Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств фамоксадона в виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2271—07

Издание официальное

Москва • 2009

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств фамоксадона в виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2271- 07

7. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С 16 и Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия

( А.Гордон, Р.Форд Спутник химика, Москва, 1976 г., с.438-439)

7.1.2. Очистка гексана

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А.Гордон, Р.Форд Спутник химика, Москва, 1976 г., с.441).

7.1.3. Очистка диэтилового эфира

Диэтиповый эфир сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

7.1.4. Очистка бидистилпированной воды

Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

МУК 4.1.2271-07

7.2.Прнготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежепере-гнанные ацетонитрил и очищенную воду.

7.2.1.1. Приготовление 3,1 мМраствора ортофосфорной кислоты

В мерную колбу объемом 2,0 дм³ помещают 500 см³ очищенной воды и 0,42 см³ концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и еще раз перемешивают.

7.2.1.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 650 см³ ацетонитрила и 350 см³ 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1.    Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона

1,0 мг/см з

Взвешивают 100 мг Фамоксадона в мерной колбе объемом 100 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.2.2.    Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона

10,0 мкг/см³

Из стандартного раствора Фамоксадона с концентрацией

1,0 мг/см³ отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу

И

объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.2.3. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³ для построения калибровочной кривой и внесения в образцы сока

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³ и используют эти растворы для хроматографического исследования.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фамоксадона в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Фамоксадона. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений (рисунок 1).

7.4. Подготовка концентрирующих патронов, Диапак С 16 и Диапак Амин для очистки экстрактов

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин.

МУК 4.1.2271-07

Патрон Диапак Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 см³ смеси гексан- ацетон в соотношении 1:1 и 10 гексана. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.1.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак Амин

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/ см³, отбирают 1 см³, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30°С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 см³ смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.

7.5.2. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать

13

МУК 4.1.2271-07

5 см³/мин. При работе на патронах Диапак-С16 используют

очищенную воду.

Патрон Диапак-С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см³ (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 20 см³ воды. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.5.2.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак С16

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/ см³, отбирают 1 см³, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30°С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 см³ воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор вновь обмывают 10 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор еще раз обмывают двумя порциями по 10 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.

МУК 4.1.2271-07

7.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с пред-колонкой Symmetry С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25°С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3-4 часа.

8. ОТБОР ПРОБ И ХРАНЕНИЕ

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (№ 2051-79 от 21.08.79) а также с ГОСТ 25892-83 - «Виноградный сок, ТУ».

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4°С не более 10 суток.

9. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

9.1.Виноградный сок

9,1.1. Экстракция

Образец виноградного сока массой 10 г помещают в делительную воронку объемом 250 см³, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, 10 г сухого хлорида натрия, 50 мл диэтилового эфира и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной вороне нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 см³, а верхний эфирный слой с эмульсией - в химический стакан объемом 200 см. Затем водный слой возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще 2 раза в тех же условиях, используя по 30 см³ диэтилового эфира. Эфирный экстракт объединяют в химическом стакане, а водную фазу отбрасывают.

15

ББК 51.21 060

О 60 Определение остаточных количеств фамоксадона в виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 22 с.

1.    Разработаны Российским государственным аграрным университетом -МСХА им. К. А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром “Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России ( В.А. Калинин. -профессор, канд. с-х. наук, Е.В. Довгилевич - ст.н.сотр., канд. биол. наук, А.В. Довгилевич - ст.н.сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко - ст.н.сотр.).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по санигарио - гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 21.06. 2007 г.).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4.    Введены в действие с 15 декабря 2007 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

Формат 60x88/16    Печ.    л.    1,5.

Тираж 200 экз.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковсий пер., д. 18/20

Тиражировано отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, тел ./факс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2009 О Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

МУК 4.1.2271-07

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы по надзору

в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 сентября 2007 г.

Дата введения: 15.12.2007 г.

4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фамоксадоиа в виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2271-07

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фамоксадоиа в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг в виноградном соке.

Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула:

н

Эмпирическая формула: СаНц^С^.

Молекулярная масса: 374,4.

Химически чистый Фамоксадон представляет собой светлый кремовый порошок.

3

Давление паров: 6,4x10'⁷ Па при 20° С

Температура плавления: 141,3-142,3 °С.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: Kow logP =

4.8    (pH 5); 4,65 (pH 7); 5,55 (pH 9).

Растворимость в воде зависит от реакции среды и составляет 243x10 ** г/дм³ при pH 5; 111x1 О*⁶ г/дм³ при pH 7, при pH 9 вещество быстро гидролизуется.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³ при 20°С): ацетон - 274, ацетонитрил - 125, гексан - 0,0476, дихлорме-тан - 239, метанол - 10, толуол - 13,3, этилацетат - 124, н-октанол -1,78.

Фамоксадон нестабилен в водных растворах. Гидролиз наблюдается в диапазоне pH 5-9, и время полураспада составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при pH 5,0; 7,0 и 9,0 соответственно.

Период полураспада при фотолизе составляет 4,6 дней и

3.9    часов при pH 5 и 7,75 соответственно. В почве в лабораторных условиях период полуразложения DT50 составлял 6 дней в аэробных условиях и 28 - в анаэробных. Деградация происходила путем гидроксилирования и раскрытия кольца с образованием производных гликолевой кислоты. Первичная деградация была микробной и ускорялась под действием света.

Краткая токсикологическая характеристика. Фамоксадон относится к малоопасным веществам по острой пероральной токсичности (ЛД50 крысы - >5000 мг/кг), по дермальной (ЛД50 крысы - >2000 мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным по ингаляционной токсичности (ЛД50 крысы > 5300 мг/м³). Не обладает гено-токсичностью и онкогенными свойствами, не оказывает влияния на репродуктивную функцию. Из организма крыс Фамоксадон быстро выводится в неизмененном виде.

В России для Фамоксадона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в картофеле - 0,05 мг/кг.

Область применения. Фамоксадон - фунгицид контактного действия из группы оксазолидиндионов. Является ингибитором митохондриального дыхания, высокоэффективен против широкого

4

МУК 4.1.2271-07

спектра патогенных грибов с рекомендуемой нормой расхода 50-200 г д.в./га.

В России используется в виде смесевых препаратов для борьбы против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 150 г д.в./га, также разрешено применение в личных подсобных хозяйствах против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 15 г/10 л воды. Проходит регистрационные испытания на томатах, винограде и подсолнечнике.

1. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в Таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (п = 20) приведены в Таблице 2

Таблица 1. Метрологические параметры для Фамоксадона

Анализируемый объект Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Показатель точности (граница относительной погрешности), ±6, % Р=0,95 Стандартное отклонение повторяемости, о,, % Предел повторяемости, г, % Предел воспроизводимости, R, % Виноградный сок 0,02-0,10 50 4 па 13.3 0.1-0.2 25 3 8,4 Ю.О

5

Таблица 2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для Фамоксадона

Анализируемый объект Метрологические параметры, Р = 0.95, п = 20 Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S,% Доверительный интервал среднего результата, ±,% Виноградный ск 0,02 0,02-0,2 83,8 4,26 1.7

2. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ

Методика основана на определении Фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах Диапак С16 и Диапак Амин.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, РЕАКТИВЫ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Средства измерений

Весы аналитические «OHAUS», Е 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности ± 0,038 г «ACCULAB» V600.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 см³, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50-100 мм³.

6

МУК 4.1.2271-07

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см³, ГОСТ 20292-74.

Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа, номер госрегистрации 15311 -02.

Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 500 см³, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Фамоксадон, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 97,7% (фирма Дюпон де Немур Интернэшнл, СА)

Ацетон, осч. ТУ 2633-00-4-11291058-94

Ацетонитрил осч., УФ-205 нм, ТУ 6-09-2167-84.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, х.ч. для спектроскопии, ТУ 6-09-06-657-84

Калий марганцовокислый, ч.д.а. ГОСТ 20490-75.

Кальций хлористый, х.ч. ГОСТ 4161-76.

Кислота ортофосфорная, 85%, Fluka, каталожный номер 79621

Натрий сернокислый, безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч. ГОСТ 4233-77.

Патроны концентрирующие Диапак С 16 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94

Патроны концентрирующие Диапак Амин (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94

Эфир диэтиловый, ГОСТ 6265-74

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3 .3. Вспомогательные устройства н материалы

Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак С 16 и Диапак Амин.

7

Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1».

Банки с крышками для экстракции на 250 мл, полипропилен, кат.ХаЗ 120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 см³, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М,

ТУ 25-11-917-74 с водяной баней;

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 см³, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Колбы конические, плоскодонные объемом 250, 500 и 1000 см³, ГОСТ 9737-70

Концентраторы грушевидные и крупюдонные, объемом 100 и 250 см³, ГОСТ 10394-75

Насос диафрагменный FT. 19 фирмы KNF Neu Laboport.

Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry С 18, длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс

Стаканы стеклянные объемом 100-500 см³, ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей

Фильтры бумажные, “красная лента”, ТУ-б-09-1678-86.

Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реакти-

8

МУК 4.1.2271-07

вами по гост 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по гост 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по гост 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по гост 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельнодопустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по гост 12.0.004.

5. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРОВ

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

При выполнении измерений соблюдают следующие условия: -процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20±5)°с и относительной влажности не более 80%.

-выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9