2 - абсолютные погрешности определения массовой концентрации витамина К! в пробе (Q и в пробе с добавкой (С) соответственно. Значения Д3 и Д2 рассчитывают по формулам:
Ai = 0,01 * S * С; А2 - 0,01 * 3 ■ С', где
S - относительная погрешность определения массовой концентрации витамина Кь приведенная в табл. 1.
Методические указания разработаны ФБУН «Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии» Роспотребнадзора (Соколова О. В., Потапова И. А.).
ББК 28.072 062
062 Определение химических соединений и элементов в биологических средах, молочной продукции и объектах окружающей среда: Сборник методических указаний. Выл. 2.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—144 с.
ISBN 978-5-7508-1631-6
1. Подготовлены коллективом авторов ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований». Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», ФБУН «Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии» Роспотребнадзора, ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека {протокол от 22 декабря 2016 г. №. 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 15 июня 2017 г.
4. Введены впервые.
ББК 28.072
Редактор JL С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой
Подписано в печать 29.05.18 Формат 60x84/16 Печ. л. 9,0
Т ираж 100 экз. Заказ 30
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7
Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Федеральным центром гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а
Реализация печатных изданий, телУфакс: 8 (495) 952-50-89
© Роспотребнадзор, 2018
МУК 4.13474—4.13482—17
Содержание
Введение.................................... 4
Измерение массовой концентрации тиодигликолевой кислоты в моче методом капиллярной газожидкостной хроматографии:
МУК 4,13474—17 ......................... $
Измерение массовой концентрации тиодиуксусной кислоты в моче методом газовой хромато-масс-спектрометрии: МУК 4.13475—17.............................. 18
Измерение массовой концентрации фторид-ионов в пробах волос потенциометрическим методом с применением ионоселективного электрода: МУК 4.13476—17............... 31
Измерение массовой концентрации монохлоруксусной кислоты в пробах
мочи методом капиллярной газовой хроматографии: МУК 4.13477—17......43
Измерение содержания летучих N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в молочной продукции (детские каши) хромато-масс-спектрометрнческим методом: МУК 4.13478—17.......... 55
Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов
(N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в крови методом капиллярной газовой хроматографии: МУК 4.13479—17 ...................... 71
Измерение массовых концентраций химических элементов (кадмий, свинец, мышьяк, ртуть) в молоке и молочных продуктах методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой: МУК 4.13480—17...........84
Измерение массовых концентраций химических элементов в атмосферном воздухе методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой:
МУК 4.13481—17............................................ 106
Измерение массовой концентрации витамина К1 в сыворотке крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):
МУК 4.13482—17............... 132
3
Введение
Включенные в сборник 9 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, объектах окружающей среды и молочной продукции предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках сощшльно-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.
Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов», МИ 2335— 95 «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа», МИ 2336—95 «Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания».
Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002—94 «ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм».
В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 6 органических соединений в биологических средах (моча, кровь) и молочной продукции, 4 тяжелых металлов в молочной продукции и 20 тяжелых металлов и элементов в атмосферном воздухе. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газожидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии с применением ионселективного электрода.
Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
4
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
А. Ю. Попова
15 июня 2017 г.
4.L МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение массовой концентрации витамина Ki в сыворотке крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)Методические указания МУК 4Л3482—17
Свидетельство о метрологической аттестации № РОСС RU.0001. 310430/0200Л 0.07.14 от 10.07.2014.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации витамина Kt в сыворотке крови в диапазоне 2,5—44,0 нг/см3.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Витамин Ki - витамин коагуляции, антигеморрагический витамин, 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон.
Структурная формула:
I 3 Г I 3 I 3
СН2-СН=С-(СН2)3-СН-(СН2)з-СН-(СН2)з-СН-СН3
Эмпирическая формула: C3iH4602. Молекулярная масса: 450,7. Регистрационный номер С AS: 84-80-0.
МУК 4 Л .3482—17
Физико-химические свойства: Светло-желтое маслянистое вещество, липофильно (жирорастворимо), гидрофобно, растворимо в хлороформе, диэтиловом эфире, этиловом спирте и других органических растворителях. ТШ1 ~ -20 °С, 7^=115—145 °С (в вакууме). Растворы поглощают УФ-лучи.
Метаболическая роль витамина К Витамин К необходим, прежде всего, для механизмов свертывания и регуляции крови. Также витамин К играет важную роль в формировании и восстановлении костей, обеспечивает синтез белка костной ткани (остеокальцина), на котором кристаллизуется кальций. Он способствует предупреждению остеопороза, участвует в регуляции окислительно-восстановительных процессов в организме. Дефицит витамина К в организме приводит к развитию геморрагического синдрома, который проявляется внутрикожными и подкожными кровоизлияниями, кровоточивостью десен, носовыми и желудочно-кишечными кровотечениями.
Витамин К представлен в природе двумя формами: растительным фшшохиноном (Кх) и менахиноном (К2), синтезируемым бактериями и образующимся из формы Кх. Биомаркерами витамина К являются концентрация филлохинона (витамина Кх) в плазме крови и процент некар-боксилированного остеокальцина в плазме крови.
Физиологическая функция витамина К заключается в образовании дополнительных карбоксильных групп в протромбине, проконвертине и других белковых факторов, которые вместе с ионами кальция инициируют процесс образования тромбина. Ферментативное действие тромбина на первом этапе способствует превращению растворимого в плазме белка фибриногена в мономерную форму белка фибрина, на следующем этапе образованию регулярной структуры растворимого фибрин-полимера. Образованный рыхлый сгусток под воздействием фибринстабили-зирующего фактора свертывания крови, тромбина и ионов кальция превращается в нерастворимый фибрин, стабилизирующий структуру сгустка, необходимого для прекращения кровотечения.
Нормальный уровень содержания витамина К* в сыворотке крови составляет 5,0—30,0 нг/см3.
Содержание в продуктах питания. Витамин Kj содержится в большом перечне пищевых источников растительной природы, включая зеленые овощи (брокколи, шпинат, капуста белокочанная, фасоль и др.), в которых он находиться в комплексе с хлорофиллом, и некоторые растительные масла (соевое, хлопковое, оливковое, рапсовое). Гидрогенизация масел приводит к снижению биодоступности и биоэффективности витамина. В молоке, яйцах, рыбе, мясе и зерновых продуктах его содер-
жание не превышает 7 мкг в 100 г съедобной части. Кулинарные потери при тепловой обработке продуктов незначительны.
Нормы потребления. Установленный уровень потребления витамина К в разных странах варьируется от 55 до 120 мкг/сутки, а физиологическая потребность для взрослых - 120 мкг/сутки, для детей - от 30 до 75 мкг/сутки.
1. Погрешность измерений
LL Нормы погрешности измерений Нормы погрешности измерений массовой концентрации витамина К3 в сыворотке крови в нормативной документации не регламентированы.
7.2. Приписанные характеристики погрешности измерений и ее составляющих При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующего диапазона массовых концентраций витамина Кх в сыворотке крови.
Таблица 1
Приписанные характеристики погрешности МВИ и ее составляющих при доверительной вероятности 0,95 |
Диапазон
опреде
ляемых
концен
траций,
нг/см3 |
Показатель точности (границы относительной погрешности, р = 0,95), ± 5, % |
Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), <х, нг/см3 |
Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости). Од, нг/см3 |
Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), г, нг/см3 |
Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в одной лаборатории), R, нг/см5 (р = 0,95) |
Сред
няя
степень
извле
чения,
% |
От 2,5 до 44,0 вкл. |
19 |
0,018 'X |
0,036 -X |
0,051 •X |
0,101 'X |
81,69 |
|
Значения показателя точности используют:
- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;
- при оценке деятельности лабораторий по вопросу качества проведения измерений;
МУК 4.1 .3482—17
— при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.
2. Метод измерений
Выполнение измерений массовой концентрации витамина Ki в сыворотке крови проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием спектрофотометрического детектора и предварительным проведением экстракции витамина из сыворотки гексаном, высушивания гексанового экстракта, растворения высушенного остатка в элюенте. Идентификация витамина осуществляется по времени удерживания. Количественное определение витамина К* проводится методом абсолютной градуировки.
Измерению не мешают другие компоненты матрицы сыворотки, в частности, витамины А и Е.
3* Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
3.1. Средства измерений Хроматограф жидкостный: ОСКО выходных сигналов не более 3 %; относительное отклонение выходного сигнала от первоначального значения через 8 часов работы не более 6 %; время выхода на режим не более 1 часа Спектрофотометрический детектор: диапазон длин волн 190—600 нм; точность установки ± 1 нм; воспроизводимость ± 0,5 нм; источник света - дейтеривая лампа Насос для ВЭЖХ изократический; диапазон производительности 0,01—10 см3/мин, максимальное рабочее давление 40 МПа, точность поддерживаемой скорости подачи растворителя 1 см3/мин ± 1 %
Аналитический инжекторный клапан: максимальное операционное давление - 35 МПа; управление - ручное; инжекторная петля объемом 100 мм3; материал - нержавеющая сталь; игла 22/51/3
135
Весы лабораторные электронные специального класса точности: дискретностью не более ОД мг; наименьший предел взвешивания — 0,01 г; наибольший предел взвешивания - 200 г Одноканальные дозаторы пипеточные переменного объема 5—50,20—200,
500"........5 000 мм3
Цилиндры 3-50-1,3-100-1,3-250-1 Пробирки со шлифом П-2-5-0Д; П-1-10-0Д Колбы мерные, 2-10-2,2-25-2,2-500-2 Микропробирки полиэтиленовые конические с колпачком типа Эппендорф, объем 1,5 см3
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Вода дистиллированная Метанол, осч, для хроматографии Ацетонитрил, осч, для жидкостной хроматографии
Метилен хлористый, осч Гексан, хч, для хроматографии Спирт этиловый ректификованный Витамин К| (количественное содержание, включая Z и Е изомеры, - 97,69 %)
Подвижная фаза (элюент) для хроматографии - метанол : ацетонитрил : хлористый метилен (45 : 50 : 5 об.%)
Примечание. Допускается использование других реактивов с аналогичной, или более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы Аналитическая хроматографическая колонка из нержавеющей стали С18,
250 х 4,60 mm х 5 рм
Картриджная защитная система С18 4 х 3,0 mm Вакуумный насос ГОСТ Р 52615-06
Колба Бунзена 1-1000-45 ГОСТ 23932-90
Воронка фильтрующая Шотта, пористость —
S4, диаметр - 60 мм, высота - 191 мм
136