«УТВЕРЖДАЮ»

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты!    *    -    -    юлучия человека

Главк!    фный врач РФ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕНДИМЕТАЛИНА В ЛУКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть

Торговое наименование: Кобра КЭ, Эстамп КЭ.

Фирма производитель: АгротреЙд Лтд, ЗАО «Щелково Агрохим».

Действующее вещество: пендиметалин.

Структурная формула:

N-{ 1 -этилпропил)-2,6-динитро-3,4-ксилидин (IUPAC).

N-(\ -этилпропил)-3,4-диметил-2,6-динитробензиламин (С А).

Брутто формула: C13H19N3O4.

Мол. масса: 281,3.

Разлагается при возгонке.

Химически чистый пендиметалин представляет собой оранжево-жблтые кристаллы. Температура плавления 54-58°С. Давление паров 4.0 мПа (25°С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Ко* lgP=5.18.

Растворимость в воде - 0.3 мг/л (20°С). Растворимость (г/л) при 26°С: ацетон - 55; изопропанол - 77; ксилол - 628; н-гептан - 138; кукурузное масло - 148. Хорошо растворим в бензоле, толуоле, хлороформе и дихлормстане. Растворим в пстролейном эфире и бензине. Очень стабилен при хранении (хранение при температуре 5-130°С). Устойчив к воздействию кислот и щелочей. Медленно разлагается на свету. DT50 в воде - менее 21 дня.

Острая пероральная токсичность LD50 (мг/кг): для крыс - 1050-1250. Острая дермальная токсичность LD50 для кроликов - более 5000 мг/кг. Не ирритант для глаз и кожи. LC50 (96 часов) для радужной форели - 0.14 мг/л. LD50 для пчйл - более 50 мкг/особь.

Группа токсичности по ЕРА - III, ВОЗ - III.

Пендиметалин - селективный гербицид, абсорбируемый корнями и листвой. Используется для контроля большинства однолетних трав и широколиственных сорняков при выращивании большинства сельскохозяйственных растений.

Гигиенические нормативы для пендиметалина в России:

ОДК в почве - 0.15 мг/кг, ПДК в воде водоемов - 0.05 мг/дм³ (органолептический лимитирующий показатель), ПДК в воздухе рабочей зоны - 0.5 мг/м³. МДУ для пендиметалина: соя (семена и масло), чеснок, табак, хмель сухой - 0.1 мг/кг; петрушка - 0.05 мг/кг. В МДУ для пендиметалина: томаты, морковь, капуста, огурец - 0.05 мг/кг. Для лука гигиенические нормативы в России не установлены.

2. Методика определения пендиметалина в луке методом ВЭЖХ

2.1.    Основные положения

2.1.1.    Принцип метода

Методика основана на определении пендиметалина методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с флорисилом.

2.1.2.    Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Объект анализа Предел обнаруж ения, мг/кг Диапазон измеряемых концентраций мг/кг Среднее значение определения, % (для каждого объекта п=24) Относительное стандартное отклонение S, % Доверитель ный интервал среднего, п=24, Р=0.95 Лук-перо 0.01 0.01-0.1 83.6 5.3 4.7 Лук-репка 0.01 0.01-0.1 83.7 5.3 4.7

Полнота определения пендиметалина в луке методом ВЭЖХ (п = 6 для каждой концентрации)

Таблица 2

Среда Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, ± Полнота определения, % 1 2 3 4 5 Лук-перо 0.01 0.00841 0.00053 84.1 0.02 0.01646 0.00111 82.3 0.05 0.04175 0.0026 83.5 0.1 0.0846 0.0051 84.6 Среднее 83.6 Лук-рспка 0.01 0.00822 0.00057 82.2 0.02 0.01688 0.00102 84.4 0.05 0.04215 0.0025 84.3 0.1 0.0839 0.0052 83.9 Среднее 83.7

уи>

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

11ендиметалин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 94,7%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (75:25, по объему).

Флорисил для колоночной хроматографии (0.150-0.250 мм) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент для колоночной хроматографии: смесь гексан - этил ацетат (75:25, по объему). Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

23. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry С-18, (250x4.6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ВйсЫ R-200 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ250 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 и КШ500 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25 336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

I (илиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25,50,100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

11ипетки мерные вместимостью 1,2,5,10 см³, ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25x1) см.

2.4.    Отбор проб

Отбор гфоб лука производится в соответствии с ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый» и ГОСТ 27166-86 «Лук репчатый свежий реализуемый».

2.5.    Подготовка к определению

2.5.1.    Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К₂СОз). Ацетонитрил сушат над пснтоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этил ацетат промывают равным объёмом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2.    Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3.    Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 75:25 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента для колоночной хроматографии в колбе на 1000 мл смешивают 750 мл н-гексана и 250 мл этил ацетата.

Приготовление градуировочных растворов

Берут точную навеску пендим Сталин а (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (исходный раствор с концентрацией 0.5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1,0.2, 0.5,1.0 и 2.0 мкг/мл готовят

методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил: вода =75:25, по объему).

Г радуй ровочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в учение 1 месяца.

При изучении полноты определения пендиметалина используют ацетонитрильные растворы вещества. Для внесения в лук-перо и лук-репу растворы с концентрациями 0.1 и 1.0 мкг/мл готовят из градуировочного раствора с концентрацией 0.5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Раствор пендиметалина в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/мл для проверки хроматографического поведения пендиметалина на колонке с флорисилом готовят из исходного раствора 0.5 мг/мл последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.5.4.    Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пендиметалина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пендиметалина в I радуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5.    Подготовка колонки с флорисилом дла очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорнсила в 20 мл гексана. Не позволяя иысохнуть верхней кромке слоя флорнсила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10-15 мм. Колонку промывают 20 мл элюента для колоночной хроматографии, затем 30 мл гексана со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6.    Проверка хроматографического поведения пендиметалина на колонке с

флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора пендиметалина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха ( температура не выше 40°С), остаток растворяют в 5 мл гексана и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл гексана и также вносят на колонку. Промывают колонку 40 мл гексана, которые отбрасывают, затем 50 мл элюента для колоночной хроматографии со скоростью 1-1 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание пендиметалина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие пендимСталин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание пендиметалина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание:    параметры    удерживания    пендиметалина и сопутствующих

1кстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

/л*

2.6. Проведение определения

2.6.1.    Извлечение пенднметалнна из проб лука-репки

Навеску гомогенизированных луковиц, массой 20 г помещают в коническую колбу ёмкостью 250 мл. К навеске приливают 100 мл смеси ацетон-вода (3:1, по объёму) и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке    через бумажный    фильтр    "красная    лента".    Осадок    с фильтра

количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют ещё со 100 мл 75%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45-50мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Объём экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.2.    Извлечение пенднметалина из проб зеленого лука

Навеску гомогенизированных перьев лука, массой 20 г помещают в коническую колбу ёмкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (1:1, по объёму) и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке    через бумажный    фильтр    "красная    лента".    Осадок    с фильтра

количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют со 100 мл 50%-ного водного ацетона. Экстракт упаривают до водного остатка (90-95мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Объём экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.63. Очистка экстрактов

Полученные по п.п. 2.6.1. и 2.6.2. водные экстракты помещают в делительную воронку, объёмом 250 мл и экстрагируют пендиметалин трижды гексаном порциями по 30 мл (собирают верхний органический слой), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1-2 минут. Объединённый гексановый раствор пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.*

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

* В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п.2.6.3.) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с флорисилом можно исключить.

2.6.4.    Очистка на колонке с флорисилом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.2.6.5, экстрактов растительных материалов количественно переносят двумя 5-мл порциями гексана в кондиционированную хроматографическую колонку (п.2.5.5.). Промывают колонку 40 мл гексана. Элюат отбрасывают. Пендиметалин элюируют 40 мл смеси гексан - этил ацетат (75:25, по объему), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха в вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5.    Условия хроматографирования

///

Жидкостный хроматограф "Альянс” фирмы Waters с УФ детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 432 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4.6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 75:25.

Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания пендиметалина 8.9±0.1 мин.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0.1 - 2.0 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание пендиметалина в образцах растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S₂ • С • V S, • Р

где Si- площадь пика пендиметалина в градуировочном растворе, мм²;

S₂- площадь пика пендиметалина в анализируемой пробе, мм²;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация градуировочного раствора пендиметалина, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств пендиметалина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор пендиметалина 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Требовании техники безопасности

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6. 2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.    Разработчики

Цибульская И.А., Должснко В.И., Юзихин О.С. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

//г