МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МИКРОКОЛИЧЕСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

В ПРОДУКТАХ

ПИТАНИЯ,

КОРМАХ

ИВНЕШНЕЙ

СРЕДЕ

Том 2

МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МИКРОКОЛИЧЕСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

В ПРОДУКТАХ

ПИТАНИЯ,

КОРМАХ

И ВНЕШНЕЙ

СРЕДЕ

В ДВУХ ТОМАХ

Том 2

МОСКВА ВО «АГРОПРОМИЗДАТ» 1992

эдров, приходящихся на единицу изучаемой площади. Для этого необходимо предварительно определить площадь поля зрения при данном увеличении или площадь квадрата окулярной сетки (в случае использования окуляра с сеткой). Эти измерения проводят с помощью объект-микрометра.

Количество полиэдров в I мл исследуемой суспензии Л1 (концентрат смыва со 100 см² поверхности) определяют по формуле

где а — среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки; 5 — площадь исследуемого мазка, мм²; S\ — площадь квадрата окулярной сетки, мм⁵; V — объем нанесенной суспензии, мл.

Количество полиэдров подсчитывают в 100 и более квадратах окулярной сетки.

П р и м е р. Для анализа взяли листья с обработанного препаратом дерева, определили среднюю площадь их поверхности—100 см². Сделали смыв с листьев и обработали его по способу, описанному выше. Приготовленный препарат покрасили по непрямому методу Кунса.

При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее количество полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки (2.so = 320). Отсюда а = 320/150=2,13. Площадь мазка 5=20 ммХ20 мм = 400 мм². Сторона квадрата окулярной сетки 0,0062 мм (определили с помощью объект-микро-метра), площадь квадрата окулярной сетки Si = (0,0062)²=0,00004 мм². Объем нанесенной на стекло суспензии V=0,02 мл.

Таким образом,

aS 2,13 400

VS: *" 0,02-0,00004 ^{= 1(1}'¹⁰ ’

т. е. на 100 см² обследованной площади приходится 1,1Х10⁹ полиэдров, а на 1 см² площади—1,1-10⁷-

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).

127

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1 НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Амиловый эфир уксусной кислоты, ТУ 6-09-1239—76.

4-Аминоантипирин, ТУ 6-09-3948—75.

Аммиак особой чистоты, ГОСТ 24147-82; водный, ГОСТ 3760-79.

Аммония молибдат, ГОСТ 3765-78.

Аммония персульфат, ГОСТ 20478-75.

Аммоний роданистый, ГОСТ 27067-86.

Аммоний сульфаминовой кислоты, ТУ 6-09-15-364—78.

Аммоний углекислый кислый, ГОСТ 3762-78.

Аммония хлорид. ГОСТ 3773-72.

Ангидрид уксусный, ГОСТ 5815-77.

Анилин солянокислый, ГОСТ 5822-78.

Аннокообмеииая смола АВ-17-8, ГОСТ 20301-74.

Ацетон, ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил. ТУ 6-09-3534—74.

Бария хлорид, ГОСТ 4108-72.

Бензиднн. ТУ 6-09 10-1310—78.

Бензол, ГОСТ 5955-75.

Бор трехфтористый, эфират, ТУ 6-09-804—77.

Бром, ГОСТ 4109-79.

Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-450-77.

Бромтнмоловый синий, ТУ 6-09-2045—77.

Бромфеноловый синий, ТУ 6-09-4530—77.

Бумага индикаторная универсальная, ТУ 6-09-1181—76.

Вазелиновое масло, ГОСТ 3164-78.

Висмута нитрат основной, ГОСТ 4110-75.

Водород газообразный, из баллона, ГОСТ 3022-80.

Воздух газообразный, из баллона, ГОСТ 9-010-80. и-Гексан, ТУ 6-09-3375—78. я-Геатан, ГОСТ 25828-83.

Гибберелин кристаллический, ТУ 64-3-103 —75.

Гидразин сульфат, ГОСТ 5841-74.

Гндрокснламин солянокислый, ГОСТ 5456-79.

Гипс медицинский, ГОСТ 3210-77.

Глицерин, ГОСТ 6824-76.

2,6-Двбром-М-хлорхныонимин, ТУ 6-09-05-63—73. л-Днметиламннобекзальдегид, ту 6-09-3272—77.

Д и метиле ульфоксид, ТУ 6-09-3818—74.

Диметилформамид, ГОСТ 20258-74 Е.

Дитизон, ГОСТ 10165-79.

Дифениламин, ГОСТ 5825-70.

Днэтнламин. ГОСТ 13279-67.

Диэткленглнколь, ГОСТ 10136-77.

Днэтиловый эфир фталевой кислоты. ТУ 6 09-3663—74.

Железо (III) хлорное, ГОСТ 4147-74.

Изооктан, ГОСТ 12433-83.

Индиго (динатриевая соль дисульфокислоты), ТУ 6 09-07-44—73. Индоксилацетат, ТУ 6-09-07-1156—78.

Индофенилацетат, ТУ 6-09-469—77.

Иод, ГОСТ 4159-79.

Йодистый метил, ГОСТ 6518-69.

Кадмия йодид, ГОСТ 8421-79.

Кадмий уксуснокислый, ГОСТ 5824-79.

Калия бромат, ГОСТ 4457-74.

Калия бромид, ГОСТ 4160-74.

Калия гидроксид, ГОСТ 24363-80.

Калий железистосинеродистый. ГОСТ 4207-75.

Калии железосииеродистый, ГОСТ 4206-75.

Калия иодид, ГОСТ 4232-74.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Калия роданид, ГОСТ 4139-75.

Калий фосфорнокислый, двузаметенный, трехводный. ГОСТ 2493-75 Калия фосфат однозаметенный. ГОСТ 4198-75.

Калий хлорноватокнслый, ГОСТ 2713-74.

Калий щавелевокислый, ГОСТ 5868-78.

Кальции сульфат. ГОСТ 3210-77.

Кальция хлорид, ГОСТ 4161-77.

Катиониты, ГОСТ 20298-74.

Кислота азотная особой чистоты, ГОСТ 11125—8ч.

Кислота аскорбиновая, ГОСТ 4815-76.

Кислота борная, ГОСТ 9656-75.

Кислота винная, ГОСТ 5817-77.

Кислота кремниевая, ГОСТ 1214-78.

Кислота лимонная, ГОСТ 908-79 Е.

Кислота муравьиная, ГОСТ 5848-73.

Кислота серная особой чистоты, ГОСТ 14262-78; х. ч.. ГОСТ 4204-77. Кислота сульфа и иловая, ГОСТ 5821-78.

Кислота тногликолевая, ТУ 6-09-3115—73.

Кислота трихлоруксусная, ТУ 6-09-1926—77.

Кислота уксусная особой чистоты. ГОСТ 18270-72; ледяная ч д а ГОСТ 61-75.

Кислота ^-фосфорная. ГОСТ 6552-80.

Кислота фосфорно-вольфрамовая, ГОСТ 18290“-72.

Кислота фосфорно-молибденовая. ТУ 6-09-3540—78.

Кислота хлороводородная х. ч., ГОСТ 3118-77; особой чистоты, ГОСТ 14261-77.

Кислота щавелевая, ГОСТ 22180 -76.

Крахмал водорастворимый, ГОСТ 10163-76.

Кремния диоксид для люминофоров, ТУ 6-09-3644—74 Ксилол, ТУ 6 09-3825-78.

Лантана нитрат, ТУ 6-09-4676—78.

Магния сульфат, ГОСТ 4523-77.

Магния хлорат, ГОСТ 10483-83 Е.

Меди нитрат, ТУ 6-09-3757—74.

Меди сульфат, ГОСТ 19347-84 Е.

Медь уксуснокислая, ГОСТ 5852-79.

Метиламин солянокислый, ТУ 6*09-2088—77.

Метиловый красный, ТУ 6-09-5169—84.

Метиловый оранжевый, ТУ 6-09-4530—77.

Мочевина, ГОСТ 6691-77.

Натрия нитрит, ГОСТ 4197-74.

Натрия нитрат, ГОСТ 4168-79.

327

Натрий вольфрамовокислый. ГОСТ 18289-78.

Натрия гидроксид х. ч.. ГОСТ 4328-77; очищенный. ГОСТ 11078-78. Натрия гндросульфат, ГОСТ 246-76.

Натрий двууглекислый. ГОСТ 83-79.

Натрия дитионат, ТУ 6-09 01-283—75.

Натриевая соль додецилсульфокислоты, ТУ 6-09 64—75.

Натрий лимоннокислый, ГОСТ 22280-76.

Натрия мета-бисульфит. ГОСТ 10575-76.

Натрия нитропруссид, ГОСТ 4218-78.

Натрия сульфат безводный, ГОСТ 4166-76.

Натрий серноватнстокислый, ГОСТ 27068-86.

Натрий тетраборокнслый, ГОСТ 4199-76.

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4201-79.

Натрий уксуснокислый, ГОСТ 18290-72.

Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77. а-Нафтила мин, ГОСТ 8827-74.

N-(1 -Нафтил)этилендиамик дигидрохлорид, ТУ 6-09-15-420—80. а-Нафтол, ГОСТ 5838-79. л-Нитроаннлин, ТУ 6-09-258—77.

4 (л-Нитробензил)пиридин, ТУ 6 09-15-93—74.

Нитрометан, ТУ 6-09-11-876—77.

Нингидрнн, ТУ 6-09-10-1384—79. л-Нитрофенол, МРТУ 6-09-3973—75.

Оксид алюминия для хроматографии, ГОСТ 8136-85.

Олово гранулированное. ТУ 6 09*2704—78.

Олово двуххлористос, ГОСТ 36-78.

Палладий двуххлористый, ТУ 6-09-2025—72.

Парафин. ТУ 6-09-3637—74.

Пенополиуретан эластичный. ТУ 6-05-1688—79.

Перекись водорода, ГОСТ 10929-76.

Пирокатехин фиолетовый, ТУ 6-09-07-1087—78.

Полидиэтиленгликоль сукцинат (ПДЭГС). ТУ 6-09-2827 —77.

Прочный голубой Б, ГОСТ 11263-80.

Прочный красный Б, ГОСТ 11827-77.

Резорцин, ГОСТ 9970-74.

Ртуть металлическая, ГОСТ 4658-73 Е.

Сахароза, ГОСТ 5833-75.

Свинец уксуснокислый, ГОСТ 1027-67.

Серебра нитрат, ГОСТ 1277-75.

Силикагель КСК для хроматографии, ГОСТ 3956-76 R.

Спирт амиловый, ТУ 6-09-3467—79.

Спирт м-бутнловый, ГОСТ 6006-78.

Спирт изопропиловый. ГОСТ 9805-84.

Спирт метиловый, ГОСТ 6995-77.

Спирт октиловый, ТУ 6-09-11-1055—78.

Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5962-67.

Судан, ТУ 6-09-4124-75.

Тальк очищенный, ГОСТ 19729-74.

Тетраэтилеипентамии. ТУ 6-09-05-804—78.

Титана сульфат, ТУ 6 09-01-477—77.

Титан трех хлористый, ГОСТ 311-78. о-Тол и дин, ТУ 6 09-2232—75.

0-Толундин, ТУ 6-09*2992—73.

Толуол. ГОСТ 5789-78 Трилон-Б, ГОСТ 10652-73.

Трнфторуксусный ангидрид. ТУ 6-09-4135—75.

2,2,2-Трихлорэтанол. ТУ 6-09-11-719—76.

328

Углерод четырехх лорнеты ft, ГОСТ 20288-74.

Уголь активированный АГ-3, АГ-5, ГОСТ 20464-75. Уголь активированный БАУ, ТУ 6 09-3247—73.

Уголь активированный КАД, МРТУ 6-09-1049—64. Уголь активированный ОУ-А, МРТУ 6-09-1049—64. 2-Феноксиэтаиол, ТУ 6-09-13-493—76.

Фенолфталеин, ГОСТ 5850-72.

Фильтры бумажные, ТУ 6-09-1678—77.

Хлористый метилен. ГОСТ 12794-80.

Хлороформ, ГОСТ 20015-74.

Циклогексан, ТУ 6-09-06-452—76.

Пинк гранулированный. ГОСТ 989-75. Цнпк-дитиол, ТУ 6-09-05-142—79.

Цинковая пыль, ГОСТ 12601-76.

Цинка сульфат, ГОСТ 4529-78.

Цинка хлорид, ГОСТ 4529-78.

Этнлаиетат, ГОСТ 22300 - 76.

Этиленгликоль, ГОСТ 10164-75.

Этпленднамин дигидрохлорнд, ТУ 6 09-10-645—77. Эфир диэтнловый, ГОСТ 6265-74.

Эфир петролейный. ТУ МХП-1867—48.

Приложение 2 НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА ПОСУДУ ЛАБОРАТОРНУЮ

Посуда мерная лабораторная стеклянная (цилиндры, мензурки, мерные колбы, градуированные пробирки), ГОСТ 1770-74 Е.

Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые, ГОСТ 9147-80 Е.

Посуда и аппаратура лабораторная стеклянная. Шлифы сферические н взаимозаменяемые (вся химическая посуда на нормальных шлифах: круглодонные, плоскодонные, грушевидные колбы, колбы Эрленмейера, холодильники. двугорлые колбы, аллонжи, дефлегматоры и т. д.), ГОСЛГ 9737—70.

Приборы мерные лабораторные стеклянные (бюретки, пипетки), ГОСТ 20292-74 Е.

Пикнометры стеклянные, ГОСТ 22524-74 Е.

Посуда н оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры (воронки делительные, эксикаторы, камеры хроматографические, водоструйные насосы, стаканы стеклянные, пульверизаторы, бюк-сы, колбы, воронки Шотта и т. д.), ГОСТ 25336-82 Е.

Приложение 3

НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА ПРИБОРЫ И АППАРАТУРУ

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081—73 или аналогичный.

Аспирационное устройство, ТУ 64-1862—77.

Баня водяная, ТУ 64-1*2850—76.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19491-74.

Весы аналитические лабораторные, ТУ 64-1-1065—73.

Генератор водорода.

329

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505—63.

Денситометр БИАН-170, ТУ 64-1-56—73.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-IM, ТУ 25-11-917—76 или аналогичный.

Лампа ртутно-кварцевая, ТУ 16-535-280—74 или аналогичная

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236—79 или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, МШ-1, ГОСТ 20292-74 Е.

Центрифуга, МРТУ 42-219—69.

Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1411—76 Е.

Шприц медицинский, ГОСТ 22090-83 Е.

Электрокофемолка, ГОСТ 19423-81 Е.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83 Е.

Колбонагреватель электрический, ТУ 92-275—76.

Приложение 4 САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ НОРМЫ СОДЕРЖАНИЯ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, ВОЗДУХЕ,

ВОДЕ И ПОЧВЕ

Приведенные в данном сборнике методики определения остаточных количеств пестицидов предназначены для контроля за содержанием пестицидов в различных средах с целью выявления нарушений санитарно-гигиенических норм (МДУ, ПДК), их устранения и разработки мер профилактики.

Определения терминов заимствованы из «Словаря термином и их определения в области гигиенического нормирования факторов окружающей среды» под ред. академика Г. И. Сидоренко (М., 1988) и «Методических указаний по гигиенической оценке новых пестицидов» (Киев: ВНИИГИНТОКС, 1988).

Предельно допустимая концентрация (ПДК)—наибольшая концентрация Вредного вещества в объектах окружающей среды, которая в условиях постоянного воздействия иа организм или в отдаленные сроки после него не вызывает у человека каких-либо заболеваний или отклонений в состоянии здоровья, а также не влияет на условия его жизни.

Ориентировочный безопасный уровень воздействия (ОБУВ)—устанавливаемый расчетным методом временный ориентировочный гигиенический норматив содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе населенных мест, воде водоемов, продуктах питания, используемый в основном для целей предупредительного санитарного надзора. Утверждается Министерством здравоохранения СССР на ограниченный срок (2—3 года), после чего может быть заменен ПДК, переутвержден на новый срок или отменен в зависимости от перспективы применения вещества и имеющейся информации о его токсических свойствах.

ПДК химических веществ в воздухе рабочей зоны — концентрация вредного вещества в воздухе рабочей зоны, воздействие которой независимо от наличия других вредных факторов в пределах нормативов при ежедневной работе в течение 8 ч (при другой продолжительности в пределах 41 ч и неделю) за весь рабочий стаж и в отдаленный после него период не вызовет у работающего и его потомства каких-либо заболеваний или других отклонений в состоянии здоровья, обнаруживаемых современными методами.

ПДК пестицидов в воздухе рабочей зоны при их применении в сельском хозяйстве — это предельно допустимые концентрации, установленные с учетом особенностей сельскохозяйственного производства (кратковременность и периодичность работы с пестицидами, влияние метеорологических факторов, непостоянство концентраций и т. п.) (табл. 196, 197, 198).

Г л а в a 13. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ*

Б соответствии с уставом Международного общества биологической борьбы, принятым в 1971 г., биологическая борьба в сельском и лесном хозяйствах определяется как использование живых существ и продуктов их жизнедеятельности для предотвращения или снижения ущерба, причиняемого вредными организмами. Сформировалось 3 направления биологической борьбы:

использование полезных видов насекомых для борьбы с вредными насекомыми (насекомые-энтомофаги) и сорняками (насекомые-фитофаги); применение в борьбе с вредителями и возбудителями болезней растений препаратов на основе микроорганизмов и продуктов нх жизнедеятельности (биопрепараты);

использование биологически активных веществ, синтезируемых насекомыми, или их химических аналогов (феромоны и гормоны насекомых).

Все 3 направления, используя те или иные средства, предусматривают снижение численности вредного вида до экономически безопасного уровня. Они нс рассчитаны на его полное истребление. Это позволяет сохранять существующие в природе связи между видами, т. е. предполагает экологическую безопасность.

Вместе с тем с применением в качестве действующих начал микроорганизмов, способных к размножению, а также использованием биологически активных веществ микробного синтеза либо веществ, синтезируемых насекомыми, необходимо предусматривать гигиеническую оценку рекомендуемых средств — изучение возможных отрицательных эффектов, возникающих при производстве и применении биологических средств защиты растений, в том числе возможное негативное влияние на здоровье населения. Такое исследование не может быть выполнено без определения действующих начал биологических средств в окружающей среде, позволяющего оценить реальные уровни загрязнения и наметить меры по его предупреждению. Наибольшую потенциальную опасность с позиций биологического загрязнения среды представляют собой биопрепараты, а также гормоны и феромоны насекомых, что нашло отражение в разработке методов определения биологических средств защиты растений.

Применение в защите растений полезных видов насекомых предусматривает использование хищных насекомых и насскомых-паразптов. Паразитических и хищных насекомых обычно называют энтомофагами. Насекомых, питающихся сорной растительностью, называют фитофагами. Все приемы борьбы с вредными организмами с помощью энтомофагов и фитофагов безопасны для окружающей среды и нецелевых видов, включая человека.

Использование биопрепаратов сопровождается внесением в окружающую среду различного рода микроорганизмов, способных к размножению. По-

Раздел подготовлен Е. А. Мельниковой (ВНИИГИНТОКС).

107

скольку условия применения биопрепаратов такие же, как химических лести-цидов, они могут загрязнять объекты окружающей среды остаточными количествами, что представляет опасность для нецелевых видов. Чтобы определить потенциальную опасность использования биопрепаратов, необходимо знать их характерные особенности.

Микробиологический метод защиты растений предусматривает использование микроорганизмов, вызывающих заболевания среди вредных членистоногих (вирусы, бактерии, грибы и др.), антибиотиков и токсинов фунгицидного действия, микробов — антагонистов возбудителей фитоинфекций.

По назначению биопрепараты используются в качестве инсектицидов, фунгицидов и родентицидов. Товарные формы биопрепаратов имеют вид смачивающихся и сухих порошков, паст, суспензий. В зависимости от качества действующих начал различают вирусные, бактериальные, грибные, токсин- и антибиотиксодержащие препараты.

Вирусные инсектициды создают на основе энтомопатогенных вирусов, вызывающих у восприимчивых насекомых инфекционную болезнь и последующую гибель. Вирусы насекомых принадлежат в основном к семейству б&куловирусов, особенность которых — способность к образованию внутри пораженной клетки кристаллических белковых включений в виде полиэдров или гранул. Внутри полиэдров и гранул содержатся собственно вирусные частицы — вырионы.

При попадании с кормом в кишечник чувствительного насекомого белковая оболочка полиэдров и гранул растворяется, и вирусные частицы проникают в ткани насекомого, вызывая заболевание и гибель.

Вирусные инсектициды высоко специфичны. Они патогенны обычно для одного вида вредителей. В настоящее время созданы вирусные биопрепараты против американской белой бабочки, капустной, хлопковой и озимой совок, рыжего соснового пилильщика, непарного шелкопряда и ряда других вредителей сельскохозяйственных культур и лесных насаждений.

Учитывая особую роль вирусов в патологии биологических видов, исследования по оценке безопасности вирусных инсектицидов проводят особенно тщательно. В опытах на различных моделях выясняют, в какой мере энтомопатогенные вирусы способны развиваться в клетках теплокровных животных, могут ли они проявлять инфекционно-токсическое или аллергическое действие, а также способны ли они оказывать отдаленный эффект (эмбриотоксическое, канцерогенное, тератогенное действие). К настоящему времени исследования по безопасности проведены более чем на 50 энтомо-патогенных вирусах и 20 видах позвоночных, в том числе на млекопитающих, включая человека.

Ни в одном из проведенных опытов не было получено данных, подтверждающих опасность энтомопатогенных вирусов для нецелевых видов.

Большинство бактериальных препаратов для защиты растений во всех странах производят на основе энтомопатогенных бацилл турингиензис. Они отличаются друг от друга содержанием в качестве действующего начала различных штаммов бацилл турингиензис, выделенных от больных насекомых в разных географических зонах. В СССР это препараты гомелин. дендроба-циллин, битоксибациллин, бактокулицид, лепидоцид, инсектнн, ВИП, энто-бактерии.

Заражение здорового насекомого происходит через загрязненный спорами бацилл растительный корм. Попадая в кишечник, споры прорастают в вегетативные клетки, в которых, в свою очередь, в процессе созревания образуется спора и формируются кристаллы эндотоксинов. Далее споры проникают в гемолимфу (кровь) насекомого, прорастают и вызывают септицемию и гибель насекомого. Важное место в патогенезе инфекции имеет эндотоксин. который вызывает распад клеток эндотелия кишечника и его паралич. Некоторые разновидности бацилл турингиензис образует также экзотоксин, который оказывает на насекомых овоцидное и тератогенное действие.

168

В последние годы ведется работа по испытанию других бактерий для •борьбы с вредными насекомыми. Так, испытываются псевдомонады и бацнл-•лы субтилис. На основе бактерий рода сальмонелла разработан и выпускается промышленностью бактороденцид, зерновой и аминокостный препараты для борьбы с мышами-полевками.

Исследования возможного патогенного действия бацилл турингиензнс л отношении теплокровных животных проводились с первых лет производства и испытания биопрепаратов как за рубежом, так и в нашей стране. В настоящее время действие бацилл турингиензнс испытано на 10 видах млекопитающих, 7 видах птиц н на 5 видах рыб. Во всех опытах бациллы турингиензнс не вызывали развития инфекционного заболевания и не размножались в нецелевых видах. После введения культур кристаллоспорообразующих бацилл турингиензнс млекопитающим и птицам исследователи обнаруживали споры микроорганизма в органах животных в течение 5—14 сут после воздействия. При этом каких-либо признаков заболевания и морфологических изменений в органах не обнаружено.

Товарные формы биопрепаратов этой группы практически нетоксичны для млекопитающих, но при длительном поступлении в организм через органы дыхания могут вызвать развитие явлений аллергии. Многие серотипы бацилл турингиензнс продуцируют термостабильный экзотоксин, который у чувствительных насекомых вызывает тератогенный эффект. В опытах с биопрепаратами, содержащими небольшое количество экзотоксина (до 2%), тератогенного действия на теплокровных животных не выявлено.

Среди возбудителей болезней насекомых важную роль играют микроскопические грибы. Заражение насекомых грибами происходит как через желудочно-кишечный тракт, так и через кожные покровы. Патогенное действие грибных инсектицидов обусловлено механическим повреждением тела вредителя прорастающими спорами и мицелием гриба, а также воздействием образуемых грибом токсинов. Токсические продукты жизнедеятельности микроскопических грибов способны также оказывать последействие, снижая плодовитость самок или вызывая развитие уродливых особей в поколении вредителя. Для борьбы с вредными насекомыми используют грибы боверия Зассиана (бовернн), энтомофтора (микоафидин и энтомофторин), вертнцил* лнум, ашсрсония, пецмломицее фаринозус (пецнломин).

Изучение безопасности энтомопатогенных грибов проведено на 4 видах лабораторных животных и куриных эмбрионах. Изучалось действие спор грибов и токсинов, содержащихся в культуральной жидкости при выращивании грибов на жидких питательных средах. Действующие начала н товарные формы грибных препаратов вводили в желудок н иетрапернтонеаль-«о. Ни в одном опыте не было получено результатов, свидетельствующих о патогенном действии грибов на теплокровных. Товарные формы биопрепаратов на основе грибов оказались практически нетоксичными для животных. В опытах на животных и в условиях производства установлено их аллергенное действие.

В биологической борьбе с болезнями культурных растений используют явление антагонизма между разными видами микрофлоры. В основе его лежит способность отдельных видов микрофлоры образовывать и выделять в окружающую среду токсичные для других видов микроорганизмов вещества (антибиотики). Их используют для предупреждения и лечения ряда вирусных, бактериальных и грибных болезней растений. Биопрепаратом, содержащим микробы-антагонисты или химически очищенные антибиотики, обрабатывают семенной материал перед посадкой или вносят его в почву.

Для борьбы с болезнями растений предложены препараты на основе разных штаммов псевдомонад (миколитин, изип, гаукенн и др.) н на основе грибов (триходермнн), а также антибиотики фитобактериомицин и трнхоте-цин. Все биопрепараты на основе бактерий или грибов, предложенные для защиты растений от возбудителей болезней, практически безопасны для теп-

109

.покровных организмов: культуры микроорганизмов не размножаются в организме млекопитающих и не образуют выраженных токсинов. Товарные формы биопрепаратов практически нетоксичны для теплокровных. Антибиотики трихотецин и фитобактериомицин производят промышленным способом. За рубежом, кроме антибиотиков, специально предназначенных для защиты растении (казумин, бластцидин, полиоксин и др.), используют и медицинские антибиотики (хлортетрациклин, стрептомицин и др.).

Токсикологические свойства антибиотиков, применяемых для борьбы с болезнями растений, зависят от их химических свойств и очень разнообразны. Так, трихотецин, изокротиловый эфир кетоспирта трихотеколона, принадлежит к среднетоксичным веществам. Он не кумулятивен и не аллергенен, но в больших концентрациях раздражает кожу и слизистые оболочки. Фитобактериомицин, стрептотриции сложного состава, более токсичен, особенно при поступлении через органы дыхания. Фитобактернмицин — выраженный аллерген, высококумулятивен, способен раздражать кожу и слизистые оболочки. В связи с относительно высокой токсичностью антибиотики применяют в основном путем обработки семян или посадочного материала.

В последние годы получают применение новые методы биологической борьбы с вредителями, основанные на использовании феромонов и гормонов насекомых. В природных условиях каждая особь насекомых вырабатывает и выделяет во внешнюю среду вещества, способствующие коммуникации между видами. Это феромоны. Лучше других изучены половые феромоны, которые используются насекомыми для встречи насекомых разного пола. Вырабатываются феромоны, обеспечивающие колонизацию вида (агрегацнонные феромоны), выполняющие роль аттрактантов или репеллентов, и др.

Ныне идентифицированы феромоны более чем для 700 видов насекомых. Многие из них синтезированы химиками и испытываются в защите растений. В СССР к 1983 г. были синтезированы феромоны более чем для 40 видов, в том числе для таких вредителей, как плодожорки, совки, листовертки, короеды, щелкуны и др.

Феромоны применяют в испарителях, которые либо помешают ь ловушки, либо рассеивают над полем с помощью авиации. Нормы расхода феромонов чрезвычайно малы (от 5—6 до 250 мг/га).

В последнее время для борьбы с вредными насекомыми стали применять гормоны насекомых, объединяемые общим понятием ювенильные гормоны (ЮГ), или синтетические аналоги гормонов (АЮГ),— вещества, химически не сходные с природными гормонами, но проявляющие гормоноподобное действие и нарушающие, как и гормоны, процессы развития и метаморфоза насекомых. Ныне синтезировано более 2000 АЮГ. Гормональные препараты используют для обработки вегетирующих культур, нормы их расхода приближаются к нормам расхода пестицидов.

Считается, что феромоны и гормоны обладают высокой избирательностью действия. Эти вещества проявляют активность в очень небольших количествах и привлекают насекомых с очень больших расстояний.

Все изученные феромоны и гормоны насекомых оказались малотокснчны-ми соединениями. Сейчас выясняют, могут ли они проявлять другие отрицательные свойства, в частности влиять на эндокринную систему теплокровных Опыты проводят на животных.

Таким образом, биологические средства защиты растений в большинстве своем — часть природных биоценозов. Однако антропогенный способ их получения и использование Не всегда может гарантировать полную их безвредность. Это обусловливает необходимость изучения поведения вновь рекомендуемых средств во внешней среде, для чего требуется разработка методов их определения.

Утверждено 12.05.83 Л» 2798—83 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БИОПРЕПАРАТА ВИРИН'КШ НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ*

Краткая характеристика препарата. Вирин-КШ — энтомопатогенный (инсектицидный) препарат. Предназначается для борьбы с гусеницами кольчатого шелкопряда. Действующее начало — вирус ядерного полиэдроза из семен-

Разработаны В. Л. Васильевой, В. И. Трусовым (КНИИЭИБ).

124

ства бакуловирусов, содержащийся в препарате в виде полиэдров. Полиэдры — вирусные тельца-включения, которые образуются в клетках тканей» больных гусениц. Они представляют собой многогранники из кристаллизованного белка, содержащие от десятка до нескольких сотен вирусных частиц. Размеры полиэдров 1—3 мк. Препарат — суспензия полиэдров в 50%-ном глицерине с титром не менее МО⁹ пдр/мл. Применяется путем опрыскивания плодовых деревьев против гусениц разных возрастов.

Принцип метода. Для выявления микроколичеств препарата вирин-КШ во внешней среде применяется непрямой вариант ИФ-метода (метод Кунса) с использованием кроличьей специфической антиполиэдренной иммунной сыворотки и стандартной меченной флюорохромом ослиной сыворотки против глобулинов кролика.

На обьектах и субстратах внешней среды выявляют исключительно полиэдры (тельца-включения), так как свободные вирусные частицы весьма лабильны и легко разрушаются под влиянием различных факторов. Для выявления полиэдров (антигена) готовят специфическую антиполиэдренную иммунную сыворотку. Реакция выявляется под микроскопом в виде ярко-зеленого свечения полиэдров, особенно их ободка.

Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно определить количество полиэдров от 0,5 • 10^х и более в 1 мл субстрата.

Избирательность метода. При условии применения качественной гипериммунной антиполиэдренной сыворотки и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфичный и высокочувствительный, а при наличии специфической антисыворотки так же, как. экспресс-метод.

Реактивы и материалы, приборы и посуда. Люминесцируюшая ослиная сыворотка против глобулинов кролика, изготовленная Институтом эпидемиологии и микробиологии им. И. Ф. Гамалеи. Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯПКШ. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или днметнлфталат. Дистиллированная вода. Физиологический раствор (0,15 М хлорида натрия), pH 7,4—7,6. Ацетон. Мертнолят натрия или борная кислота. Синька Эванса — Cs^iNeNaiOm. Адъювант Фрейнда. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, 5-ыитрооксихинолин). Люминесцентный микроскоп. Центрифуга ЦЛС-1 или ЦЛН-1 и др. Пинетки градуированные на 1 и 5 мл. Чашки Петри. Предметные стекла. Пакеты марлевых салфеток 5X5 см.

Отбор проб. Пробы хранят при температуре бытового холодильника 4 ®С. Для выявления полиэдров на поверхности объектов проводят смывы с них. Пинцетом берут из заранее приготовленных стерильных пакетов марлевую салфетку (5X5 см), смачивают ее в физиологическом растворе (0,15 М NaCI) с pH 7,4—7,6, отжимают и тщательно протирают ею исследуемую площадь в 100 см², переносят салфетку в колбу со 100 мл физиологического раствора, энергично встряхивают 5 мин, отжимают салфетку пинцетом и удаляют ее. Смыв фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, после чего центрифугируют 30 мин при 5000 об мин. Осадок рееуспеидируют в 1 мл дистиллированной воды. Если проба состоит из мелких объектов (трава, листья, ягоды н др.), то готовят навеску 200—300 г, делают нарезку из мелких листьев, помещают в колбу или шнрокогорлые банки, добавляют 200—300 мл физиологического раствора с pH 7,6, ставят на магнитную мешалку или энергично встряхивают 10—15 мин, отстаивают 10 мин, надосадок центрифугируют 30 мин при 5000 об/мин. Осадок ресус-пендируют в 1 мл дистиллированной воды. Для дальнейших работ пробы хранят при 4°С до 3 сут.

Площадь поверхности круглых плодов, например яблок, определяют по-формуле S=nr*, предварительно измерив диаметр яблок. Площадь поверхности листьев определяют следующим образом: обводят на бумаге контур листка, по крайним точкам контура строят прямоугольник и измеряют его

12S

площадь. Определяют массу прямоугольника и массу вырезанного контура. Из полученной пропорции вычисляют площадь листка.

Подготовка к определению. В настоящий момент антиполиэдренные сыворотки централизованно не изготавливают. Их можно получить у авторов методик, препарата. Кроме того, их можно заказать в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи. Для других лабораторий, рабо тающих с бакуловирусами, рекомендуется самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам, извлеченным из препарата вирин-КШ или из больных гусениц соответствующего вида. Очистку полиэдров ведут путем 3-крат-яого дифференциального центрифугирования при 300 об/мин 3 мин; 1000 об/мин 3 мин. Супернатант концентрируют 45 мин при 5000 об/мин н температуре 4°С. Осадок суспендируют в небольшом объеме дистиллированной воды. Дальнейшую очистку проводят в линейном градиенте плотности сахарозы. Наслаивают 60, 50, 40 н 20% концентрации, а сверху очищаемый материал в соотношении 1 : 10. Градиенты центрифугируют 30 мин при 2000 об/мин и температуре 4°С. Образовавшиеся зоны с очищенными полиэдрами отбирают пинеткой Пастера и 3-кратно отмывают в дистиллированной воде. Качество очистки контролируют в люминесцентном микроскопе. При необходимости очистку в градиентах плотности повторяют. За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500—10 000 ЕД стрептомицина и пенициллина, 20 мкг/мл 5-нитрооксихи-нолнна. Перед иммунизацией взвесь стерильно отмывают от антибиотиков, полиэдры ресуспендируют в стерильном растворе. Титр инокулята обычно 1-10® пдр/мл. Приготовленным антигеном иммунизируют беспородных кроликов массой 2,5—3 кг. Высокотитрованные сыворотки получают по следующей схеме иммунизации: 3-кратные с интервалом в 3 дня подкожные обкалывания с введением соответственно 2,0; 4,0, 6,0 мл антигена в смеси 1 : 1 адъюванта Фрейнда. Через 2 недели ренммунизация 6,0 мл смеси подкожно. Забор крови через неделю после реиммунизации.

Сыворотку хранят с консервантом (мертиолят 1 : 10 000) при —20 °С либо лиофилизируют. Высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет при температуре 4°С.

Ход анализа. Хорошо обезжиренное предметное стекло помешают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 см^г. Затем на стекло мнкропнпеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяют ее по отмеченной площади. Препарат (мазок) подсушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 15 мин. Для гашения неспецифического свечения используют синьку Эванса в разведении I : 10 000 дистиллированной водой. Время обработки синькой 10 мин. Препарат промывают проточной водой и подсушивают, после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем наносят иммунную сыворотку против полиэдров ВЯП-КШ, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают во влажную камеру на 20 мин при 37 °С, смывают проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего наносят меченную ФИТЦ ослиную сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают в термостате при 37 °С 20 мин во влажной камере с последующей промывкой в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентном микроскопе. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее масло, объектив 90, окуляр 8х. Полиэдры в препарате выявляются по специфическому яркому, желто-зеленому свечению нх ободков на общем красноватом фоне препарата.

Контроль: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сыворотки; препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров. В контрольных препаратах свечение полиэдров не выявляется.

Обработка результатов анализа. Кроме визуального (качественный анализ), можно провести количественный анализ, т. е. определить число поли*

126