Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
|
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение концентраций действующих
веществ пестицидов в воде, почве, зелёной
массе, зерне и соломе зерновых культур,
ботве и корнеплодах свеклы
Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК
4.1.3021-12; 4.1.3043-12
Москва 2013
1. Разработаны сотрудниками
ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» Россельхозакадемии.
2. Введены в действие с
момента утверждения.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Погрешность измерений. 2
2. Метод измерений. 3
3. Средства измерений, реактивы,
вспомогательные устройства и материалы.. 3
4. Требования безопасности. 4
5. Требования к квалификации
операторов. 4
6. Условия измерений. 5
7. Подготовка к определению.. 5
8. Отбор проб и хранение. 6
9. Проведение определения. 6
10. Обработка результатов анализа. 7
11. Проверка приемлемости
результатов параллельных определений. 7
12. Оформление результатов. 8
13. Контроль качества результатов
измерений. 8
14. Разработчики. 9
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
8 октября 2012 г.
Дата введения: с момента утверждения
|
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение массовой концентрации
пропизахлора
в ботве и корнеплодах свеклы методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические
указания
Свидетельство о
метрологической аттестации № 01.5.04.084/01.00043/2012.
Настоящие методические
указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для
определения массовой концентрации пропизохлора в ботве свеклы в диапазоне
концентраций 0,1 - 1,0 мг/дм3 в корнеплодах свеклы в диапазоне
концентраций 0,025 - 0,25 мг/дм3.
Название действующего
вещества по номенклатуре ICO:
пропизахлор.
Название действующего
вещества по номенклатуре IUPAC: 2-хлор-6¢-этил-N-изопропоксиметилацето-о-толуидин.
Структурная формула:
Брутто формула: C15H22ClNO2.
Молекулярная масса: 283,8.
Химически чистое вещество
представляет собой маслянистую жидкость от светло-коричневого до пурпурного
цвета с характерным запахом.
Температура плавления: 21,6
°С.
Давление пара при 20 °С: 4
мПа.
KowlogP = 3,50 (20 °C).
Растворимость в воде - 184
мг/дм3. Растворим в большинстве органических растворителей.
Гидролитически стабилен. Через 5 дней хранения при 50 °С (рН 4, 7, 9) степень
разложения составляет менее 10 %.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая оральная токсичность LD50 для крыс 3433 мг/кг (мужские особи) и 2088 мг/кг (женские
особи).
Дермальная токсичность LD50 превышает 2000 мг/кг.
Ингаляционная токсичность LC50 - 5000 мг/м3 для животных обоих полов (крысы).
Область применения препарата
Селективный гербицид для
регулирования роста однолетних трав и некоторых широколистных сорняков на
посевах кукурузы, подсолнечника, сои, картофеля и гороха.
Механизм действия заключается
в ингибировании деления клеток посредством блокирования белкового синтеза при
адсорбции гербицида на корнях прорастающих растений.
В России для пропизахлора в
свекле гигиенические нормативы не установлены.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех
регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной
методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при
доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в
табл. 1, для соответствующих
диапазонов концентраций.
Таблица 1
Метрологические
параметры
Объект анализа
|
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм3)
|
Показатель повторяемости (относительное
среднеквадратическое отклонение повторяемости), sr %
|
Показатель внутрилабораторной прецизионности, sR, %
|
Показатель воспроизводимости, sR, %
|
Показатель точности* (границы относительной
погрешности), ±d, %
|
Ботва
|
0,1 - 1,0
|
6
|
8
|
9
|
18
|
Корнеплоды
|
0,025 - 0,25
|
9
|
11
|
12
|
24
|
* Соответствует
расширенной неопределенности Uотн. при коэффициенте охвата k = 2.
|
Таблица 2
Полнота
извлечения пропизахлора, стандартное отклонение, доверительный интервал
среднего результата для n = 20, Р = 0,95
Анализируемый объект, мг/кг
|
Предел обнаружения
|
Диапазон определяемых концентраций
|
Среднее значение определения, %
|
Стандартное отклонение, S, %
|
Доверительный интервал среднего результата, ± %
|
Ботва
|
0,1
|
0,1 - 1,0
|
81,5
|
4,5
|
4,1
|
Корнеплоды
|
0,025
|
0,025 - 0,25
|
80,25
|
4,8
|
4,4
|
2. Метод измерений
Методика основана на
определении пропизохлора методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его
извлечения из образцов с помощью «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат.
№ IL-5056)».
Идентификация пропизохлора
проводится по времени удерживания, количественное определение - методом
абсолютной калибровки.
Избирательность метода
обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений,
реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженном
дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
|
Номер в Госреестре средств
измерений 42816-09
|
Весы аналитические ВЛА-200
|
ГОСТ 24104-2001
|
Весы технические ВЖТ-500
|
ГОСТ 24104-2001
|
Колбы мерные на 10, 100 см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Микродозаторы одноканальные
«BIOHIT» переменного объема от 200 до 1000 мм3
и от 1 до 5 см3, Финляндия
|
Номер в Госреестре средств
измерений 36152-07
|
Цилиндры мерные на 50 и 100
см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Примечание. Допускается использование средств измерения иных
производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Ацетонитрил для ВЭЖХ,
«В-230НМ» или хч
|
ТУ 6-09-3534-87
|
Вода для лабораторного
анализа (бидистиллированная, деионизованная)
|
ГОСТ Р 52501-2005
|
Кислота ортофосфорная, хч
|
ГОСТ 6552-80
|
Кислота уксусная, ледяная
|
ГОСТ 61-69
|
Магний серно-кислый
безводный, хч
|
ГОСТ 4523-67
|
Магний серно-кислый
семиводный, хч
|
ГОСТ 4523-77
|
«Набор для пробоподготовки
по методу QuEChERS
Interlab VetexQ для обычных
овощей, фруктов и зерна (4 г MgSO4 + 1 г NaCl и 150 мг PSA (смесь
первичных и вторичных аминов) + 900 мг MgSO4)»,
кат. № IL-5056
|
|
Натрий уксусно-кислый, ч
|
ГОСТ 199-68
|
Силикагель, Merck 1.09385.1000
|
|
Подвижная фаза для ВЭЖХ:
смесь ацетонитрила и 0,005 М Н3РO4
в соотношении 55:45
|
|
Пропизахлор, аналитический
стандарт с содержанием д.в. 98,4 % (HPLC) Riedel-de Haёn
|
|
Уголь активированный БАУ-А
|
ГОСТ 6217-4-74
|
Примечание. Допускается
использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не
требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100´2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
|
|
Аппарат для встряхивания
фирмы Heidolph, мод. Multi Reax (Германия)
|
|
Колбы круглодонные на шлифе
вместимостью 25 см3
|
ГОСТ
9737-93
|
Пробирки полипропиленовые
центрифужные с крышками объемом 15 см3 и 50 см3
|
|
Ротационный вакуумный
испаритель фирмы BÜCHI, мод. R205
(Швейцария)
|
|
Центрифуга фирмы Eppendorf AG, мод. 5804 (Германия)
|
|
Примечание. Допускается
применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими
техническими характеристиками.
4.
Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений
необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими
реактивами по ГОСТ
12.1.007-76, требования
по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ
12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на
жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории
должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать
требованиям пожарной безопасности по ГОСТ
12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ
12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК
(ОБУВ), установленных ГН
2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.
Организация обучения
работников безопасности труда - по ГОСТ
12.0.004-90.
5. Требования к
квалификации операторов
Измерения в соответствии с
настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с
руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и
подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам
контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений
выполняют следующие условия:
· процессы приготовления растворов и
подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и
относительной влажности не более 80 %;
· выполнение измерений на жидкостном
хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к
прибору.
7. Подготовка к
определению
7.1. Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку
(Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке
подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.2. Приготовление растворов
7.2.1. 0,005 М
раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в
мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и
доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления
подвижной фазы смешивают
ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 по
объёму, используя мерные цилиндры.
7.3. Приготовление основного и градуировочных
растворов
7.3.1. Основной раствор
с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску пропизохлора (50 ± 0,5) мг
помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в
ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с
концентрациями пропизохлора 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0 и 2,0 мкг/см3
готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор
подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в
соотношении 55: 45).
7.3.2. Раствор №
1 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3
вносят 4 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор №
2 с концентрацией 1,0 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью
10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до
метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор №
3 с концентрацией 0,8 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3
помещают 4 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной
фазой.
7.3.5. Раствор №
4 с концентрацией 0,4 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3
помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной
фазой.
7.3.6. Раствор №
5 с концентрацией 0,2 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью
10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до
метки подвижной фазой.
7.3.7. Раствор № 6 с
концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3
помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной
фазой.
Основной раствор можно
хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца,
градуировочные растворы - в течение суток.
При изучении полноты
определения пропизохлора в ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют
ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом
последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
7.4. Построение градуировочного графика
Для построения
градуировочного графика (площадь пика - концентрация пропизохлора в растворе) в
хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3
параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону
измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график
зависимости среднего значения
площади пика от концентрации пропиконазола в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов
рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной
регрессии:
С = KS, где
S - площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают
удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается
не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику
необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или
элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате
контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость
признают стабильной при выполнении следующего условия:
где
С - аттестованное значение массовой
концентрации пропизахлора в градуировочном растворе;
Ск - результат контрольного измерения массовой концентрации
пропизахлора в градуировочном растворе;
lконтр. - норматив
контроля градуировочного коэффициента, % (lконтр. = 10 % при Р
= 0,95).
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб свеклы
производится в соответствии с «Унифицированными
правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и
объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от
21.08.79 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ
1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для
длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в
морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой полиэтиленовой
таре.
9. Проведение определения
9.1. Определение пропизохлора
в ботве и корнеплодах
свеклы
В полипропиленовую
центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают (10 ± 0,1) г
измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), добавляют 10 см3 ацетонитрила
и содержимое влагонепроницаемого
пакета из «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (4 г MgSО4 + 1 г NaCl)». Пробирку плотно закрывают, встряхивают
на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в
течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего ацетонитрильного слоя и
переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку из набора вместимостью 15 см3,
содержащую сорбент (150 мг PSA* + 900 мг MgSO4).
Добавляют 50 мг активированного угля, пробирку плотно закрывают, встряхивают на
аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение
10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную колбу и упаривают
досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе
(корнеплоды в 0,5 см3, ботву в 1,0 см3) и 10 мм3
вводят в хроматограф.
______________
* Смесь первичных и вторичных аминов.
Альтернативный вариант пробоподготовки
В полипропиленовую
центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают (10 ± 0,1) г
измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), прибавляют 10 см3
ацетонитрила, 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, 8 г семиводного
магния сернокислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают
крышкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости
4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего
ацетонитрильного слоя и переносят его в полипропиленовую центрифужную пробирку
вместимостью 15 см3, содержащую 250 мг силикагеля, 750 мг безводного
магния сернокислого и 50 мг активированного угля. Пробирку плотно закрывают
крышкой, встряхивают на аппарате 10 мин и центрифугируют при скорости 4000
об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную
колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток
растворяют в подвижной фазе (корнеплоды в 0,5 см3, ботву в 1,0 см3)
и 10 мм вводят в хроматограф.
9.2. Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостный
хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором,
автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1´100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь
ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 (по объему).
Скорость потока элюента 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны
УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания
пропизахлора (6,8 ± 0,1) мин.
10. Обработка результатов
анализа
Количественное определение
проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропизохлора в ботве и
корнеплодах сахарной свеклы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
где
Sx - площадь пика пропизохлора на хроматограмме испытуемого образца, мм2
(AU);
К - градуировочный коэффициент, найденный
на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г;
k = 5 - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, взятый
для анализа;
f - полнота извлечения пропизохлора,
приведенная в табл. 2, %.
Содержание остаточных
количеств пропизохлора в образце вычисляют как среднее из двух параллельных
определений.
Образцы, дающие пики большие,
чем стандартный раствор пропизохлора с концентрацией 2,0 мкг/см3,
разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11.
Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа
принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений,
расхождение между которыми не превышает предел повторяемости;
где (1)
X1, X2 - результаты
параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела повторяемости (r = 2,8sr).
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела
повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление
результатов
Результат анализа
представляют в виде:
мг/кг при вероятности Р
= 0,95, где
- среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг;
D - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
где
d - граница относительной погрешности методики (показатель точности
в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание
компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат
анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе «менее
нижней границы определения» (например: менее 0,025 мг/кг*, где «*»
- 0,025 мг/кг - предел обнаружения пропизохлора в корнеплодах свеклы).
13.
Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль
погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ
Р ИСО 5725-1 - 6-2002
«Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность
результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один
из градуировочных растворов.
13.2. Плановый
внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится
с применением метода добавок.
Величина добавки Сд
должна удовлетворять условию:
где
, () - характеристика погрешности (абсолютная погрешность)
результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце
(расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой
соответственно), мг/кг; при этом:
Dл = ±0,84D, где
D - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
где
d - граница относительной погрешности методики (показатель точности в
соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк
рассчитывают по формуле:
Кк = Х¢ - Х - Сд, где:
X¢, X, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений
(признанных приемлемыми по п. 11)
содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация
добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают
по формуле:
(1)
Проводят сопоставление
результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля
процедуры удовлетворяет условию
(2)
процедуру анализа признают
удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При
повторном невыполнении условия (2)
выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают
меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости
результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между
результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно
превышать предела воспроизводимости (R):
где (3)
X1, Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
14. Разработчики
Долженко В.И., Цибульская
И.А., Черменская Т.Д., Комарова А.С. (ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений
Россельхозакадемии).