.МИНИСТЕРСТВО сельского ХОЗЯЙСТВА СССР

ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ (с Государственной вс!ерииариой инспекцией)

ho бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров

I. Общая часть

1.1.    Настоящие Методические указания определяют методы и сроки исследования молока и секрета вымени коров; являются обязательным минимумом для ветеринарных лабораторий и диагностических отделов НИВС и НЯВИ при диагностике мастита коров.

1.2.    Приведенный в настоящих Указаниях набор питательных сред, применяемых при бактериологическом исследовании, является минимальным; сроки для каждого исследования (сообщения их результатов и заключений) считаются предельными.

1.3.    Исследования молока (секрета) коров в ветеринарных лабораториях выполняют в порядке его поступления.

В целях равномерной загрузки лабораторий массовые исследования на мастит проводят по соответствующему календарному плану, согласованному с главным ветеринарным врачом района.

1.4.    О результатах исследования лаборатории должны сообщить организациям, учреждениям, хозяйствам и предприятиям, приславшим материал, не позднее, чем в сроки, установленные настоящими указаниями.

В заключении указывается название возбудителя, его чувствительность к антибиотикам и рекомендации по лечению. В необходимых случаях дают указания о присылке материала для дополнительного исследования.

L

2. специальная часть

2.1.    Правила отбора проб молока (секрета)

2.1.1.    Отбор проб молока сборного и подготовку его к исследованию проводят по ГОСТ 3622-68 и ГОСТ 13928-68.

2.1.2.    для бактериологического исследования молока на мастит отбирают пробы из четвертей вымени, реагирующих на быстрый маститный тест - мастидин или димастин и дающих положительную пробу отстаивания.

Пробы отбирает ветеринарная служба хозяйства один раз в месяц в период лактации и по мере запуска коров.

2.1.3.    Молоко (секрет) для бактериологического исследования на мастит отбирают из четверти вымени с соблюдением правил асептики, для этого перед взятием пробы молока соски вымени коров и руки дояров протирают ватным тампоном, смоченным 70# спиртом (этиловым или денатурированным), и отбирают в конце дойки 5-10 мл альвеолярного молока. При взятии пробы следят за тем, чтобы сосок не касался края пробирки. При повторном взятии пробы с целью подтверждения диагноза на мастит могут быть использованы как цистернальное, так и альвеолярное молоко.

2 .1.4. Для выявления бактерионосителей среди животных, предназначенных для комплектования стада фермы и комплексов, отбирают пробы цистернального молока после сдаивания первых 2-3 струек.

2 .2. Правила доставки проб

2 .2.1. Пробы молока после их отбора доставляют в лабораторию так, чтобы оно не смачивало пробки. Доставка должна осуществляться в течение 3-4 часов с момента взятия проб в специальных емкостях, обеспечивающих температуру не выше 8-10°J, или в термосах со льдом.

2. 3. Проведение исследований секрета на наличие возбудителей мастита

2.3.1.    Пробы молока на наличие возбудителей мастита исследуют сразу после доставки их в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°3.

2.3.2.    Посев молока проводят на МПА с Ъ% нитратной крови крупного рогатого скота (рецепт I) и на дифференциально-диагностические среды с целью выделения золотистого стафилококка,

шивание питательных сред. Имеются отдельные виды синегнойной палочки, которые не вырабатывают пиоционин.

не всегда активно вырабатывает пигмент. Пигментообразование мокко наблюдать лишь на 2-3 сутки. Поэтому посевы на МНЕ и МПА следует дополнительно просматривать через 48-72 часа. Сине-зеленое окрашивание МПБ лучше проявляется, если пробирку с ШБ встряхнуть и обеспечить доступ кислорода.

Из МПБ и МПА делают мазки и окрашивают их по Граму.

представляет собой короткую,

тонкую грамотрицательную палочку.

При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и изменение цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина. Для этого в пробирку с МПБ добавляют I мл хлороформа, пробирку встряхивают, хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно.

У пигментообразующих сапрофитных бактерий в хлороформе пигмент не растворяется.

Принадлежность выделенной культуры к ^ №с^:4-&ч?.*<ъ подтверждают следующими признаками. Синегнойная палочка может расти при температуре от +15 до +43°С, способна расти при пересеве в физиологическом растворе, вызывает гидролиз желатины, свертывание молока, не растет на среде Китт-1ароцци, не ферментирует углеводы за исключением глюкозы, индол не образует, выделяет аммиак, гидролизует мочевину. Реакция на каталазу - положительная.

Срок лабораторного исследования - 3 дня.

2.3.12. Выделение и идентификация грибов рода

Из доставленных в лабораторию проб молока делают высевы по 0,1-Э,3 мл на чашки Петри со средой (рецепт 14). Посевы делают на 2 чашки Петри. Высеянный материал равномерно, не повреждая среды, растирают по всей поверхности ее стерильным шпателем, делая круговое движение.

Засеянные чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 37°0 на 18-20 часов.

Контролем служит посев культуры этого гриба на ту же самую элективную дифференциально-диагностическую среду.

После инкубации чашки Петри просматривают и проводят второй этап микологического исследования. Аля чего проводят микроскопию окрашенных препаратов по Граму или другим методом для проверки

чнототы культуры и изучения морфологии, а также пересев из коло-ней в пробирки на ту же самую среду для ввделения чистой культуры и выявления псевдомицелия. Чашки Петри с выросшими культурами оставляют далее при комнатной температуре. Засеянные пробирки выдерживают при 37°С 24 часа, затем оставляют на 2 суток при ком-■атной температуре (18-22°0). После этого выросшие колонии микро-скопируют.

Первичный учет результатов делают через 20 часов инкубации материала, а окончательный учет— на 4-й день исследования

Для идентификации грибов до рода достаточно определения поевдомицелия. В большинстве случаев псевдомицелий на элективной дифференш1ально-диагностической среде определяет через 20 часов путем микроскопии окрашенных препаратов, а когда это не удается, ка 4 день исследования. Кроме псевдомицелия обнаруживают почкующиеся клетки (споры, истинный мицелий, а иногда и хламидоспоры).

Колонии грибов рода    гладкие,    морщинистые,

плоские, беловато-серые, кремо-беловатые, кремовые, мягкой консистенции, кожистые.

Срок лабораторного исследования - 4 дня.

2*3.13. Определение чувствительности выделяемых микроорганизмов к антибиотикам.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам должны быть использованы:

-    МПА или агар Хоттингера-рецепт 1о (для стафилококков, кишечной палочки, псевдомонад);

- сывороточный МПА-рецепт    10 (для стрептококков).

Добавление сыворотки обеспечивает рост стрептококков

Сыворотку вносят в расплавленный и охлажденный

до 37°0 МПА.

Среду разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности.

Выделенные культуры выращивают на одной из указанных сред, смывают стерильным физиологическим раствором и готовят бактери -ольную взвесь с концентрацией I млрд микробных тел в I мл. Это соответствует 10 ед. по оптическому стандарту.

На поверхность среды наливают I мл взвеси культуры, орошают ею всю поверхность. Наклонив чашку, излишек культуры отсасывают пастеровской пипеткой. Чашки с посевами подсушивают при комнатной температуре в течение 40 минут, после чего на поверхность засеянной среды накладывают диски с антибиотиками.

Диски раскладывают стерильным пинцетом на расстоянии 2 см от края чашки и слегка прижимают к агару. Каждая чашка может служить для испытания 5-6 видов антибиотиков.

Для лучшей диффузии антибиотика в агар чашки с засеянной культурой и разложеиными дисками выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре, затем помещают в термостат при температуре 37°0 вверх дном.

Результаты учитывают через 16-18 часов, для чего определяют линейкой диаметр зоны задержки роста микробов вокруг бумажных дисков, включая и размер дисков.

Отсутствие зоны задержки роста микробов вокруг диска указывают на то, что испытуемая культура не чувствительна к данно-му виду антибиотика.

2.2.14. Ускоренный (пробирочный) метод определения чустви-тельности микрофлоры молока к антибиотикам (метод ориентировочный, без выделения микроорганизмов).

Исследуемое молоко с соблюдением стерильных условий разливают по 2 мл в стерильные пробирки. Пробирок должно быть на две больше, чем дисков с антибиотиками.

В одной из пробирок определяют реакцию (pH) молока, добавляя в него 0,1 мл 0,5^-ного спиртово-водного раствора индикатора (0,5 г бромтимолблау растворяют в начале в 50 мл спирта, затем доливают 5-0 мл дистиллированной воды. В зависимости от pH молока смесь окрашивается от желтого, оалатовогс^ зеленого (кислое молоко) до синего цвета (щелочное молоко). Записав результат (цвет смеси), данную пробу исключают из опыта. В оставшиеся пробирки (кроме одной) добавляют по одному диску различных антибиотиков.

Все пробирки с молоком выдерживают при 3?Ябв течение 18-20 часов в термостате или автоматически регулируемой водяной бане, после чего во всех пробирках проверяют кислотность молока раствором бромтимолблау.

Вели кислотность молока в пробирке без антибиотиков до опыта и после выдерживания в течение 18-20 часов в термостате одинакова, значит бактерий в молоке нет. При наличии микрофлоры кислотность молока в пробирке без антибиотиков после выдерживания в термостате увеличивается. В этом случае проверяется кислотность молока в пробирках с антибиотиками.

Если кислотность молока с тем или иным антибиотиком (после выдерживания в термостате) не выше первоначальной (до выдерживания в термостате), значит, бактерии, находящиеся в молоке, высокочувствительны к данному антибиотику. Если кислотность молока в пробирках с антибиотиками после выдерживания в термостате увеличивается, значит находящиеся в молоке бактерии устойчивы к данному антибиотику и причем выше кислотность молока, тем устойчивее микроорганизмы к антибиотику.

2.3.15. Определение количества соматических клеток в молоке.

2.3.15.1. Подсчет с помощью электронных счетчиков ("Культер", целло-окоп, "'йоссоматик").

2.3.15.2. Камерный метод.

для подсчета соматических клеток в молоке используют счетную камеру *укса-Розенталя. При отсутствии ее можно использовать камеру Горяева, Тома, Предтеченского, Ьюркера.

Для растворения жировых шариков, в молоко добавляют солюбилизирующий раствор, который готовят в следующем порядке, Оинтанол ДС-13 расплавляют в водяной бане, отмеривают в колбу I мл, смешивают с 12,5 мл этилового спирта, добавляют I мл формальдегида и доливают 0,9^-ным раствором хлористого натрия до 100 мл. Полученный солюбилизирующий раствор прогревают при бО^Св течение 20 минут, после чего добавляют I мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. В связи с тем, что при длительном хранении краситель выпадает из раствора в осадок, его добавляют к солюбилизирующему раствору непосредственно перед применением, а солюбилизирующий раствор в герметическом сосуде сохраняется длительное время.

Для подсчета клеток в пробирки, содержащие 4,9 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл молока, тщательно перемешивают и прогревают 30 минут на водяной бане при 80^ После перемешивания каплю жидкости вносят под притертое покровное стекло счетной камеры.

Подсчет клеток ведут под микроскопом при объективе Юх-20х.

В поле зрения на прозрачном фоне видны четко окрашенные клетки, легко поддающиеся подсчету. Если при этом выявлено повышенное содержание соматических клеток в сборном молоке (от 500 тыс ./мл до I млн. и более), то всех лактирующих коров стада исследуют на мастит по общепринятой схеме.

Подсчет клеток с помощью камеры £укса-Розенталя проводят на площади всей камеры. Полученное количество клеток в камере умножают на коэффициент 15625, что соответствует количеству соматических клеток в I мл молока. При использовании камеры Горяева подсчет соматических клеток ведут в 100 больших квадратах. В этом случае полученное количество клеток умножают на коэффициент 125000.

2.3.15.3. Метод Прескота и Брида.

Чистое предметное стекло кладут на лист бумаги, расчерченный на квадраты, сторона квадрата I см. Пробу молока (секрета) тщательно смешивают, затем микропипеткой наносят на каждый квадрат предметного стекла 0,005 мл молока (секрета) и тщательно распределяют на площади квадрата. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или спирт-эфиром (лучше изобутиловым спиртом) в ванночке при вертикальном положении мазка, окрашивают Id-20 минут по Романовскому-Гимза (на I мл дистиллированной воды 1-2 капли краски). Вместо метода гомановскому-Гимза можно окрашивать мазки по Ньюмансу раствором следующего состава: спирт абсолютный - 50 мл, ледяная уксусная кислота - 20 мл,хлороформ -50 мл, фуксин основной - 0,1 г, метиленовая синь - 1,0 г. Краски растворяют в смеси спирта и хлороформа, нагретой до 50°. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют ледяную уксусную кислоту и выдерживают в течение 18 часов, а затем используют для окрашивания. После окрашивания препарат сушат и промывают трехкратно теплой водой (37-40?*). Мазок тщательно высушивают и просматривают под микроскопом. В каждом мазке просматривают 100 полей зрения. Подсчитанное количество клеток умножают на коэффициент для подсчета с учетом объектива и окуляра (для микроскопа МБ-I при объективе 90 и окуляре 7 этот коэффициент равен 6260; при окуляре - 10-10200; при окуляре 15 - 33200).

При содержании соматических клеток в I мл молока от 800 тыс.

- I млн. и более, а также выделении патогенной микрофлоры животное считают подозрительным в заболевании маститом. Окончательный диагноз устанавливают на основании клинических признаков и других тестов (проба с димастином, мастидином и проба отстаивания).

Рецепты питательных сред

Кровяной агар цитратный. (Рецепт I)

Для приготовления кровяного агара у здоровой коровы из яремной вены берут 250 мл крови в стерильную колбу, в которую предварительно вносят 50 мл стерильно приготовленного 5# раствора лимоннокислого натрия. По мере взятия кровь в колбе смешивают с лимоннокислым натрием путем встряхивания. Полученную цитратную кровь проверяют на стерильность путем посева на МЛБ и только после этого используют для приготовления кровяного агара. Нитратная кровь при необходимости может сохраняться в условиях холодильника в течение 10-14 дней. Мясопептонный агар расплавляют в колбе, ватем охлаздают до 45°£и стерильной пипеткой вносят в него 10-15% цитратной крови, равномерно смешивая, после чего разливают в чашки Петри по 1э мл. Застывший агар помещают в термостат при температуре 3?ЧСна 24 часа для проверки на стерильность.

Для приготовления кровяного агара может быть использована также дефибринированная кровь барана.

ДНК-новокаиновый агар (Рецепт 2)

К 150 мл расплавленного стерильного 22-ного МПА. (pH 8,6) добавляют 150мг ДНК, предварительно растворенной в 10 мл (подщелоченной 2 каплями 102-ного раствора едкого натра) дистиллированной воды, и 3 г (22) новокаина.

После перемешивания среду прогревают в течение 30 минут в кипящей водяной бане.

К остывшей до 45-50°С среде добавляют 7-8 мл (52) сыворотки крови крупного рогатого скота и 1,2 мл 102-ного раствора хлористого кальция, перемешивают и разливают в чашки Петри.

Примечание: ДНК-натриевая соль выпускается научно-производственным объединением "Биохимре актив" Латвийской СОР г.Слайне.

Дифференциально-диагностическая среда (Рецепт 3)

На I л дистиллированной воды берут: МПА. - 15 г, пепвон -10 г, j'aaCI - 75 г, маннит - 10 г, фенол-рот - 0,025 г, pH - 7,4.

Агар с ДНК для определения ДНК-азноЙ активности Иафилококков. (Рецепт 4)

К 150 мл расплавленного 2%-ного 1«ША (pH 8,6) добавляют 1б0нг ДНК, растворенной в 10 мл дистиллированной воды, с 2 каплями Южного едкого натрия, среду прогревают 80 мин в кипящей Водяной бане, затем охлаждают до 50-60°0 и добавляют 1,2 мл Ю% -ног о стерильного хлористого кальция и 13-14 мл (8-9$) сыворотки КРС или S мл (5$) дрожжевого экстракта.

Среда Гисса для определения ферментативных овойств стафилококков. (Рецепт 5)

К полужидкой пептонной среде (1% пептона, 0,5% хлорида натрия, 0,15% агар-агара) pH 7,4, после ее расплавления, добавляют 0,5% маннита и 1% индикатора Андреде, перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 30 минут, после чего васлаивают стерильное вазелиновое масло высотой I см.

Среда для стафилококкового фага (Рецепт 6).

Для приготовления I л среды требуются: агар-агара - 12 г, гидролизата Хоттингера - 200 мл, свежей мясной воды - 400 мл, водопроводной воды - 400 мл, глюкозы - 4 г, хлористого кальция - 0,2 г (последний добавляют непосредственно к готовой расплавленной среде перед разливом ее в чашки Петри - 2 мл 10% стерильного раствора).

(Рецепт 7)

Среда Карташовой для выделения стрептококков.

..    стерильного    .    .    ₀    -

К оОО мл готовогоумясо-пептонного бульона добавляют 2,о г

лактозы, I мл спиртово-водного раствора 1:100 бромкрезолпурпура (после растворения I г порошка в 50 мл спирта добавляют 50 мл дистиллированной воды). Колбу со средой ставят в холодную водяную баню доводят до кипения и кипятят 5-7 минут. Охлаждают среду до 50-55°С и добавляют 50 мл сыворотки и 50 ВД/мл неомицина. Среду разливают в стерильные пробирки по 50 мл.

Сывороточно-глюкозовый агар. (Рецепт 8)

МПА - 35 мл

Стернальная сыворотка лошади - 5 мл без консерванта

Глюкоза - I г

pH - 7,4.

Глюкозу вносят в МПА перед стерилизацией. Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 минут. Перед внесением сыворотки агар расплавляют и охлаждают до 459^ вносят асептически сыворотку, перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Глюкозный бульон. (Рецепт 9).

Ь 100 мл МНЕ добавляют I г глюкозы среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 минут. PH среды должен быть 7,2-7,4.

Мясо-пептонный бульон с желчью. (Рецепт 10).

К S0 мл стерильного МПБ, pH 7,4, добавляют асептически 10 мл стерильной бычьей желчи, перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 минут.

Молоко с метиленовым голубым. (Рецепт II).

0,2 г метиленового голубого растворяют в 20 мл горячей дистиллированной воды, раствор пропускают через бумажный фильтр и стерилизуют цри 0,5 атм 20 минут. К стерильному обезжиренному молоку добавляют 1% приготовленного раствора.

Среда КОДА (Рецепт 12)

Среда выпускается в виде порошка Дагестанским НИИ питательных сред и готовится в соответствии с инструкцией.

Среда Олькинипкого. (Рецепт 13).

К 100 мл стерильного питательного агара добавляют I г лактозы, 0,02 г соли ivlopa, 0,03 г гипосульфита, I г сахарозы, 0,1 г глюкозы, I г мочевины и 0,4 мл 0,4^-ного раствора фенолового красного. Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфитом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой - мочевину с углеводами. После растворения все смешивают с агаром и профильтровывают через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 5 дня подряд по 20 минут. Горячую среду скашивают, оставляя столбик высотой 2 см. Среда прозрачная, им~ет красный цвет с коричневым оттенком.

Элективная ди1р1)еренциально-диагносЦ§&6Й5я¹⁴^ среда для выделения и идентификации грибов рода    (ЭДДС).

Элективная дифференциально-диагностическая среда для выделения и идентификации грибов рода    обусловлена    вве-

дением карамели (солод поджаренный при 150-170°0 в течение 2,5 час.), что дает обогащение минерального состава среды.

В качестве субстрата употребляется фильтрат сусла, имеющего углеводов 15-17° ^ по Баллингу, и расплавленный в дистиллированной воде агар-агар.

18-20 г агар-агара растворяют при кипячении в 500 мл дистиллированной воды, затем добавляют до I л фильтрат сусла, имеющего карамели 6-8$. После установления pH 6,6-6,8 среду разливают в колбы и автоклавируют в автоклаве при I атм -15 минут. Лля проверки на стерильность среду ставят в термостат на 24 часа при 37°0. По истечении этого срока ее нагревают до Ю0°С и остывшую до 47-50°0 разливают в чашки Петри или в пробирки. Чашки со средой можно хранить в холодильнике в течение 15-30 дней, защитив от высыхания путем помещения чашек в целлофановые мешки.

Агар Хоттингера.(Рецепт 15).

Ореда из триптического перевара мяса (перевара Хоттингера) с содержанием 120-140 ш% аминного азота и 1-2% агара, pH среды 7,2-7,4.

стрептококков различных серологических групп, эшерихий, синегнойной палочки, грибов рода Съ.

2.3.3.    При первичном обследовании стада, особенно с большим поголовьем или с большим процентом выделения коров с раздражениями вымени, рекомендуется взятые образцы молока с соблюдением правил асептики из реагирующих четвертей вымени, высевать на мясопептонный агар с Ъ% крови крупного рогатого скота. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°J в аэробных условиях в течение 24 часов. В случае отсутствия роста посевы выдерживают еще 24-48 часов.

2.3.4.    Для идентификации выросших культур изучают и культуральные свойства. Крупные выпуклые колонии, вне зависимости от наличия зоны гемолиза, ориентировочно относят к стафилококкам; мелкие р«.синчатые - к стрептококкам; серые круглые колонии блестящие плоские обычно указывают на рост бактерий группы кишечной палочки. Появление колоний с зеленым оттенком дает основание предполагать наличие синегнойной палочки.

Слизистые гладкие или матовые колонии характерны для споровой микрофлоры, что свидетельствует о загрязнении молока при отборе пробы.

2.3.5.    Из колоний, одинаковых по морфологическим свойствам, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При исследовании молока на наличие возбудителей мастита могут быть использованы также элективные среды.

Для выделения золотистого стафилококка - ДНК азно-новокаи-новый агар, солевой агар, для стрептококков - среда Карташовой, для бактерий группы кишечной палочки - среда КОДА, для псевдомонад - лШБ, для грибов рода Ca-acuaY. - среда электиьная дифференциально-диагностическая.

2.3.6.    С целью исключения выделения случайных микроорганизмов, исследование образцов молока через 5-7 дней повторяют с применением элективных сред.

К возбудителям мастита относят бактерии с идентичными культуральными свойствами, которые выделены при повторном исследовании.

2.3.7.    Допускается также производить первичный высев молока при обследовании стад на мастит на вышеуказанные среды в два этапа: в начале на среды для выделения золотистого стафилококка и стрептококков, так как им принадлежит преимущественная роль

Основные дифференцирующие признака некоторых бактерий из семейства    .

Род	f Г !Лактоза! ! ! ! ! ! !	{йетил- .1ндол;рот i !	Ре акция ;Усвое-}0бразо-} Разлояе-; Разложение j {Фогес- рие вание ;ние {желатины {Маннит 5Прос ка-;цитра-j с ерово-j моче вин ы j i {Уэра ;та |дорода j j j
	+ ИЛИ X	+ + реже (-)
	♦	- + или X	+ + + пли <+)
	+	или X	+ + +

Обозначения: + - положительный результат через 24-48 часов; х - запоздалый ши непостоянный положительный результат; (-) - отрицательный результат; (+) - слабоположительная реакция (ферментация углевода слабая, желатина разжижается слабо и т.д.).

при возникновении мастита микробной этиологии. В случае получения отрицательных результатов, пробы высевают через 24 часа на другие питательные среды.

2.3.8. Выделение золотистого стафилококка

2.3.8.1. Для выделения и количественного учета золотистого стафилококка из молока от одного животного (из удоя или отдельных четвертей вымени), а также из сборного молока и молочных продуктов используют ускоренный метод, который основан на применении элективной, дифференциально-диагностической среды - ДНК - ново-каинового агара (рецепт 2).

Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - добавлением натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибо-нуклеазкой активности.

Проведение исследований. Из доставленных проб молока готовят разведения 1:10 и 1:100 на стерильном физиологическом растворе.

В чажу Петри с ДНК - новокаиновым агаром (рецепт 2) вносят 0,1 мл молока из разведения 1:100 и равномерно распределяют стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды.

Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38° в течение 22-24 часов. На ДНК - новокаиновом агаре золотистый стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями.

Для выявления ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл I // раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 минуты, за которые вокруг колоний образуются круглые зоны просветления . Затем кислоту осторожно сливают и приступают к учету результатов исследования. В том случае, если культура стафилококка была выделена на кровяном агаре, то ДНК-азная активность может быть определена путем пересева на ДНК-агар (рецепт4/ Определение ДНК-азной активности может быть проведено при выращивании изолированной культуры.

Учет результатов исследования. Чашки просматривают в проходящем свете. Обнаружение колоний, окруженный зоной просветления

с четкими границами, указывает на наличие в исследуемом материале золотистого стафилококка.

Для определения количества золотистого стафилококка в I мл исследуемого материала подсчитывают колонии с зонами просветления по всей поверхности среды, и полученное число колоний умножают на 10 (т.к. высевали 0,1 мл) и на степень разведения материала.

Например: Высеяно ОД мл молока из разведения 1:100.

В результате подсчета получено 15 колоний. Следовательно в I мл молока - 15000 микробных клеток золотистого стафилококка (15x10x100).

2.3.8.2.    При высеве образцов на кровяной агар учитывают рост выпуклых колоний с гладкой или шероховатой поверхностью, в которых при микроскопии обнаружены грамположительные кокки, расположенные в виде гроздеподобных скоплений, тетрами или одиночно, выделенную культуру относят к стафилококкам и проверяют на каталазную активность. Для этого часть колоний растирают в капле 101-ной перекиси водорода, нанесенной на предметное стекло. Каталаз оположительные стафилококки содержат фермент каталазу, которые при контакте с перекисью водорода образуют интенсивное газообразование. Одновременно по изменению кровяного агара учитывают гемолитические свойства стафилококков. Ка кровяном агаре с эритроцитами крупного рогатого скота растут стафилококки, обладающие oi -гемолитическими свойствами (прозрачная зона вокруг колоний), л -гемолитическими свойствами (матовая зона гемолиза), чаще со смешанным <*. & -гемолизом; иногда зона гемолиза отсутствует.

2.3.8.3.    Для определения плазмокоагуляции стафилококков, делают высев полученной культуры в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 часа выращивания в термостате при 37°0 ставят реакцию плазмокоагуляции с цельной или сухой плазмой крови кролика.

Плазму крови кролика разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульоннную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую - засевают заведомо плазмокоагулирующий стафилококк. Пробирки поме-

щают в термостат при 37°0 и через каждый час в течение трех часов, затем через 18 и 24 часа учитывают результаты.

При положительной реакции плазмокоагуляции образовавшийся сгусток не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.

2Л.8.4. Определение отношения к манниту в анаэробных условиях. 3-4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка высевают в пробирку с 0,15?-ным полужидким агаром, содержащим 0,5? маннита и индикатор Андреде, под вазелиновым маслом (рецепт 5). Посевы инкубируют при температуре 37°С. Результат учитывают через каждые 24 часа. Окончательный результат через 5 суток. Изменение цвета индикатора (появление розового окрашивания) указывает на ферментацию маннита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим характерным признаком для золотистого стафилококка.

2.3.8 Л. Фаготкпирование стафилококка.

Постановка реакции. Поскольку фаги высушивают в объеме 0,1 мл, то при добавлении I мл МПБ (с 0,4? глюкозы и 0,2? 0а01₂) получают основное раззедение 10”*    (1:10).    Из    этого    основного

разведения готовят два рабочих разведения, соответствующие I тест-разведению (ТР) и I00TP. Разведение, соответствующее I ТР, указано на этикетке фага.

Бактериофаги в жидком состоянии следует хранить при температуре 4°С.Основное разведение фагов 10”* при таком способе хранения можно использовать в течение 1,5-2 месяцев. РазЕедение, соответствующее I ТР, следует готовить заново каждые 7 дней из основного разведения 10”*.

Методика фаготипирования. Зуточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера, Мартена или мясо-пептонного бульона (pH 7,2-7,4) и выращивают 3-4 часа при 37° (до появления заметной мути). Одновременно готовят чашки с 1,2?-ным агаром, приготовленным на бульоне Хоттингера, содержащего 200 мг аминного азота, 0,4? глюкозы и 0,02? 0аЛ₂ (рецептб^

По 25-30 гил расплавленного агара разливают в чашки Петри и после застывания его подсушивают 30-40 минут при 37°. Выросшую трехчасовую бульонную культуру стафилококка вносят пастеровской пипеткой в чашки и орошают поверхность агара. Избыток культуры отсасывают пипеткой и удатяют, агар вновь подсушивают 30-40 минут при 37°.

Дно засеянной чашки расчерчивают карандашом на квадраты по трафарету соответственно числу используемых фагов и в каждый квадрат засеяннной среды пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом вертикально наносят каплю соответствующего фага. Один квадрат оставляют для контроля без фага. После нанесения каждого фага пастеровскую пипетку выбрасывают. После подсыхания капель фага чашки переворачивают вниз и инкубируют 5-? часов при температуре 37°, а затем оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре. Для нанесения (фагов на чашки с агаром может быть использован специальный аппарат для фаготилирования стафилококков. Аппарат состоит из 25 металлических стержней, вмонтированных в квадратную пластинку, соединенную с поршнем. Основанием прибора служит площадка из органического стекла, на которой находится свободно передвигающаяся вторая площадка с гнездом для фиксирования засеваемой чашки и пластинки из (фторопласта с резервуаром для фагов. В резервуары стернальной фторопластовой пластинки, помещенной в стерильную чашку Петри, наливают по 3-5 капель фагов (всегда в одном порядке). Чашку с агаром и пластинку с фагами помещают на подвижную пластинку. Поочередным передвижением площадки устанавливают под металлическими стержнями скачала пластинку с фагами, а затем чашку с агаром. Опуская и поднимая стержни с помощью поршня, переносят капли фагов на чашку с агаром, едва касаясь его поверхности. Чашки меняют в зависимости от числа типируемых культур.

Чашки с фагами оставляют на столе на 30-40 минут и затем их орошают 4-чаоовой бульонной культурой стафилококков. После подсыхания культур чашки переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30°С или 5-6 часов при 37°С и оставляют до следующего утра при комнатной температуре.

Фаготилирование штаммов начинают с I ТР (тест-разведения). Штаммы, которые не лизировались хотя бы одним фагом, на следующий день типируют повторно со 100 ТР.

Учет и регистрация результатов. Степень лизиса культуры разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме : (++++) - сливной полный лизис, (+++) - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса), (++) - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 пятен лизиса, (+) - от 20 до 50 пятен лизиса, (-) - полное отсутствие лизиса. Для упрощения схемы учета степени лизиса обозначения ++++, +++, ++ и называемые "сильной реакцией", можно регистрировать одним обозначением ++.

Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал оильную реакцию. Если при типировании культуры фагом I 1Р получе-ны только слабые реакции или лизис полностью отсутствует, то такой штамм тилируют повторно фагом в 100 ТР или считают нетипируе-мым, (если его типировали 100 ТР). Результаты типирования регистрируют, записывая против названия штамма разведение фагов, с помощью которых был получен положительный результат (I ТР или 100 ТР), а также номера фагов, обусловивших сильную реакцию. Отдельно в скобках следует записать наличие слабых реакций, если таковые имелись.

Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику.

Если культуры стафилококка при типировании в один и тот же день дают мозаики, различающиеся на одну сильную реакцию, их следует считать идентичными; если разница составляет две и более сильные реакции, штаммы следует признать разными.

2.3.8.б.Оценка результатов.

Стафилококки, обладающие гемолитической активностью, плазмокоагулирующими свойствами, разлагающие маннит в аэробных и анаэробных условиях, фаготитруемые относят к золотистым - Mtyfi зим

Срок лабораторного исследования идентификации стафилококков - 3 дня, при необходимости фаготипирования и определения отношения к манниту - 5 дней.

2.3.9. Выделение стрептококков.

2.3.9.1.    Для выделения стрептококков используют среду Карташовой (рецепт 7), на которую высевают I мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровяном агаре росинчатые колонии. После 18-24 часов инкубирования посевов при 37°С из пробирок с измененным цветом среды делают мазки и окрашивают их по Граму.

2.3.9.2.    Одним из отличительных признаков бактерий рода стрептококков от стафилококков является каталазная активность. Стрептококки - каталазоотрицательные, не содержат фермент-каталазу. Для определения каталазной активности исследуемую культуру отвивают на косячок сывороточного агара (рецепт 8), выращивают в течение 24-48 часов. Выросшую культуру снимают петлей и растирают в капле Ю#-ной перекиси водорода (перегидроль разводят в соотношении 1:3) на предметном стекле. Выделение газа, в отличие от стафилококков, у стрептококков не наблюдается.

2.3.9.3.    Наличие гемолитических свойств стептококков определяют путем посева на кровяной агар (рецепт I), который используют одновременно и для определения гемолитических свойств стафилококков. Большинство выделяемых из молока стрептококков дают непрозрачную (матовую) зону гемолиза. Дальнейшую идентификацию стрептококков ведут по таблице (приложение 2). Для определения свойств устойчивости к желчи культуру стрептококков выращивают предварительно на МПБ с I# глюкозы (рецепт 9), а затем вносят I мл культуры в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего 40$ желчи (рецепт 10) и ставят в термостат при температуре 37°£на

24 часа. Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, помутнение - на рост. Терглорезистентность стрептококков определяют путем прогрева бульонной культуры стрептококка при 60^ в течение 30 минут. Пробирки с бульонной культурой ставят в водяную баню с указанным температурным режимом. После прогрева культуру высевают на МПБ и инкубируют в термостате в течение 24-48 часов. Наличие роста в бульоне указывает на терморезистент -ность культуры. Кроме того, проверяется способность роста на МПБ с содержанием 0,5$ сорбита и на МПБ с pH 9,6.

2.3.9.4.    Для определения способности культуры обесцвечивать метиленовый голубой производят посев культуры в пробирку с молоком, содержащим этот индикатор в концентрации 1:1000 (рецепт

II). Посевы инкубируют в термостате в течение 24 часов при температуре 37°0.

2.3.9.5.    Постановка КАМП-теота. Оуточкую культуру ь -гемолитического стафилококка высевают на агар с 5$ крови 1фупного рогатого скота (рецепт I). Посев делают петлей сплошной линией

по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мгл, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить ^-10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37 £. КАЫЛ-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне ^-гемолитического стафилококка. При необходимости серологической идентификации выделенных штаммов стрептококков, последние

направляют в научно-исследовательские учреждения.    ₀

.    ния    ^

Опенка результатов исследований производится по таблице прйл^

Срок лабораторного исследования на стрептококк - 3 дня.

2..3.10. Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП)

Образцы молока или колоний о кровяного агара, морфологические свойства которых напоминают БГКД, высевают на среду КОДА (рецепт 12) и помещают в термостат при 37^3на 24 часа. Изменение цвета среды из фиолетового в зеленый свидетельствует о наличии в пробах молока БГКП. Для идентификации бактерий рода эшери-хий производят посев из пробирок с измененным цветом на среду Зиммонса (цитратный тест) и пептонную воду (для реакции на индо-лообразование). Ка среде Симмонса эшерихии не растут, а следовательно не изменяют цвета. При определении индолообразования покраснение фильтровальной бумажки, пропитанной реактивом Зрлиха-Бомэ, находящейся в пробирках с посевами на пептонной воде, свидетельствует о наличии эшерихий, в классической реакции - образование розового (индольного) кольца на границе двух жидкостей: эфирной вытяжки и реактива Зрлиха-Еомэ.

Посевом со среды КОДА на среду Олькеницкого (рецепт 13) можно идентифицировать эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея.

Посев на среду Олькеницкого в пробирках производят петлей по поверхности скоса среды и внутрь столбика. Посевы культивируют в термостате при 379?в течение 24 часов. Изменение цвета (глюкоза + лактоза +) столбика и скоса среды Олькеницкого из красного в желтый цри отсутствии почернения внутри столбика свидетельствует о росте бактерий из рода эшерихий. Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина +) и почернение внутри столбика (сероводород +) указывает на рост протея. Изменение скоса в красный, столбика в желтый цвет и почернение внутри столбика указывает на рост салылонелл.

Б случае необходимости дальнейшей идентификации БГКП следует пользоваться таблицей приложения 3. Зрок лабораторного исследования - 3 дня.

2.3.II. Выделение рЩ(сСо»^о^л

Образцы молока или колонии с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при 379?в течение 24-48 часов. Появление сине-зеленого окрашивания МПБ и МПА, рост гладких плоских колоний с ровными или изрезанными краями указывает на рост синегнойной палочки.    -.avow    вырабатывает    си

не-зеленый пигмент пиоционин, за счет которого происходит окра-