МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МИКРОКОЛИЧЕСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

В ПРОДУКТАХ

ПИТАНИЯ,

КОРМАХ

ИВНЕШНЕЙ

СРЕДЕ

Том 2

МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МИКРОКОЛИЧЕСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

В ПРОДУКТАХ

ПИТАНИЯ,

КОРМАХ

И ВНЕШНЕЙ

СРЕДЕ

В ДВУХ ТОМАХ

Том 2

МОСКВА ВО «АГРОПРОМИЗДАТ» 1992

ском растворе. Избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь (100 см²). Затем салфетку переносят в колбочку с физиологическим раствором (100 мл), pH 7,4—7,6. Энергично встряхивают 5 мин, салфетку отжимают пинцетом и удаляют. Жидкость пропускают через фильтр Зейтца, как описано выше. Пробы отбирают в количестве ие меньше 6 в различных точках исследуемого участка. При исследовании мелких растительных объектов (трава, хвоя и др.) готовят навеску 200—300 г. Навески образцов переносят в широкогорлые банки, доливают 200—300 мл подщелоченной воды до pH 7,4—7,6, тщательно встряхивают 10—15 мин, после чего из полученного смыва удаляют растения, отстаивают 2—3 мин, надосадок пропускают через фильтр Зейтца и исследуют.

Отбор проб воздуха. Для отбора проб воздуха применяют аспирационные приборы, с помощью которых улавливают частицы аэрозоля. Метод основан на принципе прилипания их к поверхности предметного стекла или к поверхности аналитических фильтров. В первом случае к аспирационному прибору подключают однокаскадный десятищелевой импактор — простое приспособление, разработанное в КНИИЭИБ, позволяющее получить одновременно 10 отпечатков аэрозоля на одном предметном стекле. Во втором случае для получения отпечатков аэрозоля используют аналитические фильтры АФА-ВП-10 или АФА-В-18. Фильтры монтируются на фильтровальной воронке и затем подключаются к аспиратору. В этом случае получают по одному отпечатку на одном фильтре. Скорость отсоса воздуха 20 л/мин. Время отбора пробы 5 мин.

В исследуемых помещениях пробы отбирают в разных местах (5 точек коивертообразно) на уровне 150 см от пола в зоне дыхания людей; предметные стекла с отпечатками аэрозоля фиксируют в ацетоне 15 мин и хранят до момента исследования. Аналитические фильтры помещают на предметные стекла лицевой стороной вверх и обесцвечивают их в парах ацетона. Для этого стекла с фильтрами помещают в чашку Петри на две стеклянные палочки. На дно чашки наливают ацетон. После обесцвечивания (фильтр должен стать прозрачным) препараты можно хранить при 4°С до проведения исследования.

Ход анализа. Исследованию подвергаются мембранные фильтры, через которые были пропущены пробы воды, вытяжки из почвы или смывы с растительных объектов, а также отпечатки аэрозоля воздуха. Фильтр переносят на обезжиренное предметное стекло лицевой стороной (осадком) кверху. Стекло с фильтром помещают в чашку Петри на две стеклянные палочки. На фильтр пипеткой осторожно наливают ацетон. Фильтр обесцвечивается, и препарат фиксируется к стеклу. Препарат подсушивают до полного испарения ацетона (образовавшаяся пленка должна быть прозрачна) и проводят окрашивание. Для устранения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, водный раствор которой в разведении 1 : 10 000 наносят на препарат. Время обработки зависит от типа пробы и составляет от 1 до 15 мин. Препарат промывают в проточной воде, подсушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. На высушенный препарат наносят антиполнэдренную иммунную кроличью сыворотку, предварительно разведенную 1 : 10 физиологическим раствором. Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °С на 15—20 мин. Затем сыворотку смывают проточной водой 2 мин, препарат подсушивают па воздухе, после чего на препарат наносят ослиную антикроличью меченную ФИТЦ сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Снова выдерживают в термостате при 37 °С 15—20 мин с последующим промыванием в проточной воде.

После подсушивания препарат готов к просмотру. Просмотр можно проводить в любом люминесцентном микроскопе. Метод окраски позволяет выявить даже единичные полиэдры по их специфическому свечению. Обо-

133

док полиэдров имеет ярко-зеленое свечение на общем красноватом фоне препарата. Контрольные препараты, приготовленные тем же способом, специфического свечения не имеют.

Обработка результатов анализа. Число полиэдров в объеме исходной суспензии М (если число полиэдра в 1 м³ воздуха) рассчитывают по формуле

Q.S.-10'Ю

м= _sv

где а — среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки; S— площадь квадрата окулярной сетки (площадь поля зрения), мм²; Si — площадь мембранного фильтра, мм²; 10⁶ — переводной коэффициент; V — объем профильтрованной суспензии или объем пропущенного воздуха, л; 10 — переводной коэффициент на 1 и³ (учитывается только при анализе воздуха).

Для более точного подсчета полиэдров в квадрате окулярной сетки проводят подсчет по 32 квадратам на 3 различных участках фильтра при общем числе подсчитанных полиэдров не меньше 600. Затем вычисляют среднее арифметическое значение. Определение площади квадрата окулярной сетки описано выше.

Пример. Число полиэдров в 32 квадратах при первом подсчете составило 420, при втором 395, при третьем 427.

(4204-3954-427)

S=0,041 мм² —площадь поля зрения (определили по объект-микрометру); я/-²“3,14(17,5)^v=96l,6; К=500 мл.

13*961.6* 10* ,_АЯ ^М~ 0,041 -500    ^ПДР    ^мл

Требования безопасности. Препарат вирии-ЭНШ не токсичен и не ин-фекционен для человека о рекомендуемых нормах. При работе с ним соблюдаются меры безопасности такие, как при работе с малотоксичными веществами.

134

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1 НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Амиловый эфир уксусной кислоты, ТУ 6-09-1239—76.

4-Аминоантипирин, ТУ 6-09-3948—75.

Аммиак особой чистоты, ГОСТ 24147-82; водный, ГОСТ 3760-79.

Аммония молибдат, ГОСТ 3765-78.

Аммония персульфат, ГОСТ 20478-75.

Аммоний роданистый, ГОСТ 27067-86.

Аммоний сульфаминовой кислоты, ТУ 6-09-15-364—78.

Аммоний углекислый кислый, ГОСТ 3762-78.

Аммония хлорид. ГОСТ 3773-72.

Ангидрид уксусный, ГОСТ 5815-77.

Анилин солянокислый, ГОСТ 5822-78.

Аннокообмеииая смола АВ-17-8, ГОСТ 20301-74.

Ацетон, ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил. ТУ 6-09-3534—74.

Бария хлорид, ГОСТ 4108-72.

Бензиднн. ТУ 6-09 10-1310—78.

Бензол, ГОСТ 5955-75.

Бор трехфтористый, эфират, ТУ 6-09-804—77.

Бром, ГОСТ 4109-79.

Бромкрезоловый зеленый, ТУ 6-09-450-77.

Бромтнмоловый синий, ТУ 6-09-2045—77.

Бромфеноловый синий, ТУ 6-09-4530—77.

Бумага индикаторная универсальная, ТУ 6-09-1181—76.

Вазелиновое масло, ГОСТ 3164-78.

Висмута нитрат основной, ГОСТ 4110-75.

Водород газообразный, из баллона, ГОСТ 3022-80.

Воздух газообразный, из баллона, ГОСТ 9-010-80. и-Гексан, ТУ 6-09-3375—78. я-Геатан, ГОСТ 25828-83.

Гибберелин кристаллический, ТУ 64-3-103 —75.

Гидразин сульфат, ГОСТ 5841-74.

Гндрокснламин солянокислый, ГОСТ 5456-79.

Гипс медицинский, ГОСТ 3210-77.

Глицерин, ГОСТ 6824-76.

2,6-Двбром-М-хлорхныонимин, ТУ 6-09-05-63—73. л-Днметиламннобекзальдегид, ту 6-09-3272—77.

Д и метиле ульфоксид, ТУ 6-09-3818—74.

Диметилформамид, ГОСТ 20258-74 Е.

Дитизон, ГОСТ 10165-79.

Дифениламин, ГОСТ 5825-70.

Днэтнламин. ГОСТ 13279-67.

Диэткленглнколь, ГОСТ 10136-77.

Днэтиловый эфир фталевой кислоты. ТУ 6 09-3663—74.

Железо (III) хлорное, ГОСТ 4147-74.

Изооктан, ГОСТ 12433-83.

Индиго (динатриевая соль дисульфокислоты), ТУ 6 09-07-44—73. Индоксилацетат, ТУ 6-09-07-1156—78.

Индофенилацетат, ТУ 6-09-469—77.

Иод, ГОСТ 4159-79.

Йодистый метил, ГОСТ 6518-69.

Кадмия йодид, ГОСТ 8421-79.

Кадмий уксуснокислый, ГОСТ 5824-79.

Калия бромат, ГОСТ 4457-74.

Калия бромид, ГОСТ 4160-74.

Калия гидроксид, ГОСТ 24363-80.

Калий железистосинеродистый. ГОСТ 4207-75.

Калии железосииеродистый, ГОСТ 4206-75.

Калия иодид, ГОСТ 4232-74.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Калия роданид, ГОСТ 4139-75.

Калий фосфорнокислый, двузаметенный, трехводный. ГОСТ 2493-75 Калия фосфат однозаметенный. ГОСТ 4198-75.

Калий хлорноватокнслый, ГОСТ 2713-74.

Калий щавелевокислый, ГОСТ 5868-78.

Кальции сульфат. ГОСТ 3210-77.

Кальция хлорид, ГОСТ 4161-77.

Катиониты, ГОСТ 20298-74.

Кислота азотная особой чистоты, ГОСТ 11125—8ч.

Кислота аскорбиновая, ГОСТ 4815-76.

Кислота борная, ГОСТ 9656-75.

Кислота винная, ГОСТ 5817-77.

Кислота кремниевая, ГОСТ 1214-78.

Кислота лимонная, ГОСТ 908-79 Е.

Кислота муравьиная, ГОСТ 5848-73.

Кислота серная особой чистоты, ГОСТ 14262-78; х. ч.. ГОСТ 4204-77. Кислота сульфа и иловая, ГОСТ 5821-78.

Кислота тногликолевая, ТУ 6-09-3115—73.

Кислота трихлоруксусная, ТУ 6-09-1926—77.

Кислота уксусная особой чистоты. ГОСТ 18270-72; ледяная ч д а ГОСТ 61-75.

Кислота ^-фосфорная. ГОСТ 6552-80.

Кислота фосфорно-вольфрамовая, ГОСТ 18290“-72.

Кислота фосфорно-молибденовая. ТУ 6-09-3540—78.

Кислота хлороводородная х. ч., ГОСТ 3118-77; особой чистоты, ГОСТ 14261-77.

Кислота щавелевая, ГОСТ 22180 -76.

Крахмал водорастворимый, ГОСТ 10163-76.

Кремния диоксид для люминофоров, ТУ 6-09-3644—74 Ксилол, ТУ 6 09-3825-78.

Лантана нитрат, ТУ 6-09-4676—78.

Магния сульфат, ГОСТ 4523-77.

Магния хлорат, ГОСТ 10483-83 Е.

Меди нитрат, ТУ 6-09-3757—74.

Меди сульфат, ГОСТ 19347-84 Е.

Медь уксуснокислая, ГОСТ 5852-79.

Метиламин солянокислый, ТУ 6*09-2088—77.

Метиловый красный, ТУ 6-09-5169—84.

Метиловый оранжевый, ТУ 6-09-4530—77.

Мочевина, ГОСТ 6691-77.

Натрия нитрит, ГОСТ 4197-74.

Натрия нитрат, ГОСТ 4168-79.

327

Натрий вольфрамовокислый. ГОСТ 18289-78.

Натрия гидроксид х. ч.. ГОСТ 4328-77; очищенный. ГОСТ 11078-78. Натрия гндросульфат, ГОСТ 246-76.

Натрий двууглекислый. ГОСТ 83-79.

Натрия дитионат, ТУ 6-09 01-283—75.

Натриевая соль додецилсульфокислоты, ТУ 6-09 64—75.

Натрий лимоннокислый, ГОСТ 22280-76.

Натрия мета-бисульфит. ГОСТ 10575-76.

Натрия нитропруссид, ГОСТ 4218-78.

Натрия сульфат безводный, ГОСТ 4166-76.

Натрий серноватнстокислый, ГОСТ 27068-86.

Натрий тетраборокнслый, ГОСТ 4199-76.

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4201-79.

Натрий уксуснокислый, ГОСТ 18290-72.

Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77. а-Нафтила мин, ГОСТ 8827-74.

N-(1 -Нафтил)этилендиамик дигидрохлорид, ТУ 6-09-15-420—80. а-Нафтол, ГОСТ 5838-79. л-Нитроаннлин, ТУ 6-09-258—77.

4 (л-Нитробензил)пиридин, ТУ 6 09-15-93—74.

Нитрометан, ТУ 6-09-11-876—77.

Нингидрнн, ТУ 6-09-10-1384—79. л-Нитрофенол, МРТУ 6-09-3973—75.

Оксид алюминия для хроматографии, ГОСТ 8136-85.

Олово гранулированное. ТУ 6 09*2704—78.

Олово двуххлористос, ГОСТ 36-78.

Палладий двуххлористый, ТУ 6-09-2025—72.

Парафин. ТУ 6-09-3637—74.

Пенополиуретан эластичный. ТУ 6-05-1688—79.

Перекись водорода, ГОСТ 10929-76.

Пирокатехин фиолетовый, ТУ 6-09-07-1087—78.

Полидиэтиленгликоль сукцинат (ПДЭГС). ТУ 6-09-2827 —77.

Прочный голубой Б, ГОСТ 11263-80.

Прочный красный Б, ГОСТ 11827-77.

Резорцин, ГОСТ 9970-74.

Ртуть металлическая, ГОСТ 4658-73 Е.

Сахароза, ГОСТ 5833-75.

Свинец уксуснокислый, ГОСТ 1027-67.

Серебра нитрат, ГОСТ 1277-75.

Силикагель КСК для хроматографии, ГОСТ 3956-76 R.

Спирт амиловый, ТУ 6-09-3467—79.

Спирт м-бутнловый, ГОСТ 6006-78.

Спирт изопропиловый. ГОСТ 9805-84.

Спирт метиловый, ГОСТ 6995-77.

Спирт октиловый, ТУ 6-09-11-1055—78.

Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5962-67.

Судан, ТУ 6-09-4124-75.

Тальк очищенный, ГОСТ 19729-74.

Тетраэтилеипентамии. ТУ 6-09-05-804—78.

Титана сульфат, ТУ 6 09-01-477—77.

Титан трех хлористый, ГОСТ 311-78. о-Тол и дин, ТУ 6 09-2232—75.

0-Толундин, ТУ 6-09*2992—73.

Толуол. ГОСТ 5789-78 Трилон-Б, ГОСТ 10652-73.

Трнфторуксусный ангидрид. ТУ 6-09-4135—75.

2,2,2-Трихлорэтанол. ТУ 6-09-11-719—76.

328

Углерод четырехх лорнеты ft, ГОСТ 20288-74.

Уголь активированный АГ-3, АГ-5, ГОСТ 20464-75. Уголь активированный БАУ, ТУ 6 09-3247—73.

Уголь активированный КАД, МРТУ 6-09-1049—64. Уголь активированный ОУ-А, МРТУ 6-09-1049—64. 2-Феноксиэтаиол, ТУ 6-09-13-493—76.

Фенолфталеин, ГОСТ 5850-72.

Фильтры бумажные, ТУ 6-09-1678—77.

Хлористый метилен. ГОСТ 12794-80.

Хлороформ, ГОСТ 20015-74.

Циклогексан, ТУ 6-09-06-452—76.

Пинк гранулированный. ГОСТ 989-75. Цнпк-дитиол, ТУ 6-09-05-142—79.

Цинковая пыль, ГОСТ 12601-76.

Цинка сульфат, ГОСТ 4529-78.

Цинка хлорид, ГОСТ 4529-78.

Этнлаиетат, ГОСТ 22300 - 76.

Этиленгликоль, ГОСТ 10164-75.

Этпленднамин дигидрохлорнд, ТУ 6 09-10-645—77. Эфир диэтнловый, ГОСТ 6265-74.

Эфир петролейный. ТУ МХП-1867—48.

Приложение 2 НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА ПОСУДУ ЛАБОРАТОРНУЮ

Посуда мерная лабораторная стеклянная (цилиндры, мензурки, мерные колбы, градуированные пробирки), ГОСТ 1770-74 Е.

Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые, ГОСТ 9147-80 Е.

Посуда и аппаратура лабораторная стеклянная. Шлифы сферические н взаимозаменяемые (вся химическая посуда на нормальных шлифах: круглодонные, плоскодонные, грушевидные колбы, колбы Эрленмейера, холодильники. двугорлые колбы, аллонжи, дефлегматоры и т. д.), ГОСЛГ 9737—70.

Приборы мерные лабораторные стеклянные (бюретки, пипетки), ГОСТ 20292-74 Е.

Пикнометры стеклянные, ГОСТ 22524-74 Е.

Посуда н оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры (воронки делительные, эксикаторы, камеры хроматографические, водоструйные насосы, стаканы стеклянные, пульверизаторы, бюк-сы, колбы, воронки Шотта и т. д.), ГОСТ 25336-82 Е.

Приложение 3

НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ НА ПРИБОРЫ И АППАРАТУРУ

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081—73 или аналогичный.

Аспирационное устройство, ТУ 64-1862—77.

Баня водяная, ТУ 64-1*2850—76.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19491-74.

Весы аналитические лабораторные, ТУ 64-1-1065—73.

Генератор водорода.

329

Г л а в a 13. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ*

Б соответствии с уставом Международного общества биологической борьбы, принятым в 1971 г., биологическая борьба в сельском и лесном хозяйствах определяется как использование живых существ и продуктов их жизнедеятельности для предотвращения или снижения ущерба, причиняемого вредными организмами. Сформировалось 3 направления биологической борьбы:

использование полезных видов насекомых для борьбы с вредными насекомыми (насекомые-энтомофаги) и сорняками (насекомые-фитофаги); применение в борьбе с вредителями и возбудителями болезней растений препаратов на основе микроорганизмов и продуктов нх жизнедеятельности (биопрепараты);

использование биологически активных веществ, синтезируемых насекомыми, или их химических аналогов (феромоны и гормоны насекомых).

Все 3 направления, используя те или иные средства, предусматривают снижение численности вредного вида до экономически безопасного уровня. Они нс рассчитаны на его полное истребление. Это позволяет сохранять существующие в природе связи между видами, т. е. предполагает экологическую безопасность.

Вместе с тем с применением в качестве действующих начал микроорганизмов, способных к размножению, а также использованием биологически активных веществ микробного синтеза либо веществ, синтезируемых насекомыми, необходимо предусматривать гигиеническую оценку рекомендуемых средств — изучение возможных отрицательных эффектов, возникающих при производстве и применении биологических средств защиты растений, в том числе возможное негативное влияние на здоровье населения. Такое исследование не может быть выполнено без определения действующих начал биологических средств в окружающей среде, позволяющего оценить реальные уровни загрязнения и наметить меры по его предупреждению. Наибольшую потенциальную опасность с позиций биологического загрязнения среды представляют собой биопрепараты, а также гормоны и феромоны насекомых, что нашло отражение в разработке методов определения биологических средств защиты растений.

Применение в защите растений полезных видов насекомых предусматривает использование хищных насекомых и насскомых-паразптов. Паразитических и хищных насекомых обычно называют энтомофагами. Насекомых, питающихся сорной растительностью, называют фитофагами. Все приемы борьбы с вредными организмами с помощью энтомофагов и фитофагов безопасны для окружающей среды и нецелевых видов, включая человека.

Использование биопрепаратов сопровождается внесением в окружающую среду различного рода микроорганизмов, способных к размножению. По-

Раздел подготовлен Е. А. Мельниковой (ВНИИГИНТОКС).

107

скольку условия применения биопрепаратов такие же, как химических лести-цидов, они могут загрязнять объекты окружающей среды остаточными количествами, что представляет опасность для нецелевых видов. Чтобы определить потенциальную опасность использования биопрепаратов, необходимо знать их характерные особенности.

Микробиологический метод защиты растений предусматривает использование микроорганизмов, вызывающих заболевания среди вредных членистоногих (вирусы, бактерии, грибы и др.), антибиотиков и токсинов фунгицидного действия, микробов — антагонистов возбудителей фитоинфекций.

По назначению биопрепараты используются в качестве инсектицидов, фунгицидов и родентицидов. Товарные формы биопрепаратов имеют вид смачивающихся и сухих порошков, паст, суспензий. В зависимости от качества действующих начал различают вирусные, бактериальные, грибные, токсин- и антибиотиксодержащие препараты.

Вирусные инсектициды создают на основе энтомопатогенных вирусов, вызывающих у восприимчивых насекомых инфекционную болезнь и последующую гибель. Вирусы насекомых принадлежат в основном к семейству б&куловирусов, особенность которых — способность к образованию внутри пораженной клетки кристаллических белковых включений в виде полиэдров или гранул. Внутри полиэдров и гранул содержатся собственно вирусные частицы — вырионы.

При попадании с кормом в кишечник чувствительного насекомого белковая оболочка полиэдров и гранул растворяется, и вирусные частицы проникают в ткани насекомого, вызывая заболевание и гибель.

Вирусные инсектициды высоко специфичны. Они патогенны обычно для одного вида вредителей. В настоящее время созданы вирусные биопрепараты против американской белой бабочки, капустной, хлопковой и озимой совок, рыжего соснового пилильщика, непарного шелкопряда и ряда других вредителей сельскохозяйственных культур и лесных насаждений.

Учитывая особую роль вирусов в патологии биологических видов, исследования по оценке безопасности вирусных инсектицидов проводят особенно тщательно. В опытах на различных моделях выясняют, в какой мере энтомопатогенные вирусы способны развиваться в клетках теплокровных животных, могут ли они проявлять инфекционно-токсическое или аллергическое действие, а также способны ли они оказывать отдаленный эффект (эмбриотоксическое, канцерогенное, тератогенное действие). К настоящему времени исследования по безопасности проведены более чем на 50 энтомо-патогенных вирусах и 20 видах позвоночных, в том числе на млекопитающих, включая человека.

Ни в одном из проведенных опытов не было получено данных, подтверждающих опасность энтомопатогенных вирусов для нецелевых видов.

Большинство бактериальных препаратов для защиты растений во всех странах производят на основе энтомопатогенных бацилл турингиензис. Они отличаются друг от друга содержанием в качестве действующего начала различных штаммов бацилл турингиензис, выделенных от больных насекомых в разных географических зонах. В СССР это препараты гомелин. дендроба-циллин, битоксибациллин, бактокулицид, лепидоцид, инсектнн, ВИП, энто-бактерии.

Заражение здорового насекомого происходит через загрязненный спорами бацилл растительный корм. Попадая в кишечник, споры прорастают в вегетативные клетки, в которых, в свою очередь, в процессе созревания образуется спора и формируются кристаллы эндотоксинов. Далее споры проникают в гемолимфу (кровь) насекомого, прорастают и вызывают септицемию и гибель насекомого. Важное место в патогенезе инфекции имеет эндотоксин. который вызывает распад клеток эндотелия кишечника и его паралич. Некоторые разновидности бацилл турингиензис образует также экзотоксин, который оказывает на насекомых овоцидное и тератогенное действие.

168

В последние годы ведется работа по испытанию других бактерий для •борьбы с вредными насекомыми. Так, испытываются псевдомонады и бацнл-•лы субтилис. На основе бактерий рода сальмонелла разработан и выпускается промышленностью бактороденцид, зерновой и аминокостный препараты для борьбы с мышами-полевками.

Исследования возможного патогенного действия бацилл турингиензнс л отношении теплокровных животных проводились с первых лет производства и испытания биопрепаратов как за рубежом, так и в нашей стране. В настоящее время действие бацилл турингиензнс испытано на 10 видах млекопитающих, 7 видах птиц н на 5 видах рыб. Во всех опытах бациллы турингиензнс не вызывали развития инфекционного заболевания и не размножались в нецелевых видах. После введения культур кристаллоспорообразующих бацилл турингиензнс млекопитающим и птицам исследователи обнаруживали споры микроорганизма в органах животных в течение 5—14 сут после воздействия. При этом каких-либо признаков заболевания и морфологических изменений в органах не обнаружено.

Товарные формы биопрепаратов этой группы практически нетоксичны для млекопитающих, но при длительном поступлении в организм через органы дыхания могут вызвать развитие явлений аллергии. Многие серотипы бацилл турингиензнс продуцируют термостабильный экзотоксин, который у чувствительных насекомых вызывает тератогенный эффект. В опытах с биопрепаратами, содержащими небольшое количество экзотоксина (до 2%), тератогенного действия на теплокровных животных не выявлено.

Среди возбудителей болезней насекомых важную роль играют микроскопические грибы. Заражение насекомых грибами происходит как через желудочно-кишечный тракт, так и через кожные покровы. Патогенное действие грибных инсектицидов обусловлено механическим повреждением тела вредителя прорастающими спорами и мицелием гриба, а также воздействием образуемых грибом токсинов. Токсические продукты жизнедеятельности микроскопических грибов способны также оказывать последействие, снижая плодовитость самок или вызывая развитие уродливых особей в поколении вредителя. Для борьбы с вредными насекомыми используют грибы боверия Зассиана (бовернн), энтомофтора (микоафидин и энтомофторин), вертнцил* лнум, ашсрсония, пецмломицее фаринозус (пецнломин).

Изучение безопасности энтомопатогенных грибов проведено на 4 видах лабораторных животных и куриных эмбрионах. Изучалось действие спор грибов и токсинов, содержащихся в культуральной жидкости при выращивании грибов на жидких питательных средах. Действующие начала н товарные формы грибных препаратов вводили в желудок н иетрапернтонеаль-«о. Ни в одном опыте не было получено результатов, свидетельствующих о патогенном действии грибов на теплокровных. Товарные формы биопрепаратов на основе грибов оказались практически нетоксичными для животных. В опытах на животных и в условиях производства установлено их аллергенное действие.

В биологической борьбе с болезнями культурных растений используют явление антагонизма между разными видами микрофлоры. В основе его лежит способность отдельных видов микрофлоры образовывать и выделять в окружающую среду токсичные для других видов микроорганизмов вещества (антибиотики). Их используют для предупреждения и лечения ряда вирусных, бактериальных и грибных болезней растений. Биопрепаратом, содержащим микробы-антагонисты или химически очищенные антибиотики, обрабатывают семенной материал перед посадкой или вносят его в почву.

Для борьбы с болезнями растений предложены препараты на основе разных штаммов псевдомонад (миколитин, изип, гаукенн и др.) н на основе грибов (триходермнн), а также антибиотики фитобактериомицин и трнхоте-цин. Все биопрепараты на основе бактерий или грибов, предложенные для защиты растений от возбудителей болезней, практически безопасны для теп-

109

.покровных организмов: культуры микроорганизмов не размножаются в организме млекопитающих и не образуют выраженных токсинов. Товарные формы биопрепаратов практически нетоксичны для теплокровных. Антибиотики трихотецин и фитобактериомицин производят промышленным способом. За рубежом, кроме антибиотиков, специально предназначенных для защиты растении (казумин, бластцидин, полиоксин и др.), используют и медицинские антибиотики (хлортетрациклин, стрептомицин и др.).

Токсикологические свойства антибиотиков, применяемых для борьбы с болезнями растений, зависят от их химических свойств и очень разнообразны. Так, трихотецин, изокротиловый эфир кетоспирта трихотеколона, принадлежит к среднетоксичным веществам. Он не кумулятивен и не аллергенен, но в больших концентрациях раздражает кожу и слизистые оболочки. Фитобактериомицин, стрептотриции сложного состава, более токсичен, особенно при поступлении через органы дыхания. Фитобактернмицин — выраженный аллерген, высококумулятивен, способен раздражать кожу и слизистые оболочки. В связи с относительно высокой токсичностью антибиотики применяют в основном путем обработки семян или посадочного материала.

В последние годы получают применение новые методы биологической борьбы с вредителями, основанные на использовании феромонов и гормонов насекомых. В природных условиях каждая особь насекомых вырабатывает и выделяет во внешнюю среду вещества, способствующие коммуникации между видами. Это феромоны. Лучше других изучены половые феромоны, которые используются насекомыми для встречи насекомых разного пола. Вырабатываются феромоны, обеспечивающие колонизацию вида (агрегацнонные феромоны), выполняющие роль аттрактантов или репеллентов, и др.

Ныне идентифицированы феромоны более чем для 700 видов насекомых. Многие из них синтезированы химиками и испытываются в защите растений. В СССР к 1983 г. были синтезированы феромоны более чем для 40 видов, в том числе для таких вредителей, как плодожорки, совки, листовертки, короеды, щелкуны и др.

Феромоны применяют в испарителях, которые либо помешают ь ловушки, либо рассеивают над полем с помощью авиации. Нормы расхода феромонов чрезвычайно малы (от 5—6 до 250 мг/га).

В последнее время для борьбы с вредными насекомыми стали применять гормоны насекомых, объединяемые общим понятием ювенильные гормоны (ЮГ), или синтетические аналоги гормонов (АЮГ),— вещества, химически не сходные с природными гормонами, но проявляющие гормоноподобное действие и нарушающие, как и гормоны, процессы развития и метаморфоза насекомых. Ныне синтезировано более 2000 АЮГ. Гормональные препараты используют для обработки вегетирующих культур, нормы их расхода приближаются к нормам расхода пестицидов.

Считается, что феромоны и гормоны обладают высокой избирательностью действия. Эти вещества проявляют активность в очень небольших количествах и привлекают насекомых с очень больших расстояний.

Все изученные феромоны и гормоны насекомых оказались малотокснчны-ми соединениями. Сейчас выясняют, могут ли они проявлять другие отрицательные свойства, в частности влиять на эндокринную систему теплокровных Опыты проводят на животных.

Таким образом, биологические средства защиты растений в большинстве своем — часть природных биоценозов. Однако антропогенный способ их получения и использование Не всегда может гарантировать полную их безвредность. Это обусловливает необходимость изучения поведения вновь рекомендуемых средств во внешней среде, для чего требуется разработка методов их определения.

Утверждено 27.09.78 Л» 1921 —78>

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОЛИЭДРОВ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ,

НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ И В ВОЗДУХЕ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ¹

Краткая характеристика препарата. Вирнн-ЭНШ — вирусный энтомопа-тогеныый препарат — вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами непарного шелкопряда в лесах, садах, парках. Действующее начало препарата — полиэдры экспериментального штамма вируса ядерного по-лнэдроза, относящегося к группе бакуловнрусов. Препарат — суспензия полиэдров в 50%-ном глицерине. Применяется методом авиа- или тракторного распыления.

Препарат вирнн-ЭНШ и его активное начало не токсичны и не вызыва-ют инфекционных заболеваний людей, домашннх или диких животных. В эксперименте показано, что вирин-ЭНЩ —слабый аллерген. ПДК в воде рыбохозяйственных водоемов 1 мг/л.

Принцип метода. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется в виде специфического свечения при наблюдении в люминесцентном микроскопе — ярко-зеленое свечение ободка полиэдров.

Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно определить количество полиэдров в диапазоне от 0,5* 10^г до 10¹¹ полиэдров в 1 мл субстрата. Метод высокочувствительный и специфический. Способен дифференцировать различные виды полиэдров. Чувствительность метода в большой степени зависит от качества приготовленных гнпернммунных сывороток

Реактивы и материалы. Ацетон. Физиологический раствор (0,85%-ный NaCI), pH 7.1—7,5. Этиловый спирт. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сахароза. Мертиолят. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин)

Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовляемая в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи), специфическая антииолнэдренная кроличья сыворотка.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Сетка для подсчета полиэдров. Объект-микрометр. Камера Горяева. Центрифуга (до 5000 об/мин). Термостат (37°С). рп-Метр. Мембранные фильтры АФА-ВН-10. Электроаспнратор. Батометр. Пробирки. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские. Цилиндры стеклянные.

Подготовка к определению. При отсутствии централизованного изготовления специфических иммунных антиполиэдреыыых сывороток основная подготовительная работа сводится к приготовлению этих сывороток в лабораторных условиях.

Иммунную антиполнэдренную сыворотку получают путем внутривенной иммунизации кроликов суспензией очищенных полиэдров с титром IX

XI0* ндр/мл.

Полиэдры извлекают из препарата внрин-ЭНШ следующим образом. Проводят 3-кратный отмыв 100 мл препарата от глицерина физиологическим раствором при 5000 об/мин в течение 20 мин. Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 300 об/мин для осаждения крупных частиц тканей насекомых в течение 3 мин. Супернатант осторожно отсасывают пипеткой н центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин для осаждения полиэдров. Осадок ресуснендируют в физиологическом растворе и диспергируют на магнитной мешалке 10—15 мин. Дальнейшую очистку ведут в градиенте плотности 20, 30, 40, 50% сахарозы. Чистые полиэдры задерживаются на границе 40% и 50% сахарозы. Отбирают пипеткой этот слой и отмывают полиэдры от сахарозы путем 5-кратного разбавления физиологическим раствором с последующим центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. Отмывание проводят 3 раза. Полученный осадок ресуснендируют в 10 мл физиологическом растворе. Титр определяют в камере Горяева. Рабочее разведение для иммунизации 1 - Ю⁹ пдр/мл.

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500—1000 ед. пенициллина и стрептомицина, 20 ед. нистатина на 1 мл взвеси.

Перед иммунизацией взвесь стерильно отмывают от антибиотиков и ре-суспепднруют стерильным физиологическим раствором, инъекции проводят трижды с недельным интервалом по 1—2—2 мл. Реиммунизацня через б недель— одна инъекция 2,5 мл внутривенно. Взятие кровн через 2 недели после реиммунизации. Сыворотку желательно лнофилнзнровать или хранить с добавлением консерванта (мертиолята 1:10000) при температуре 20°С.

Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры.

131

Для подсчета полиэдров в исследуемом объеме необходимо определить площадь квадрата окулярной сетки (S). Ее определяют с помощью объект-микрометра, который помещают на предметный столик микроскопа вместо препарата и при используемом дли подсчета полиэдров увеличении определяют сторону квадрата сетки. При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения (D) и вычисляют площадь по формуле

S=яг².

Отбор проб воды. Для санитарно-гигиенического контроля воды открытых водоемов на наличие загрязнения препаратом внрни-ЭНШ изучается как вода, так и донные отложения. Выбор объектов исследования, частота в сроки отбора определяются целями исследований. При исследовании неглубоких водоемов до 5 м можно ограничиться взятием воды на глубине 2,5 м. Для глубоких водоемов поверхностную пробу берут на глубине 10—15 см.

Пробы воды 0,5 л отбирают в стеклянные бутылки, используя батометр, который обычно применяют для взятия проб санитарно-гигиенического контроля.

Пробы донных отложений массой 100—200 г отбирают при помощи различных дночерпателей. Пробы переносят в стерильные банки, иаклеизают этикетки с указанием места и даты отбора. Общее число проб не менее 6.

После доставки в лабораторию пробы воды можно хранить в холодильнике не более 6 сут, а лучше исследовать сразу. Пробы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, а затем пропускают через фильтр Зейтца с мембранным фильтром № 2 или 3 с помощью вакуумного насоса. По окончании фильтрации фильтр подсушивают на фильтровальной бумаге. Его можно хранить до анализа длительное время в чашках Петри при температуре 4 °С.

Из осадков донных отложений готовят 10%-ную взвесь на воде, тщательно перемешивают, подщелачивают NaOH до pH 7,4—7,6, встряхивают 10 мин. Надосадочиую жидкость исследуют так же, как и пробы воды.

Отбор проб почвы. Для отбора проб почвы можно использовать стерильные банки ыа 0,5 л, закрытые пластмассовыми крышками, стерильные целлофановые или бумажные мешки, помещенные в матерчатые или клеенчатые пакеты. Для отбора поверхностных проб почвы используют совок, нож, ложку. Участки для отбора проб выбирают по показаниям в зависимости от целей исследований, но не более 20 см от поверхности, так как в естественных условиях микроорганизмы хорошо адсорбируются в верхних слоях. На каждом избранном участке берут пробы в 5 точках конверто-образно. Снимают поверхностный слой глубиной 1—2 см с площади около 100 см^а массой по 100—150 г. Из 5 проб, отобранных на участке, готовят один образец, который помещают в стерильную тару. Пробу маркируют— ставят дату, указывают место отбора и другие дополнительные сведения. Пробы доставляют в лабораторию. Они могут храниться при температуре 4°С несколько суток.

В лаборатории почву высыпают на бумагу, освобождают от примесей (щебень, камни и др.), большие комки измельчают шпателем. Образец перемешивают, берут иавеску 30 г, переносят во флакон с бусами, куда добавляют 470 мл подщелоченной воды до pH 7,4—7,6. Полученную взвесь энергично встряхивают 10—15 мин. Отстаивают и через 15—20 мин надоса-дочную жидкость пропускают через фильтр Зейтца с мембранным фильтром № 2 или 3 н хранят, как описано выше.

Отбор проб с поверхности растительных объектов. Для взятия проб с поверхности растительных объектов (листья, плоды и т. д.) методом смыва используют заготовленные заранее марлевые салфетки размером 5x5 см. Пинцетом берут салфетку, смачивают в стерильном фнзнологнче-

132

1

Разработали В. Л. Васильева, А. Л. Гураль, М. А. Дячеико, В. И. Трусов (КНИИЭИБ).

130