Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств феноксикарба в яблоках, сливах и винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2272—07

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Определение остаточных количеств феноксикарба в яблоках, сливах и винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2272-07

МУК 4.1.2272-07

10 мкг/см³ в ацетонитриле (п. 7.7.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этил ацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п.7.3. Промывают колонку 30 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 50 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему). Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 см³ подвижной фазы, подготовленной по п. 7.5., перемешивают и анализируют на содержание феноксикарба по п. 9.5.

7.5. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 650 см³ ацетонитрила, 350 см³ 0,005 М водного раствора орто-фосфорной кислоты (п.7.2.), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эта подвижная фаза 1 используется при исследовании образцов винограда и сливы.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, 500 см³ 0,01 М водного раствора орто-фосфорной кислоты (п.7.2.), перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эта подвижная фаза 2 используется при исследовании образцов яблок.

7.6. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.5.) при скорости подачи растворителя 1 см³/мин не менее часа до установления стабильной базовой линии.

7.7. Приготовление градуировочных растворов

7.7.1.    Исходный раствор феноксикарба для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,010 г феноксикарба, растворяют в 40-50 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение 3-х месяцев.

7.7.2.    Раствор феноксикарба №1 для градуировки (концентрация 10 мкг/см³).

11

МУК 4.1.2272-07

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора феноксикарба с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.7.1.), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов №№ 2-5.

Для приготовления проб яблок, слив, ягод и сока винограда с внесением при оценке полноты извлечения феноксикарба из исследуемых образцов используют ацетонитрильный раствор феноксикарба с концентрацией 1 мкг/см³.

Градуировочный раствор № 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение месяца.

7.7.3. Рабочие растворы №№ 2-5 феноксикарба для градуировки (концентрация 0,05-0,5 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 0.5, 1.0, 2.5 и 5.0 см³ градуировочного раствора № 1 феноксикарба с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.7.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.5., тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией феноксикарба 0.05, 0.10, 0.25 и 0.5 мкг/см³, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.8. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации феноксикарба в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора (п.7.7.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79 г.) и правилами, определенными ГОСТом 25896-83 «Виноград свежий столовый», ГОСТом 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. ТУ», ГОСТом 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания. ТУ», ГОСТом

МУК 4.1.2272-07

27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки. ТУ», ГОСТом 21920-76 «Слива и алыча крупноплодная. ТУ».

Пробы плодов и ягод хранят в стеклянной посуде в холодильнике при температуре 4°С не более 2-х дней; при длительном хранении пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18°С. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом плоды и ягоды измельчают.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция феноксикарба

9.1.1.    Плоды, ягоды. Навеску (20 г) измельченного растительного материала помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, приливают 100 см³ метанола и гомогенизируют 5 минут при 8000 об/мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ метанола. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентна 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.2.

9.1.2.    Сок. Навеску (20 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 см³, приливают 60 см³ деионизованной воды и перемешивают. Отбирают 1/4 объема раствора (эквивалентна 5 г образца), переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³, приливают 25 см³ насыщенного раствора хлорида натрия и 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 см³ гексана. Объединенную органическую фракцию, пропущенную через слой безводного сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.3. и 9.4.

13

МУК 4.1.2272-07

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Отобранные аликвоты экстрактов плодов и ягод (из пп. 9.1.1.) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (1-2 см³) при температуре 40°С. К водному остатку приливают 15 см³ деионизованной воды, 25 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 см . В воронку вносят 30 см³ гексана, интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз верхний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 см³, а нижнюю водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 25 см³ гексана. Гексановые фракции объединяют, в воронку вносят 40 см³ 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2-х минут. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывают, а гексановую фракцию повторно обрабатывают 30 см³ 0,5%-ного водного раствора двууглекислого натрия при встряхивании. После разделения фаз гексановую фракцию фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 9.3 и 9.4.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухие остатки в круглодонной колбе, полученные по пп. 9.1.2. и 9.2., растворяют в 2,4 см³ гексана, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 0,6 см³ этилацетата, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.3. Колбу обмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., элюат отбрасывают. Феноксикарб элюируют с колонки 45 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), отбрасывая первые 10 см³ элюата и собирая последующие 35 см³ элюата непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30°С.

МУК 4.1.2272-07

9.4. Очистка на концентрирующем патроне Диапак С8

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3растворяют в 1,2 см³ ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 1,8 см³ деионизованной воды, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на концентрирующий патрон Диапак С8, подготовленный по п.7.3., элюат отбрасывают. Колонку промывают 2 см³ смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), элюат отбрасывают. Феноксикарб элюируют с патрона 5 см³ смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40°С. Остаток в колбе растворяют в 1 см³ (для яблок и слив) или 5 см³ (для винограда) соответствующей подвижной фазы, подготовленной по п.7.3., помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание феноксикарба по пп. 9.5.1. или 9.5.2.

9.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирма Кпаиег, Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С 18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная Рабочая длина волны: 230 нм Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу Объем вводимой пробы: 20 мм³ Линейный диапазон детектирования 1 - 10 нг Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

9.5.7. Исследование образцов винограда и сливы Подвижная фаза 1: ацетонитрил-0,005 М Н3РО4 (65:35, по объему) Скорость потока элюента: 0,8 см³/мин Время удерживания феноксикарба: около 6 минут.

9.5.2. Исследование образцов яблок Подвижная фаза 2: ацетонитрил-0,01 М Н₃Р0₄ (50:50, по объему) Скорость потока элюента: 0,9 см³/мин Время удерживания феноксикарба: около 14 минут.

15

10. Обработка результатов анализа

Содержание феноксикарба рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Н, х А х V

X =------------,    где

Н₀ хт

X - содержание феноксикарба в пробе, мг/кг;

Н| - высота пика образца, мм;

Н₀ - высота пика стандарта, мм;

А - концентрация стандартного раствора феноксикарба, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

см³;

m - масса анализируемой части образца, г (для всех объектов - 5 г).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

О)

где Х|, Хг- результаты параллельных определений, мг/кг;

г- значение предела повторяемости (таблица 1), при этом г = 2.8а_г. При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X ± Д) мг/кг при вероятности Р= 0.95,

где X- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Д- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

Д = 5*Х/100,

8 - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1),

%.

16

МУК 4.1.2272-07

Вещество стабильно на свету и не гидролизуется в водных растворах при pH 3-9.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс - более 10000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс - более 4400 мг/м³ воздуха. Феноксикарб не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика. LC50 для рыб-1,6 - 10,3 мг/л (96 час.).

Инсектицид нетоксичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и пчел.

Гигиенические нормативы для феноксикарба в России:

ДСД - 0,05 мг/кг/сутки;

МДУ в яблоках и сливах - 0,01 мг/кг, в винограде - 0,1 мг/кг.

Область применения

Феноксикарб - регулятор роста насекомых ювеноидного типа с контактно-кишечным действием. Применяется против вредителей из отряда чешуекрылых на хлопчатнике, виноградниках, фруктовых деревьях и декоративных культурах.

Применяется в России в качестве инсектицида для борьбы с яблонной и сливовой плодожоркой, гроздевой листоверткой на плодовых семечковых и косточковых культурах и виноградниках путем однотрехкратного опрыскивания в течение вегетационного сезона с нормой расхода 0,1 - 0,15 кг д.в./га.

1. Метрологические характеристики метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Диапазон определяемых концентраций мг/кг Показатель Анализируе мый объект точности (граница относительной погрешнос- Стандартное отклонение повторяемости Or, % Предел повто ряемости, r.Vg Предел воспроизводимости, R,% ти ), ±8, %

МУК 4.1.2272-07

Ягоды винограда от 0,05 до 0.1 вкл. 50 2,8 7,9 12,4 более 0,1 до 0.5 25 2,7 7.6 11,8 Сок винограда от 0,05 до 0.1 вкл. 50 3.5 9,8 15 а более 0,1 до 0.5 25 2,7 7,6 11.8 Яблоки 0,01 100 за 9,0 14,0 более 0,01 до 0.1 вкл. 50 2,8 7,9 12,4 Сливы 0,01 100 2,9 8 а 12,8 Более 0,01 до 0.1 вкл. 50 2,7 7.6 11,8

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (п=20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n=20, Р ** 0,95

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р т 0,95, п ■ 20 Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S, % Доверительный интервал среднего результата, ±% Ягоды винограда 0,05 0,05-0,5 83,4 3,0 ±2,8 Сок винограда 0,05 0,05-0,5 84,5 з а ±3,0 Яблоки 0,01 0,01-0,1 84,7 3.4 ±3,1 Сливы 0,01 0,01-0,1 84,0 за ±3,0

5

2. Метод измерений

Методика основана на определении феноксикарба с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль феноксикарба в образцах яблок, сливы, ягод и сока винограда осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из сока гексаном, из яблок, слив и ягод метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак С8.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.L Средства измерений

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирма Knauer, Германия)

Весы аналитические ВЛА-200

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 Меры массы

Пипетки градуированные 2-го класса точности

вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см³

Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой

вместимостью 5 см³

Цилиндры мерные 2-го класса точности

вместимостью 25, 50, 100, 500 и 1000 см³

6

МУК 4.1.2272-07

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы Феноксикарб, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,5% (Сингента, Швейцария) Ацетонитрил для хроматографии, хч Вода бидистиллированная или деионизованная н-Г ексан, хч

Кислота орто-фосфорная, хч, 85%

Метиловый спирт (метанол), хч Натрий сернокислый, безводный, хч Натрий хлористый, хч Натрий двууглекислый, хч

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией

МУК 4.1.2272-07

Колонка хроматографическая, стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасфер 110-С 18 (5 мкм)

(ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва)    ТУ 4215-001 -05451931 -94

Насос водоструйный вакуумный    ГОСТ    10696

Патроны концентрирующие Диалак С8 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931 -94 (ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва)

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или    ТУ 25-11-917-74

ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария) Силикагель 60 (0,063-0,2 мм) для колоночной хроматографии (Мерк, Германия) 1 степени активности

Стаканы химические вместимостью 100 и 500 см³    ГОСТ 25336

Стекловата

Установка для перегонки растворителей

Фильтры бумажные «красная лента», обеззоленные ТУ 6-09-2678-77

или фильтры из хроматографической бумаги Ватман ЗММ

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа

вместимостью 100 мм³, модель Microliter U 1710 (Hamilton,CIIIA)

Шприц медицинский с разъемом Льюсра вместимостью 20 см³ ГОСТ 22090

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими веществами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2.    Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313- 03 «Предельно допустимые кон-

8

МУК 4.1.2272-07

центрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

*    процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20+5)°С и относительной влажности не более 80%.

♦    выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8.

7.7. Очистка органических растворителей

7. 7. 7. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.7.2. Очистка н-гексана Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

9

МУК 4.1.2272-07

7.1.3. Очистка этилацетата

Этил ацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель 60 (0,063-0,20 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130°С в течение 5 часов.

7.2. Приготовление 0,005 М и 0,01 М растворов орто-фосфорной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают соответственно 0,34 см³ или 0,68 см³ 85%-ной орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.3.    Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего

патрона Диапак С8 для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля I степени активности в 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 см³ смеси гексан-этилацетат (1:9, по объему) и 30 см³ смеси гексан-эти л ацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 7 см³ ацетонитрила и 7 см³ смеси ацетонитрил-вода (4:6, по объему) со скоростью 5 см³/мин.

7.4.    Проверка хроматографического поведения феноксикарба

на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ градуировочного раствора № 1 феноксикарба с концентрацией