Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование
Российской Федерации
4.1.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
пестицидов в пищевых продуктах,
сельскохозяйственном сырье и объектах
окружающей среды
Сборник
МУК 4.1.2859 - 4.1.2866-11
Москва
2011
1. Разработаны Российским государственным аграрным
университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр
«Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин,
профессор, канд. с-х. наук., Е.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. биол. наук,
А.В. Довгилевич, ст.н.сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко, ст.н.сотр., канд.
биол. наук, Е.Н. Щербинкина, инженер).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28 12.2010
№ 3).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
5. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
Общие положения и область применения. 2
1. Метрологическая характеристика метода. 3
2. Метод измерения. 3
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы.. 3
4. Требования безопасности. 4
5. Требования к квалификации операторов. 5
6. Условия измерений. 5
7. Подготовка к определению.. 5
8. Отбор проб и хранение. 6
9. Проведение определения. 6
10. Обработка результатов анализа. 7
11. Проверка приемлемости результатов параллельных
определений. 7
12. Оформление результатов. 7
13. Контроль качества результатов измерений. 8
14. Разработчики. 9
|
|
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель
Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
31
марта 2011 г.
Дата введения: с момента утверждения
|
4.1. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств Фенпропидина
в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания
Общие положения и область применения
Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 №
01.5.04.686.
Настоящий документ устанавливает метод высокоэффективной
жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фенпропидина в
зеленой массе и зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1
мг/кг и в соломе в диапазоне 0,04 - 0,4 мг/кг.
Действующее вещество: Фенпропидин.
Структурная формула:
Название действующего вещества по ИЮПАК:
(RS)-l-[3-(4-тpeтбутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин.
Молекулярная масса: 273,5.
Эмпирическая формула: C19H31N.
Химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую
слегка вязкую жидкость без запаха.
Температура кипения > 250 °С, 70,2 °С/1,1 Ра.
Давление пара 17 мРа (25 °С).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: Kоw
lgP = 2,9 (рН 7, 25 °С).
Растворимость в воде (мг/дм3, 25 °С): 530 (рН 7);
6,2 (рН 9).
Легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом,
н-октанолом и гексаном (25 °С). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при
комнатной температуре, по крайней мере, в течение 3 месяцев. Водные растворы
устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при 80 °С (рН 4,7 и 10). рКа
10,1 (сильное основание).
Краткая токсикологическая характеристика: у крыс
острая оральная токсичность LD50 > 1447 мг/кг; при подкожном
введении LD50 > 4000 мг/кг. Ингаляционная токсичность LD50
1220 мг в 1 м3 воздуха (Время экспозиции 4 ч). У кроликов вызывает
раздражение кожи и глаз.
Не обладает мутагенным, канцерогенным и тератогенным
действием.
Область применения: Фенпропидин - лиственный фунгицид
системного действия с целебным защитным и искореняющим эффектом. Подавляет
развитие таких заболеваний зерновых культур, как ложномучнистая роса, ржавчина
и пятна на листьях, вызываемые, соответственно, фибами из родов Erysiphe
graminis, Puccinia SPP и Rhynchosporium secalis.
Гигиенические нормативы в России для фенпропидина: МДУ в
зерне хлебных злаков 0,25 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения
анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее
составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р =
0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Таблица 1
Метрологические
параметры
Объект анализа
|
Диапазон определяемых концентраций,
мг/кг
|
Показатель повторяемости (относительное
среднеквадратическое отклонение повторяемости), σr, %
|
Показатель внутрилабораторной
прецизионности, σRл, %
|
Показатель воспроизводимости, σR, %
|
Показатель точности* (границы
относительной погрешности), ±δ, %
|
Зеленая масса
|
0,01 - 0,10
|
6
|
7
|
8
|
16
|
Зерно
|
0,01 - 0,10
|
6
|
7
|
8
|
16
|
Солома
|
0,04 - 0,10
|
5
|
6
|
8
|
16
|
0,10 - 0,40
|
3
|
4
|
5
|
10
|
*
Соответствует расширенной неопределенности Uотн
(в относительных единицах) при коэффициенте охвата k = 2.
|
Таблица 2
Полнота
извлечения Фенпропидина, стандартное отклонение, доверительный интервал
среднего результата для n = 20, Р
= 0.95
Анализируемый объект
|
Предел обнаружения, мг/кг
|
Диапазон определяемых концентраций,
мг/кг
|
Среднее значение определения, %
|
Стандартное отклонение, S
|
Доверительный интервал среднего
результата, ± %
|
Зеленая масса
|
0,01
|
0,01 - 0,1
|
87,3
|
5,15
|
2,4
|
Зерно
|
0,01
|
0,01 - 0,1
|
90,4
|
5,8
|
2,7
|
Солома
|
0,04
|
0,04 - 0,4
|
88,15
|
8,3
|
3,9
|
2. Метод измерения
Методика основана на определении Фенпропидина методом ВЭЖХ с
использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью
органического растворителя с водой и очистки экстракта путем перераспределения
кислотно-основных форм Фенпропидина между двумя несмешивающимися фазами и
методом твердофазной экстракции.
Идентификация Фенпропидина проводится по времени
удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий
подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы
3.1.
Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY»
фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором,
автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
|
|
Весы аналитические ВЛА-200
|
ГОСТ
24104-2001
|
Весы технические BЛКT-500
|
ГОСТ
24104-2001
|
рН-метр фирмы «Наnnа
Instrument», мод. Р212
|
|
Колбы мерные на 10, 50, 100, 1000
см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Микродозаторы Ленпипет переменного
объема от 200 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3
|
|
Пипетки градуированные
|
ГОСТ
29227-91
|
Цилиндры мерные на 50 и 100 см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Допускается использование средств измерения с аналогичными
или лучшими характеристиками.
3.2.
Реактивы
Ацетон, чда
|
ГОСТ 2603-79
|
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ»
или хч
|
ТУ 6-09-3534-87
|
Гексан, хч
|
ТУ
2631-003-05807999-98
|
Вода бидистиллированная,
деионизированная, Фенпропидин с содержанием основного вещества 97,7 %,
Мактешим Аган
|
ГОСТ 6709-79
|
Натрий сернокислый, безводный, хч
|
ГОСТ
4166-76
|
Соляная кислота, 0,1М водный
раствор
|
|
Гидроксид натрия, 1М водный
раствор
|
|
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь
ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60
|
|
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже
указанных.
3.3.
Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC
ВЕН С18 (100×2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) Ультразвуковая баня «Сапфир»
|
|
Воронки лабораторные В-75-110
|
ГОСТ
25336-82
|
Бидистиллятор
|
|
Ротационный вакуумный испаритель
фирмы BUCHI, мод. R 205
|
|
Фильтры бумажные «красная лента»
|
ТУ 6.091678-86
|
Патроны, заполненные силикагелем
60 (Merck), 0,5 г
|
|
Допускается использование другого вспомогательного
оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4. Требования безопасности
4.1. При работе необходимо соблюдать требования техники
безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими,
легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ
12.1.005, ГОСТ
12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - ГОСТ
12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного
хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано
приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной
безопасности по ГОСТ
12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ
12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм,
установленных ГН
2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в
воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может
выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации
хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально
соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений
по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
• процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят при температуре воздуха 20 ± 5 °С и относительной влажности не
более 80 %.
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в
условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению
7.1.
Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18)
кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до
стабилизации нулевой линии.
7.2. Приготовление
растворов
7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 ±
0,01 г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3,
растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают
ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по
объему, используя мерные цилиндры.
7.2.3. Приготовление элюента для
твердофазной экстракции. В мерную колбу вместимостью 100 см3
помещают 20 см3 ацетона и доводят объем до метки гексаном.
Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.
7.3. Приготовление
основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3:
точную навеску Фенпропидина (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью
100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же
растворителем.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75
и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления
основного раствора по объему, используя подвижную фазу.
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3
основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,75 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 7,5 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5 Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре
0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
При изучении полноты определения Фенпропидина в зеленой
массе, зерне и соломе пшеницы используют ацетонитрильные растворы вещества.
7.4. Построение
градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика
- концентрация Фенпропидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3
градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой
концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем
измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади
пика от концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный
коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
С
= KS, где
S - площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение
коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при
замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической
системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного
коэффициента.
Градуировочную зависимость
признают стабильной при выполнении следующего условия:
С - аттестованное значение
массовой концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе;
Ск - результат контрольного измерения
массовой концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе;
λконтр - норматив контроля градуировочного
коэффициента, % (λконтр = 10 % при Р = 0,95).
7.5. Подготовка
патронов для твердофазной экстракции
Непосредственно перед употреблением через патрон,
заполненный силикагелем, пропускают 2,5 см3 гексана.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб зерна производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО
950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения
остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной
температуре. Перед анализом зерно и солому измельчают на лабораторных
мельницах.
9. Проведение определения
9.1.
Определение Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы
20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы
помешают в коническую колбу вместимостью 250 см3 и экстрагируют 75
см3 смеси ацетона и воды в соотношении 7:3 в ультразвуковой бане в
течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр
«красная лента». Экстракцию повторяют с тем же объемом экстрагента.
Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при
температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем
водного остатка доводят до 80 см3, подкисляют 1М раствором
хлористоводородной кислоты до рН 3,0 и промывают дважды по 25 см3 гексана.
Гексановый экстракт отбрасывают. К отделенному водному слою прибавляют около 5
см3 1М раствора гидроксида натрия до рН 9,0 и экстрагируют
фенпропидин трижды по 25 см3 гексана. Экстракт фильтруют через слой
безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном
испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют
в 2,0 см3 гсксана и вносят в откондиционированный патрон,
заполненный силикагелем. Патрон промывают 2 см3 гексана. Промывку
отбрасывают. Фенпропидин элюируют 2 см3 элюента, приготовленного по
п. 7.2.3. Элюат упаривают досуха. Сухой
остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы, 10 мм3
полученного раствора вводят в хроматограф.
9.2.
Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы
«Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором,
автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка
ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1×100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки
(30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты
в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая
длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.
Время удерживания Фенпропидина 4,7 ± 0,1 мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале
концентраций 0,1 - 1,0 мкг/см3.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение
проводят методом абсолютной калибровки. Содержание Фенпропидина в зеленой массе,
зерне и соломе пшеницы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
Sx - площадь пика
Фенпропидина на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);
К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии
построения соответствующей градуировочной зависимости;
V - объем пробы, подготовленной для
хроматографического анализа, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г;
f -
полнота извлечения Фенпропидина, приведенная в табл. 2 (%).
Содержание остаточных количеств фенпропидина в образце
вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор
Фенпропидина с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой
для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных
определений
За результат анализа принимают
среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение
между которыми не превышает предела повторяемости (1):
Х1 и Х2
- результаты параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела
повторяемости (r = 2,8σr).
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости,
устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(X
± Δ) мг/ кг при вероятности Р = 0,95, где
Х - среднее арифметическое результатов определений,
признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг.
δ - граница относительной погрешности методики
(показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы
диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее нижней границы
определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел
обнаружения Фенпропидина в зеленой массе и зерне пшеницы).
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости
измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность
(правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед
проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль
процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд должна удовлетворять
условию:
Сд
= ΔЛX' + ΔЛX', где
±ΔЛX'
(±ΔЛX') -
характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа,
соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению
содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
ΔЛ
= ±0,84Δ, где
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
δ - граница относительной погрешности методики
(показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк
рассчитывают по формуле:
Кк
= X' - X - Сд, где
X', X, Сд - среднее арифметическое
результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с
добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К
рассчитывают по формуле:
Проводят сопоставление результата
контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля
процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают
удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном
невыполнении условия (2) выясняют
причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их
устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений,
полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами
измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела
воспроизводимости (R):
X1 и Х2
- результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с
диапазоном концентраций), %.
14. Разработчики
Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина
Н.В., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты
растений, г. Санкт-Петербург).
Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об
аттестации № 01.5.04.2.015.25.11.09 от 26.11.09).