Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации Первый заместт    воохранения

Да!

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по определению остаточных количеств тебуконазола в зерне и соломе риса, ягодах и соке винограда методом газожидкостной хроматографии

1. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Фирма производитель: Байер КропСайенс АГ (Германия)

Торговое название: ФАЛЬКОН Действующее вещество: тебуконазол

(RS)-1 -п-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1Н-1,2,4-триазол-1 -илметил)пентан-3-ол

этанол

(С.А.)

Эмпирическая формула: CiJfeClNjO Молекулярная масса: 307,8 Существует в виде смеси рацематов Бесцветное кристаллическое вещество Температура плавления: 105°С Давление паров: 1,7 х 10’⁵ мПа при 20°С Коэффициент распределения н-октанол/вода: К<,„ log Р = 3,7. Растворимость (г/л) при 20°С: дихлорметан - более 200, изопропанрд, толуол - 50-100, гексан - менее 0,1, вода - 0,036.

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5-9 и фотолизу.

Тебуконазол медленно разрушается в почве и слабо передвигается по почвенному профилю.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD30) для крыс 3000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD30) для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) Для крыс - 5,1 мг/л воздуха. Тебуконазол вызывает слабое раздражение слизистой оболочки глаз у кроликов. LC50 для рыб 5,7 мг/л (96 час.).

Тебуконазол нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей. Гигиенические нормативы для тебуконазола в России: ОДК в почве - 0,4 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,025 мг/дм³; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,4 мг/м³; МДУ для зерна хлебных злаков - 0,2 мг/кг, ВМДУ для винограда - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата:

Тебуконазол - системный фунгицид широкого спектра действия. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, фузариоза, головни на зерновых злаках, серой гнили винограда, антракноза льна. Используется как для обработки вегетирующих растений, так и для протравливания семян. Иногда применяется в комбинациях с другими фунгицидами. Тебуконазол входит в состав комбинированного фунгицида Фалькон, КЭ, содержащего в 1 л препарата 250 г спироксамина, 167 г тебуконазола и 43 г триадименола. В настоящее время этот препарат проходит регистрационные испытания в России в качестве средства борьбы с пирикуляриозом риса и оидиумом винограда.

2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТЕБУКОНАЗОЛА В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ РИСА, ЯГОДАХ И СОКЕ ВИНОГРАДА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1    Основные положения

2.1.1    Принцип метода

Методика основала на газохроматографическом определении тебуконазола с ТИД на неподвижном «>.к OV-! 7 после экстракции его из ягод ацетоном, из зерна и соломы водным аисюном и и* нити равного сока дихлорметаном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешииакчиихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2    Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании риса и винограда.

лл

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица Метрологические параметры метода

Анализи руемый объект Метрологические параметры, Р = 0,95, п = 20 Предел обнару жения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг Среднее значение определения, % Стандартное отклонение, S, % Относи тельное откло нение, % Довери тельный интервал среднего, % Зерно 0,05 0,05-0,5 84,3 5,8 2,6 у? •II Солома 0,1 0,1-1,0 84,6 3,9 1,7 ±3,6 Ягоды 0,05 0,05-0,5 86,0 4,2 1,9 ±3,9 Сок 0,05 0,05-0,5 85,7 5,1 2,3 ±4,8

2.2 Реактивы, растворы, материалы

Тебуконазол с содержанием д.в. 97,4% (Байер, Германия)

Ацетон, ГОСТ 2603-79 Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78 Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72 Калия перманганат, ГОСТ 20490-75 Кальция хлорид, хч., ГОСТ 4161-77 Калий углекислый, хч., ГОСТ 4221-76 Кислота серная, хч., ГОСТ 4204-77 Метилен хлористый, ГОСТ 19433-88 Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79 Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77 Натрия сульфат безводный, хч., ГОСТ 4166-76 Натрия хлорид, хч., ГОСТ 4233-77 Толуол, ГОСТ 5789-78 Этилацетат, ГОСТ 22300-76

Элюент N1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (2:8, по объему)

Азот газообразный, осч., ГОСТ 9293-74

Водород, получаемый из генератора водорода, ГОСТ 3023-80

Воздух из баллона, ГОСТ 9-010-80

Силикагель (0,063-0,2 мм) для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности Стекловата

/з

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678

2.3 Приборы, аппаратура, посуда

Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с ТИД на азотсодержащие вещества с пределом детектирования не выше 2,82x10'¹⁴ г/с или аналогичный Колонка хроматографическая, набивная, стеклянная, 2000x3 мм, неподвижная фаза-3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12-0,15 мм)

Колонка капиллярная ZB1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex, США или аналогичная

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф по ТУ 64-1-2850

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75

Встряхиватель механический, ТУ 64-1 -1081 -73

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63

Колонка для адсорбционной хроматографии, 25x1,8 см

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная

Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73

Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82 Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75 Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 9737-70 Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74 Колбы грушевидные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82 Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79 г.). Зерно и солому риса подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Виноград хранят в стеклянной посуде в холодильнике при температуре не выше +4°С не более двух дней; при длительном хранении (не более трех месяцев) пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18°С. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице, а ягоды измельчают.

2.5 Подготовка к определению

2.5.1    Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 270°С в течение 8-10 часов.

Капиллярную колонку с фазой ZB 1 устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 280°С в течение 8-10 часов.

2.5.2    Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К₂СОз).

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130°С в течение 3 часов.

2.5.3    Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор тебуконазола с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0103 г препарата, содержащего 97,4% д.в., в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,1, 0,2,0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора тебуконазола соответствующим последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.4    Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора тебуконазола с концентрацией 0.1, 0,2 , 0,5 и 1,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади

/г

хроматографического пика в мВ*с от концентрации тебуконазола в растворе в м кг/мл.

2.5.5    Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 3 г силикагеля в 10 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 25 мл смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему) и 20 мл гексана со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова для работы.

2.5.6    Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора тебуконазола с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл гексана и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), затем 60 мл элюента N1 (гексан-этилацетат, 2:8) со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.7.

Фракции, содержащие тебуконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл толуола и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание тебуконазола в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль вымывания тебуконазола может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6    Описание определения

2.6.1    Экстракция тебуконазола

2.6.1.1    Зерно, солома. К навеске размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл указанного выше водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают половину объема (около 70 мл) раствора, эквивалентного 5 г зерна или 2,5 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2    Ягоды. К навеске (20 г) измельченного материала добавляют 100 мл ацетона и гомогенизируют 3 минуты при 10000 об/мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл ацетона. Из объединенного ацетонового экстракта отбирают половину объема (около 75 мл) раствора, эквивалентного 10 г ягод. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3 Сок. К 10 мл свежевыжатого сока добавляют 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и содержимое переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. В воронку добавляют 30 мл хлористого метилена и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают хлористым метиленом еще два раза (30+20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С. Сухой остаток растворяют в 5 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п.2.7.

2.6.2    Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из пп. 2.6.1.1 и 2.6.1.2) упаривают до водной фазы (объем 5-15 мл) на роторном испарителе при температуре 40°С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия, 30 мл хлористого метилена и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают хлористым метиленом еще два раза (30+20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С.

2.6.3    Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.2.6.2 экстрактов растительного материала, количественно переносят тремя 1-мл порциями    смеси    гексан-этилацетат    (8:2) в подготовленную

хроматографическую колонку (п.2.5.5). Колонку промывают 40 мл смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему), которые отбрасывают. Тебуконазол элюируют 50 мл элюента №1 (гексан-этилацетат, 2:8), и элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С. Сухой остаток экстрактов зерна и соломы растворяют в 2,5 мл, экстракта ягод в 5 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.7.

2.7 Условия хроматографирования

2.7.1 Метод ГЖХ с насадочными колонками

Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с термоионным детектором на азотсодержащие вещества с пределом детектирования не выше 2,82x10* ⁴ г/с.

Колонка стеклянная, спиральная 1000 х 3 мм; неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,125-0,150 мм)

Температура детектора 330°С, инжектора 270°С, термостата колонки 245°С

Скорость потока газа-носителя (азота) - 30 мл/мин; водорода - 10,8 мл/мин, воздуха - 200 мл/мин

Объем вводимой пробы - 2 мкл

Время удерживания тебуконазола: 3 мин 20 сек

/г

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2 нг

Альтернативная неподвижная фаза: 3% OV-61 на Хромосорбе W/HP (0,16-0,20 мм); колонка стеклянная 1000 х 3 мм; температура колонки-230°С, испарителя-270°С, детектора-330°С.

Время удерживания тебуконазола: 2 мин 34 сек

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю плошадь хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0мкг/мл, разбавляют толуолом.

2.7.2 Метод ГЖХ с капиллярными колонками

Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с термоионным детектором

Колонка капиллярная кварцевая ZB 1,30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм (SE-30)

Температура термостата колонки программированная:    начальная

температура - 160°С, выдержка 1 минуту; нагрев колонки по 25°/мин до температуры 240°С, выдержка 0 минут; нагрев колонки по 4°/мин до температуры 265°С, выдержка 5 минут; нагрев колонки по 25°/мин до температуры 280°С, выдержка 5 минут. Температура термостата испарителя -270°С, детектора - 330°С.

Газовый режим: газ-носитель - азот, общий расход - 22,7 мл/мин; газ для поддува в детектор - азот, расход - 20 мл/мин. Расход водорода - 11,8 мл/мин, воздуха - 200 мл/мин.

Деление потока: 1:2.

Абсолютное время удерживания тебуконазола: 10 мин 36 сек

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют толуолом.

2.8 Обработка результатов анализа

Содержание тебуконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Н, х А х V

X =------------, где

Но хш

X - содержание тебуконазола в пробе, мг/кг;

Н| - плошадь пика образца, мВ*с;

Но - площадь пика стандарта, мВ*с;

А - концентрация стандартного раствора тебуконазола, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

№

m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы -2,5 г. для ягод- 10 г, для сока-10 мл).

3.    ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными    веществами,

электронагревательными приборами.

4.    КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5.    РАЗРАБОТЧИКИ

Дубовая Л.В., научн. сотр., Макеев А.М., зав. лабораторией, канд. биол. наук

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обят* п/о Большие Вяземы, тел.

/9