Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования ____Российской    Федерации_

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды

Сборник методических указаний МУК 4.1.1802—4.1.1820—03; 4.1.1822—4.1.1826—03

Выпуск 5

Издание официальное

Москва . 2007

УТВЕРЖДАЮ

Глтиый тсулирст ценный санитарный врач Российской Федерации Первый заместитель министра здравоохранения Российс|| Фелерйции

[. Г. Онищенко

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ но определению остаточных количеств тиаметоксама в капусте, зеленой массе, семенах и масле рапса и горчицы, смородине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

I. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Фирма производитель: Сингента Крон Протекши АГ (Швейцария) Торговое название: АКТА РА, КРУЙЗБР Действующее вещество: тиаметоксам (ЦГА 293343) 3-(2-хж>р-тиазол-5-нлметил)-3-метил-[1,3,5]оксадиазинам-4-илиден-Ь1-нитроамии (ИЮГТАК)

3-[(2-хлор-5-тиазолил) метил) теграгидро-5-метил-М-нигро-4Н-1,3,5-оксадиазии-4-имин (С.А.)

Эмпирическая формула: CgHioClNsOiS Молекулярная масса: 291,7 Белый кристаллический порошок без запаха Температура плавления: 139,1°С Давление паров при 25°С: 6,6 х 10'^чПа

Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log Р = -0,13 Растворимость (г/л) ггри 25°С: ацетонитрил - 78. ацегоп -42.5. дихлормстан 43, метанол - 10,2, этилацетат 5,7, толуол -0,6, вода - 4,1.

Стабильность к гидролизу при 25°С: DT₃₍> больше 1 года при pH 5 и 7; 4,2 дня при pH 9.

В присутствии света в водных фотолитических условиях тиамстоксам быстро деградирует с периодом полураспада 2,3 дня.

Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD₃₀) для крыс - 1560 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₃₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - более 3720 мг/м³ воздуха. Тиамстоксам не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика. LC» для рыб более 100 мг/л (96 час.).

Инсектицид нетоксичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и токсичен для пчел.

Гигиенические нормативы для тиамстоксама в России: ПДК в почве - 0,06 мг/кг; ПДК в воде - 0,1 мг/дм³; ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,4 мг/м³; МДУ для зерна хлебных злаков и картофеля - 0,02 мг/кг, для 01урцов и гороха - 0,05 мг/кг.

Область применения препарата Тиаметоксам является системным инсектицидом. Он воздействует на никотиново-ацетилхолиновый рецептор нервной системы насекомых, обладает быстрой желудочной и контактной активностью. Вещество проявляет высокую эффективность против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных, зерновых и цветочных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, хлопчатнике и рисе.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговыми названиями Актара, ВДГ (250 г тиамстоксама в 1 кг препара т) и Круйзер, СК (350 г тиамстоксама в 1 л препарата). Первый применяется в дозах от 40 до 400 r/ia (по д.в. 10-100 г/га) против вредной черепашки, злаковой галлицы и пья вицы на пшенице и ячмене, колорадского жука на картофеле, плодожорки, тлей и трипсов на овощных и плодовых культурах путем однократной обработки Bei-етирующих растений за сезон. Второй предназначен для борьбы с почвенными и грызущими насекомыми на посевах рапса, горчицы и сахарной свеклы путем предпосевной обработки семян при норме расхода препарата до 14л/т семян.

2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСГАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИАМЕТОКСАМА В КАПУСТЕ. ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА И ГОРЧИЦЫ, СМОРОДИНЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1    Основные положения

2.1.1    Принцип метода

36

Метод основан на определении тиаметоксама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с улырафиолетовым детектором после экстракции его из семян и масла горчицы и рапса ацетонитрилом при ультразвуковой обработке, из зеленой массы, капусты и смородины водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением инсектицида в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2    Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых, овощных и плодовых культур.

2.1.3    Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологические параметры метода

Анализи руемый объект Метрологические параметры. Р - 0,95, п *- 20 1 Трсдел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определе ния, % Стандар тное отклонение, S, % Относи тельное откло нение, % Довери тельный интервал среднего, % ('смена рапса 0,02 0,02-0.2 85,1 4.8 2.2 *4,5 Масло рапса 0,05 0,05-0,5 82.9 4,8 2,1 *4,5 Семена горчицы 0.02 0.02-0,2 82,1 3,3 1,5 ±3,3 Масло горчицы 0,05 0.05-0,5 81,5 2.8 1,3 ±2.8 Капуста 0.02 0,02-0,2 83,5 2,8 1,3 ±2,8 Смородина 0,02 0,02-0,2 84,0 3,6 1.6 ±3,6 Зеленая масса 0,02 0.02-0,2 80,3 4.2 1.9 ±4,2

2.2 Реактивы, растворы, материалы

Тиаметоксам с содержанием д.в. 99,3% (Новартис, Швейцария) Ацетон, чда, ГОСТ 2603-79 Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534*87 Вода бидистиллироваиная, 1 ОСТ 7602-72

Гексан, ч„ ТУ 6-09-3375-78 Калия перманганат, хч., ГОСТ 20490-75 Кальция хлорид, хч., ГОСТ 4161-77 Калий углекислый, хч., ГОСТ 4221-76 Кислота серная, хч., ГОСТ 4204-77 Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77 Натрия сульфат безводный, хч., ГОСТ 4166-76 Натрий углекислый, хч., ГОСТ 83-63 Натрия хлорид, хч., ГОСТ 4233-77 Спирт метиловый, хч., ГОСТ 6995-77 Хлористый метилен, ГОСТ 12794-80 Этилацетат, ГОСТ 22300-76

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь этилацетат-ме-танол (80:20, по объему)

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь метанол-вода (33:67, по объему) Силикагель для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия)

I степени активности или силикагель КСК (60-J00 меш)

Стекловата

Целит 535 (2-15 мкм) /Ссрва, Германия/ или аналогичный Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678

2.3 Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматофаф с ультрафиолетовым детектором фирмы Knauer (Германия) или аналогичный

Хроматчирафическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасфер 110-С18 или Диасорб I30-C8 Т (АО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)

Шприц для плода образцов п жидкостный хромазчираф Баня ультразвуковая, модель D-50, Branson Instr. Со., США Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74 Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75 Ветряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-73 Гомогенизатор, МР'ГУ 42-1505-63 или аналогичный Прибор для перегонки при атмосферном давлении Мельница электрическая лабораторная, ГУ 46-22-236-79 или аналогичная

Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76 Баня водяная, ТУ 46-22-603-75 Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73

Воронки делительные вместимостью 100, 250 и 1000 мл, ГОСТ 25336-82

Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75 Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 250 и 500 мл.

ГОСТ 9737-70

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл,

ГОСТ 25336-82

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74

Колбы грушевидные вместимостью 100, 250 и 500 мл. ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные вместимостью 1,2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74R

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10мл, ГОСТ 10515-75

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичесгв пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79 г ).

Отобранные пробы семян рапса и горчицы хранят в стеклянной или полиэтиленовой rape в холодильнике при температуре не выше 4°С не более трех месяцев. Зеленую массу, капусту и смородину замораживают при температуре 18°С и храпят в морозильной камере не более трех месяцев.

Перед анализом семена рапса и горчицы размалывают на мельнице, зеленую массу и капусту измельчают ножом.

2.5 Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка растворителей и материалов

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют d соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концетрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К.₂СОз).

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора углекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Силикагель 1 степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130°С в течение 3 часов.

3S

2.5.2    Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

При подготовке подвижной фазы отмеряют 330 мл метанола, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 670 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

2.5.3    Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ смесыо метанол-вода (33:67, по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5-15 минут).

2.5.4    Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор тиаметоксама с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,3% д.в., в метаноле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12°С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,01 , 0,02 , 0,05 и 0,10 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора тиаметоксама соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике при земпературе не выше 4°С не более 2 дней.

2.5.5    Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного [рафика в инжектор хроматографа вводят но 20 мкл рабочего стандартного раствора тиаметоксама с концентрацией 0,01 , 0,02 , 0,05 и 0,10 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находяз* среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации тиаметоксама в растворе в мкг/мл.

2.5.6    Подготовка колонки с силикагелем

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают край и приливают около 5 мл этилацетата. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 10 мл этилацетата со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7.11роверка хроматофафического поведения тиаметоксама на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу ёмкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора тиаметоксама с концентрацией 10 мкг/мл, отдувают растворитель

потоком тёплого воздуха, осгаток растворяют в 2-3 мл этилацетата. Промывают колонку 50 мл этилацетата и затем 50 мл элюента № 1 (смесь этилацетат-метанол, 80:20) со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание тиаметоксама по п. 2.7.

Фракции, содержащие тиаметоксам, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 10 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по и. 2.7. Рассчитывают содержание вещесгва в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объём элюента.

ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль вымывания тиаметоксама может меняться мри использовании новых партий сорбента и растворителей.

2.6 Описание определения

2.6.1    Экстракция тиаметоксама

2.6.1.1    Зеленая масса, капуста, ягоды. Навеску (25 г) ягод, измельченной зеленой массы или капусты помещают в стакан гомогенизатора, приливают 100 мл 50%-ного водного ацетона и гомогенизируют в течение 5 минут при 8000 об/мин. К гомогенату добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный материал на фильтре промывают 50 мл 50%-ного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 30 мл), эквивалентную 5 г растительного материала. Дальнейшую очистку экстрактов проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3.

2.6.1.2    Семена. Навеску (10 г) размолотых семян рапса или горчицы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл ацетонитрила и помещают в ультразвуковую баню на 5 минут. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 50 мл ацетонитрила. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 35 мл), эквивалентную 2,5 г семян. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3    Масло. К навеске масла (1 г) добавляют 20 мл гексана и переносят в дели тельную воронку емкостью 100 мл, приливают 30 мл ацетонитрила и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию обрабатывают 10 мл гексана при встряхивании. Отделяют ацетонитрильную фазу и очищают ее по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2 Очистка экстрактов

2.6.2.1 Зеленая масса, капуста, ягоды. Отобранные аликвоты экстрактов зеленой массы, капусты и ягод (из п. 2.6.1.1) упаривают до водной фазы на роторном испарителе при температуре 40°С. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 15 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 минуты и гексановый слой отбрасывают. Водную фазу обрабатывают 30 мл хлористого метилена при встряхивании и органический слой собирают в колбу

*/

вместимостью 200 мл. Экстракцию хлористым метиленом повторяют еще два раза (30+20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30°С.

2.G.2.2 Семена. Отобранные аликвоты экстрактов семян (из п. 2. 6.1.2) переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл гексана и эмульсию встряхивают в течение I минуты. После разделения слоев гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фазу упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40°С.

2.6.2.3 Масло. Ацетонитрильный экстракт масла (из п. 2.6.1.3) упаривают до маслянистого остатка на роторном испарителе при температуре 40°С. Остаток растворяют в 30 мл ацетонитрила и раствор переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. Приливают 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Отбрасывают гексановый слой, а ацетонитрильную фазу упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40°С.

2.6.3 Очистка на колонке с силикагелем

Сухие остатки, полученные при упаривании очищенных по п.2.6.2 экстрактов растительного материала, количественно переносят тремя 1-мл порциями этил ацетата в подготовленную хроматографическую колонку (и. 2.5.6). Колонку промывают 40 мл этилацетата, который отбрасывают, а тиаметоксам элюируют 35 мл смеси этилацетат-метанол (80:20, по объему) и элюат собирают в 100 мл грушевидную колбу. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С. Сухие остатки элюатоя зеленой массы, капусты и ягод растворяют в 10 мл, а элюатов семян и масла в 5 мл подвижной фазы дня ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание тиаметоксама по п.2.7.

2.7 Условия хроматофафирования

Жидкостный хроматофаф с ультрафиолетовым детектором Кпаиег (Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая в качестве неподвижной фазы Диасфер 110-С 18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол-вода (33:67, по объему)

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин Рабочая длина волны: 255 нм Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу Объем вводимой пробы: 20 мкл Время удерживания тиаметоксама: около 5 минут Линейный диапазон детектирования 0,2 - 2 иг

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С8 Т (6 мкм)

Время удерживания тиаметоксама: около 4 мин 40 сек.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,1 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8 Обработка результатов анализа

Содержание тиаметоксама рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Н, х А х V

X =--------------,    где

Но х ш

X - содержание тиаметоксама в пробе, мг/кг;

Н| - высота пика образца, мм;

Но - высота пика стандарта, мм;

А - концентрация стандартного раствора тиаметоксама, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса или объем анализируемой части образца, г или мл

(для зеленой массы, капусты, ягод - 5 г; для семян - 2,5 г; для масла - 1 г).

3.    ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАС1ЮСТИ

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными    веществами,

электронагревательными приборами.

4.    КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. РАЗРАБОТЧИКИ