УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Первый заместителе жистр4 здравоохранения .Райской Федерации

^Лг.г.онищннко

Дата введения: 40ш+ы    »

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИПРОВАЛИКАР&А В ВОДЕ, ПОЧВЕ, БОТВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

1. Вводная часть

Фирма производитель: Байер АГ.

Торговое наименование: Мелоди-дуо. Действующее вещество: ипроваликарб (ISO) Структурная формула:

Изопропил- Л^г-(2-метил-1-[1-(4-толуил)этилкарбамоил)- (S)-nponwi] карбамат (1UPAC). 1-метил:т1п[(1$)-2-мстил-1-[[[1-(4-метилфснил)этил]амино]карбонил]пропил]кар6амат(СА). Брутто формула: СцНа N2O3 Мол. масса: 320,4.

Химически чистый препарат - бело-желтый порошок. Смесь (S.S)- и (S.R)- диастереомеров. Температура плавления: 183°C(SR); I99°C(SS); 163-165 °С (смесь).

Давление паров при 20 °С: 7,7* | О'⁵ Па (смесь); 4,4* 10 ^s Па (SR); 3,5* 10’⁵ Па (SS). Коэффициент распределения н-октанол/вола: К<>* log Р - 3,2 Растворимость (мг/л) при 20 ®С: вода - 11 (SR); 6,8 (SS).

Константа Генри при 20 *С: 1.3x10"⁴ Па м³ Monb'(SR); 1.6x10^-4 Па м³ моль' (SS). Ипроваликарб разлагаемся в почве при аэробных условиях, образуя СО2.

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LD») для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD») для крыс - более 5000 мг/кг: не раздражает глаза и кожу. Ингаляционная токсичность (LCjo) для крыс - более 4977 мг/м³ воздуха. Мутагенная, нсйротоксичсская, эмбриотоксическая и канцерогенная активности отсутствуют. LDjo для пчел более 199 мкг/особь при экспозиции 48 часов. LCjo для рыб

более 20 мг/л при экслоэиции 96 часов.

Гигиенические нормативы для ипроваликарба в России не установлены.

Область применения препарата: Ипроваликарб - системный фунгицид с защитным и лечебным действием. Используется для защиты на виноградниках, на картофеле, томатах, огурцах и табаке.

2. Методика определения нпроваликарба в воде, почве, ботве и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1.    Основные положения

2.1.1.    Прннцви метода

Методика основана на определении ипроваликарба методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.12. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаруже ния мг/кг	Диапазон определяемых концентраций мг/кг	Среднее значение определения,%	Относитель ное стандартное отклонение S,%	Доверительный интервал среднего, N=4 (n=5), Р-0.95
Вода	0.002	0.002-0.02	88.2	5.8	5.0
Почва	0.04	0.04-0.4	82.7	6.9	6.0
Ботва картофеля	0.04	0.04 - 0.4	83.6	7.6	6.6
Клубни картофеля	0.02	0.02-0.2	81.6	6.9	6.)

4

Полнота определении нпроваликарба в ботве и клубнях картофеля (N■"5 дли каждой копнет рации)

Таблица 2

Среда Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, S, мг/кг Доверительный интервал, (Р-0.95, п-6).% Полнота определения, % 1 2 3 4 5 6 Вода 0,002 0.00182 1,2-10-* ““ 4,8 91.0 0.004 0,00354 5.4 88,5 0.01 0,00859 5,9*10-* 4,7 _ _ 85,9 0,02 0,01746 8,7-16* 3.5 87,3 Среднее 88,2 Почва 0.04 0,03368 2,59-1 5.2 84,2 0,08 0,06712 6.70 10*3 6,7 83.9 0.2 0,1614 \,72~\0^~ 4.9 80.7 0.4 0,3272 2.60-10*:1 5,2 81.8 Среднее 82,7 Ботва картофеля 0,04 0,03332 3,1310*' 6.3 83.3 0,08 0.06888 7,27-10'-*1 7.3 86,1 0,2 0,1704 Т.37-10 5,5 85.2 0,4 0,3196 2.84-10' 5.7 79,9 Среднее 83,6 Клубни картофеля 0,02 0,01630 1.5ll0*J" 6.0 _ 81.5 0,04 0,03396 3,22-10** 6.4 84.9 0,1 0,07920 5.95-10' 4.8 79,2 0,2 0.1612 1.23-10^ 4,9 80.6 Среднее 81.6

2.13. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Аналитический стандарт ипроваликарба фирмы «Байер А Г» с содержанием 98,6 %.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "белая лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная. деионизированная. ГОСТ 6709-79.

ДиэтиловыЙ эфир. ч.. ОСТ 84-2006-88.

Железо (И) сернокислое, х.ч.. ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСГ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, сасжспрокалснный.

Натрий хлористый, чл.а., ГОСТ 4233-77.

5

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.

н-Гсксан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегналный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (50:50, по объему).

Силикагель 60 (40-бЗмкм) (производства Германия или Чехии).

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюснт №1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (75:25, по объему).

Элюснт №2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (50:50, по объему).

2.3.    Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный. Колонка Symmetry - Cl8 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters. USA) или аналогичная. Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200. ГОСТ 34104-80Б или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга». ГУ 3.836.008.

Гомогенизатор высокоскоростной, МРТУ 42-1505.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный. Бидистиллятор.

Насос водоструйный. МРТУ 42 861-64.

Воронка Бюхнера. ГОСТ 0147-73.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ100.1000 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ10 14/19, КШ250 29/32 ТС, ПОСТ 10384-72.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1.2, 5, 10 см³, ГОСТ 22292-74.

Хроматографическая стеклянная колонка, длиной 300 мм, диаметром 10 мм.

2.4.    Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (X? 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С. Перед анализом пробы ботвы и клубней картофеля измельчают в гомогенизаторе.

2.5.    Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Диэтиловый эфир (I л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем

6

диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5 %-ным раствором перманганата калия, 5 %-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г КМпС>4 и 2 г KjCOj). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2.    Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (I мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3.    Приготовление растворов

Для приготовления 0.1М раствора NaHCOj 9.3 г кристаллического бикарбоната натрия помешают в мерную колбу на 1л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки. Для приготовления 20% раствора хлористого натрия 200 г кристаллического NaCl помещают в мерную колбу на 1л. растворяют при перемешивании в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки. Для получения 50%-го водного ацетона в колбе смкосгъю 1л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, отмеряя объем смешиваемых жидкостей мерными цилиндрами. Для приготовления подвижной фазы смешивают 500 мл ацетонитрила с 500 мл бидистиллированой воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента X?! в колбе на 1000 мл смешивают 750 мл н-гексана и 250 мл диэтнлового эфира. Для приготовления элюента №2 в колбе на 1000 мл смешивают 500 мл н-гексаиа и 500 мл диэтилового эфира.

2.5.4.    Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску ипроваликарба (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1.0.2, 0.5,1.0 и 2.0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - вода (50:50, по объему)]. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение рабочего дня. При определении полноты извлечения раствор с концентрацией 10 мкг/мл для внесения н контрольный образец готовят в мерной колбе на 100 мл путвм разведения ацетонитрилом I мл стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл. Раствор с концентрацией I мкг/мл готовят в мерной колбе на 25 мл путем разведения ацетонитрилом 2,5 мл стандартного раствора с концентрацией 10 мкг/мл.

2.5.5.    Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация ипроваликарба в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ипроваликарба в градуировочном растворе (мкг/мл).

7

2.5.6.    Подготовка колонки с силикагелем для очистки -экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан -диэтнловый эфир (75:25, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 50 мл элюента № 2 и затем 50 мл элюента № 1 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7.    Проверка хроматографического поведения иировалнкарба на колонке с силикагелем.

В крутлодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора ипроваликарба с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента Xsl и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюета №1 и так же вносят в колонку . Промывают колонку 50 мл элюента №1, затем 70 мл элюента Х*2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание ипроваликарба по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие ипроваликарб, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание ипроваликарба в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание:    профиль    вымывания    ипроваликарба    может    меняться при

использовании новой партии сорбента.

2.5.8.    Подготовка приборов и средств измерения.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1.    Вода.

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл переносят в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют к воде 100 мл 20%-ного раствора NaCI и экстрагируют ипроваликарб гексаном трижды порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 5 минут. Объединенный экстракт промывают дважды 0,1 М раствором бикарбоната натрия порциями по 40 мл, встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 5 минут. Гексановый экстракт сушат, пропуская через слой Юг безводного сернокислого натрия (осушитель дополнительно промывают 10-15 мл гексана). После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с силикагелем по п. 2.6.5.

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2.    Экстракция проб почвы

Навеску воздушно-сухой почвы, массой 20 г помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 200 мл смеси растворителей ацетон - вода (в соотношении 1:1. по объему) и экстрагируют ипроваликарб на ультразвуковой ванне 10 мин. Экстракт фильтруют через

s

бумажный фильтр (белая лента). Экстракцию проводят ещё дважды со 100 мл той же смеси. Из объединённого фильтрага отбирают четвёртую часть объёма раствора, эквивалентную 5 г почвы. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40° до полного удаления ацетона. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Далее проводят очистку экстрактов по п.2.6.4.

1.63. Экстракция проб ботвы и клубней картофеля

К навеске (20 г) измельчённого материала добавляют 100 мл гомогенизированных ботвы или клубней картофеля смеси растворителей ацетон-вода (в соотношении 1:1, по объёму) и гомогенизируют при 10000 об/мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр белая лента в колбу на 250 мл, осадок на фильтре промывают ещё 50 мл указанного выше водного ацетона. Из объединённого экстракта отбирают часть объёма, соответствующую навеске ботвы 5 г и клубней картофеля 10 г. Экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40° до полного удаления ацетона. Если объём экстракта менее 100 мл его доводят до указанного значения дистиллированной водой. Далее проводят очистку экстрактов по п.2.6.3.

2.6.4.    Очистка экстрактов

Экстракты, полученные по п.п. 2.6.2. и 2.6.3. переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл 20%-го раствора хлорида натрия и экстрагируют нпроваликарб 50 мл гексана, встряхивая смесь в течение 5 минут. После разделения верхний гексановый слой собирают, экстракцию осуществляют ещё дважды порциями гексана по 50 мл/ Объединённый гексановый раствор промывают дважды 0,1М раствором бикарбоната натрия порциями по 40 мл, встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 5 минут. Нижний водный слой отбрасывают. Гексановый экстракт сушат, пропуская через слой Юг безводного сернокислого натрия (осушитель дополнительно промывают 10-15 мл гексана), затем упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°С. Дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем по п.2.6.5**.

В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции гексаном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку 10-15 мл 10%-ного раствора NajSO^

** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (л.2.6.4.) дает удовлетворительные результаты при хроматографировании, дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

2.6.5.    Очистка экстрактов на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1. и 2.6.4. экстрактов, количественно переносят двумя порциями по 5 мл смеси растворителей гсксан-диэтиловый эфир (75:25, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6.). Промывают колонку 50 мл элюента №1, который отбрасывают. Нпроваликарб элюируют 80 мл элюента Xs2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.6.    Условии хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487),

9

снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry - Cl8 (250x4.6) мм. зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 30±1®С.

Предколоика Waters Symmetry С-18 (20x3.9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 50:50 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 220 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания нпроваликарба 12.2 ± 02 мин.

Линейный диапазон детектирования 0.1 - 2.0 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной 1радуировки, содержание нпроваликарба в анализируемых образцах (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

SjxCxV

X - -

S,xP

S|- площадь пика нпроваликарба в стандартном растворе, мм²;

Sj- площадь пика нпроваликарба в анализируемой пробе, мм²;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора нпроваликарба, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств ипроваликарба в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ипроваликарба 2 мкг/мл разбавляют.

3. Требования техники безопасности.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Контроль погрешности кзмерсный.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСП. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

S. Разработчики.

Цибульская И.А., Юэихин О.С., Черменская Т.Д., Долженко В.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР).