Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке, в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3415—17

Издание официальное

Москва • 2017

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке, в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.3415—17

Насос диафрагменный, химически стойкий на 100 % с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм³/мин

Предколонка хроматографическая стальная длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8 Миксер ручной погружной мощностью 260 Вт и с максимальной скоростью вращения от 2 000 до 12 500 об ./мин Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100—500 см³    ГОСТ    25336—82

Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4 000 см³ и приемной конической колбой объемом 1 000 см³ Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г    ТУ-6-09-1678—86

Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см³    ГОСТ    22967—90

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1,    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.007—76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТу 12.1.004—91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009—83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313—03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТу 12.0.004—91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

-    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

-    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов № 1, 2 и 3 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1,2 и 3, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка органических растворителей 7. /. /. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм . Выдерживают его над осушителем в течение 5—6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 ООО см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5—6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм\ Ацетон перегоняют при

температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 ООО см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.1.4. Очистка гексана Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5—6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Гексан перегоняют при температуре 68,7 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление 2%-го водного раствора уксуснокислого аммония В мерную колбу объемом 1 000 см³ переносят 20 г аммония уксуснокислого, добавляют 500 см³ бидистиллированной воды и перемешивают до полного растворения соли. Доводят водой объем в колбе до метки и еще раз тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 350 см³ ацетонитрила, 350 см³ метанола и 200 см³ 2%-го водного раствора уксуснокислого аммония. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.3. Приготовление смеси для растворения проб и приготовления стандартных растворов

В колбу объемом 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила, прибавляют 50 см⁵ метанола и тщательно перемешивают. Смесь используют для растворения проб и приготовления стандартных растворов.

7.2.4. Приготовление градуировочных растворов

Спинозин А и спинозин Д разлагаются под воздействием света. При работе как со стандартными растворами, так и с аналитическими пробами следует соблюдать меры предосторожности: защищать от света (например, обертывать черной бумагой) колбы с экстрактами, концентрирующие патроны № 1, 2 и 3, концентраторы с сухим остатком экстракта. Процедуры очистки экстрактов в делительных воронках и упаривания экстрактов на ротационном вакуумном испарителе необходимо проводить в затемненной комнате (без включения электрического света).

7.2.4.1.    Стандартный раствор № 1 с концентрацией спинозина А 100,0мкг/см³. Взвешивают 10 мг спинозина А в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления смесе-вых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 1 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.4.2.    Стандартный раствор №2 с концентрацией спинозина Д 100,0 мкг/см³. Взвешивают 10 мг спинозина Д в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления смесе-вых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 2 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.

7.2.4.3.    Стандартный раствор № 3 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 10,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 10 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 10 см³ и помещают в ту же колбу объемом 100 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависи-

мости. Стандартный раствор № 3 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.4.    Стандартный раствор № 4 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 5,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 4 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор №4 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.5.    Стандартный раствор № 5 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 2,5 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 5 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 5 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.6.    Стандартный раствор № 6 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 1,0 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 6 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 6 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.7.    Стандартный раствор № 7 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,5 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 7 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 7 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.8.    Стандартный раствор № 8 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,25 мкг/см³ каждого. Из стандартного раствора № 5 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 8 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 8 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.4.9. Стандартные растворы спинозина А и спинозина Д с концентрациями 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0мкг/см³ для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см³и используют эти растворы для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации спинозина А и спинозина Д в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7,4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов Ли Д на них

7.4.1. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см⁵ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон последовательно промывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см⁵ гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов АиД на концентрирующих патронах № 1

Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при

температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 9 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9 : 1, а затем двумя порциями по 5 см³ каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 9 : 1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³ и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.5. Подготовка концентрирующих патронов Ns 2 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов А и Дна них

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов N.я 2 для очистки экстракта Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Элюат отбрасывают.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах Ns 2 Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1 : 2, а затем двумя порциями по 10 см³ ацетона и двумя порциями по 10 см³ смеси ацетонитрила с метанолом в соотношении 1 : 1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.6. Подготовка концентрирующих патронов Лз 3 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов Ли Дна них

7.6.1. Подготовка концентрирующих патронов N2 3 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

Патрон № 3 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон промывают последовательно 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1 : 1 и 10 см³ гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения спинозинов А иД на концентрирующих патронах Л^г9 3

Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.

Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в концентратор объемом 100 см³ с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 8 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала двумя порциями по 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4 : 1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см³ и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.

Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 3 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3—4 часа.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств

пестицидов», № 2051—79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ», ГОСТ Р 55906-13 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети», ГОСТ Р 32876-14 «Консервы. Соки овощные. Сок томатный, ТУ».

Пробы лука и плодов томатов хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0—4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранятся в морозильной камере при температуре -18 °С.

Пробы томатного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 5 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Плоды томатов

9.1.1. Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец измельченных плодов томатов массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см³, прибавляют 100 см³ ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах А£ 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, прибавляют в концентратор 9 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см³. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 9 : 1 и также

ББК 51.23 0-62

0-62 Определение остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке, в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Методические указания.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2017.-27 с.

ISBN 978—5—7508—1571—5

1.    Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К. А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А. В. Довгилевич, Е. В. Довгилевич, Н. В. Устименко, Е. Н. Тестова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере за и или нрав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.

4.    Введены впервые.

ББК 51.23

ISBN 978—5—7508—1571—5

© Роспотребнадзор, 2017

вносят на патрон, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см³ и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.2. Томатный сок

9.2.1.    Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец томатного сока массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см³, прибавляют 100 см³ ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см³ с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см³ ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см³ (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см³ ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 4 см³ смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

9.3. Лук-репка

9.3.1.    Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Образец измельченного лука-репки массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, защищенную от света, прибавляют 50 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8 : 2 и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотно-

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

14 февраля 2017 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке, в луке-перо и луке-репке методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания _МУК 4.1.341*5—17_

Свидетельство о метрологической аттестации МВИ от 31.03.2016 № РОСС RU.0001.310430/0257.31.03.2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов и томатном соке, в луке-перо и луке-репке в диапазоне 0,05— 0,5 мг/кг (каждого) и 0,1—1,0 мг/кг (по сумме спинозинов А и Д).

Методические указания носят рекомендательный характер.

Спиносад

Спиносад - смесь (2/?,За/?,5а/?,5Ь5,95,135,14/?,16а5',16ЬЛ)-2-(6-дез-окси-2,3,4-три-0-метил-а-Ь-манно-пиранозилокси)-13-(4-диметилами-но-2,3,4,6-тетрадезокси-р-Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,За,5а,5Ь, 6,7,9,10,11,12,13,14,15,16а, 1 бЬ-гсксадекогидро- 14-метил-1 Я-8-оксацик-лододека-[6]а$-индацен-7,15-диона и (2S,3aR,5aS,5hS,9S, 13S', 14R, 16aS, 16bS) -2-(6-дезокси-2,3,4-три-0-метила-Е-маннопиранозилокси)-13-(4-диметил-амино-2,3,4,6-тетрадезокси-р-Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,За,5а, 5b,6,7,9,10,11,12,13,14,15,16a, 16Ь-гексадекогидро-4,14-диметил-1 Я-8-ок-сациклододска[Ь]а$-индацен-7,15-диона в соотношении от 5:95% до 50 : 50 %.

Структурная формула:

Спинозин A. R = Н-Спинозин D, R = СН₃ .

Молекулярная масса: спинозин А - 732,0; спинозин Д - 746,0. Эмпирическая формула: спинозин А - C41H65NO10; спинозин Д -C42H67NO10.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: светло-серый или белый.

Давление паров (при 25 °С): 3,0 * 10'⁵ МПа - для спинозина А; 2,0 х Ю“⁵ МПа - для спинозина Д.

Коэффициент распределения в системе октанол-вода:

-    спинозин А-К^ log Р 2,8 (pH 5), 4,0 (pH 7), 5,2 (pH 9);

-    спинозин Д-Kow log Р 3,2 (pH 5), 4,5 (pH 7), 5,2 (pH 9). Температура плавления: спинозин А - 84,0—99,5 °С; спинозин Д -

161,5—170,0 °С.

Растворимость в воде:

-спинозин А - 89 мг/дм³ (дистиллированная вода), 235 мг/дм³ (20 °С и при pH 7);

-    спинозин Д - 0,5 мг/дм³ (дистиллированная вода), 0,33 мг/дм³ (20 °С и при pH 7).

Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): -спинозин А: ацетон - 16,8; ацетонитрил - 13,4; хлористый метилен - 52,5; метанол - 19,0; гексан - 0,448; толуол - 45,7; н-октанол -0,926;

-спинозин Д: ацетон - 1,01; ацетонитрил - 0,255; хлористый метилен - 44,8; метанол - 0,252; гексан - 0,743; толуол - 15,2; н-октанол -0,127.

Оба вещества устойчивы к гидролизу при pH 5 и pH 7; ДТ₅₀ при pH 9 составляет 200 дней для спинозина А и 259 дней для спинозина Д. Фотодеградация в воде: ДТ₅₀ при pH 7 составляет 0,93 дня для спинозина А и 0,82 дня для спинозина Д.

Краткая токсикологическая характеристика. Спиносад относится к веществам малоопасным по острой оральной (ЛД50 для самок крыс 3 783 мг/кг, для самцов крыс - более 5 ООО мг/кг) и дермальной (ЛД50 для кроликов более 2 ООО мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) более 5 180 мг/м³). Он не вызывает раздражения кожи, отмечается лишь слабое покраснение глаз у кроликов. Не обладает мутагенным и нейротоксич-ным свойствами или репродуктивной токсичностью.

Область применения. Спиносад - инсектицид контактного и кишечного действия из группы спинозинов, обладающий парализующим эффектом.

Он эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, бахромчатокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки) в посевах зерновых, плодовых, овощных и декоративных культур при норме расхода 5—40 г д.в./га. Препараты на основе спиносада используются также для борьбы с синантропными насекомыми и в ветеринарии.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ВДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,1 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,11 мг/дм³;

ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/м³;

ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,002 мг/м³;

МДУ в продукции (мг/кг): огурцы - 1,0; перец - 2,0; картофель - 0,5;

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): лук - 0,2;

ВМДУ в импортируемой продукции (мг/кг): томаты - 0,3; лук - 0,2.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1 Метрологические параметры для спинозина А и спинозина Д

Анализи руемый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±&,%Р = 0,95 Стандартное отклонение повторяемости, а,% % Предел повторяемости, г, % Предел воспроиз водимости, R,% Спинозин / Плоды томатов 0,05—0,1 вкл. 50 2 7 9 0,25—0,5 вкл. 25 2 7 9 Томатный сок 0,05—0,1 вкл. 50 5 15 21 0,25—0,5 вкл. 25 3 7 10 Лук-перо 0,05—0,1 вкл. 50 5 13 18 0,25—0,5 вкл. 25 6 16 23 Лук-репка 0,05—0,1 вкл. 50 4 12 17 0,25—0,5 вкл. 25 3 7 10 Спинозин Д Плоды томатов 0,05—0,1 вкл. 50 3 8 11 0,25—0,5 вкл. 25 3 9 12 Томатный сок 0,05—0,1 вкл. 50 5 14 20 0,25—0,5 вкл. 25 2 6 9 Лук-перо 0,05—0,1 вкл. 50 4 12 17 0,25—0,5 вкл. 25 4 11 15 Лук-репка 0,05—0,1 вкл. 50 4 10 14 0,25—0,5 вкл. 25 3 9 13

Таблица 2 Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для спинозина А и спинозина Д

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р - 0,95, п = 20 предел обнару жения, мг/кг диапазон определяемых концентраций, мг/кг полнота извлечения вещества, % стандартное отклонение, S,% доверительный интервал среднего результата, ±, % Спинозин А Плоды томатов 0,05 0,05—0,5 74,48 3,13 0,70 Томатный сок 0,05 0,05—0,5 79,58 4,87 1,09 Лук-перо 0,05 0,05—0,5 78,98 3,12 0,70 Лук-репка 0,05 0,05—0,5 81,12 5,09 1,14 Спинозин Д Плоды томатов 0,05 0,05—0,5 77,43 2,51 0,56 Томатный сок 0,05 0,05—0,5 82,41 3,97 0,89 Лук-перо 0,05 0,05—0,5 77,02 4,21 0,94 Лук-репка 0,05 0,05—0,5 80,26 3,75 0,84

2. Метод измерений

Метод основан на определении спинозинов А и Д с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах № 1,2 и 3.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Весы аналитические класса точности - специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г Весы лабораторные общего назначения класса точности - средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности ± 0,5 г Колбы мерные на 10,25,50,100,500 и 1 000 см³ Микрошприц объемом 100 мм³ со шкалой деления 0,001 см³ и погрешностью менее 1 % от номинального объема Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см³ Хроматографическая система, включающая:

-    хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;

-    компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку

Натрий сернокислый, безводный, хч    ГОСТ 4166-76

Натрий хлористый, хч    ГОСТ 4233-77

Спирт метиловый (метанол), хч    ГОСТ 6995-77

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Аппарат для встряхивания проб с возвратнопоступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту

Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см³ Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм³

Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная Воронки делительные на 250 см³ Воронки лабораторные, стеклянные Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3 000 см³, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм³ и с диапазоном температур от 20 до 100 °С

Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1 000 см³    ГОСТ 25336-82

Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100,250 см³ и 4 000 сь^ТС    ТУ 92-891.029—91

Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18