Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

1.2. ОБЩИН ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка мутагенной активности пестицидов

Методические указания МУ 1.2.3364—16

Издание официальное

Москва *2016

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

1.2. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка мутагенной активности пестицидов

Методические указания МУ 1.2.3364—16

цидной нагрузки целесообразно применение методов учета хромосомных аберраций, оценки повреждений ДНК в лимфоцитах периферической крови человека и учет микроядер в клетках буккального эпителия.

Изучение генетической активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов требует профессиональной подготовки.

Данные методические указания описывают комплексную систему проверки генетической активности пестицидов, но не являются пособием для освоения методов. Последние в должном объеме можно освоить только в результате стажировки в лабораториях соответствующего профиля. Дополнения и уточнения регламента выполнения рекомендованных методов и трактовка экспериментальных результатов описаны в соответствующих разделах.

4.2. Принципы отбора пестицидов, препаративных форм и

их компонентов для испытания на мутагенную активность

Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые оригинальные действующие вещества и дженерики пестицидов, которые могут быть использованы как гербициды, инсектициды, нематоциды, акарициды, фунгициды, репелленты, регуляторы роста растений и др., созданные химическими, биотехнологическими, генно-инженерными и иными способами, включая полученные из сырья природного происхождения, а также их препаративные формы и отдельные компоненты препаративных форм. Новые фиксированные комбинации пестицидов, планируемые для широкого применения в сельском хозяйстве, при структурном сходстве компонентов комбинации с известными канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также подвергаются испытанию. Для анализа структурного сходства используют, во-первых, представительную базу данных о мутагенных свойствах широкого круга химических соединений и, во-вторых, специальные компьютерные программы.

5. Пути введения пестицидов, выбор доз, объекты исследования

5.1. Исследования in vivo

Пути введения исследуемого пестицида или препаративной формы in vivo должны соответствовать основным путям поступления их в организм.

Как правило, пестициды изучают при внутрижелудочном пути введения млекопитающим. Изучение мутагенной активности аэрозольных, фумигантных форм или мазей и т. п. проводят в условиях предполагае-

МУ 1.2.3364—16

мого применения (ингаляционный, накожный) и/или при парентеральном введении (внутрибрюшинный, внутримышечный или подкожный пути введения).

Исследуемые пестициды растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Водонерастворимые препараты вводят с твином-80 или используют растворители (этиловый спирт, растительное масло, диметилсульфоксид в конечной концентрации до 5 %); для перорального введения порошкообразных пестицидов можно использовать растительное масло или 0,5—1,0 %-й водный раствор крахмала или ме-тилцеллюлозы. Следует использовать свежеприготовленные растворы исследуемого вещества, пока не будет доказана стабильность растворов вещества при хранении.

Оптимальный объем вводимых растворов изучаемых средств и соответствующих растворителей (для контрольных групп животных) должен составлять при пероральном (внутрижелудочном) и внутрибрю-шинном способах введения не более 1 мл на 100 г массы тела млекопитающих. Допустимо при испытании водных растворов вводить по 2 мл на 100 г массы тела. При внутримышечном введении объем раствора не должен превышать 0,2 мл.

При испытании веществ, которые вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях, вводимые объемы должны быть минимизированы и должны быть одинаковыми на всех уровнях доз.

Выбор доз для исследований определяется на основе результатов оценки острой токсичности и биологической эффективности вещества.

При исследовании мутагенности тестируют не менее 3 доз, которые различаются в 2—4 раза. В случае, когда исследуемое вещество малотоксично, максимальная доза составляет 2 000 мг на кг массы тела в сутки. Если тестируемое вещество является токсичным, то диапазон испытываемых доз определяется по результатам оценки токсичности вещества и должен находиться в диапазоне от максимально переносимой дозы (МПД) до минимально токсичной или не вызывающей токсичности дозы. МПД определяют как дозу, вызывающую слабые токсические эффекты (например, такие клинические признаки как аномальное поведение или реакции, небольшая потеря массы тела или цитотоксичность в ткани-мишени), но не вызывающую гибель животного или явные признаки боли, страдания, которые требуют эвтаназии (если при повышении уровня доз при том же режиме затравки ожидается летальный эффект). Низшая доза определяется как минимально действующая или не действующая в токсикологическом эксперименте. Средняя доза рассчитывается как равноудаленная между максимальной и минимальной.

11

В эксперименты включают положительные и отрицательные контроле В качестве положительного контроля служат вещества с известной мутагенной активностью. Отрицательным контролем, как правило, служит растворитель или наполнитель, в котором вводят вещество. Данные контролей следует использовать для установления пределов колебаний исторического контроля. Такие оценки необходимы для решения вопроса об адекватности соответствующих негативных/позитивных контролей в эксперименте.

Изучение цитогенетической активности можно проводить в рамках исследований хронической токсичности. Образцы для исследований мутагенной активности можно получить во время забоя животных для патолого-анатомического исследования.

В исследованиях, в которых предполагается более полное исследование зависимости «доза-ответ», используют дополнительные уровни доз. Возможна корректировка доз в случае наличия специфичных токсикологических эффектов в отношении определенных органов-мишеней.

Проведение экспериментов in vivo диктует необходимость применения генетически однородных животных. При этом использование мышей предпочтительнее, однако не исключено применение других видов. Животных содержат в соответствии с действующими санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), на стандартной диете, при 12-часовом световом режиме, в условиях свободного доступа к воде и пище.

Общие клинические наблюдения за здоровьем животных следует проводить по меньшей мере один раз в день в одно и то же время.

Полученных из питомника животных рандом из ированно распределяют в группы по 5—10 особей (но не менее 5 особей на группу), до использования в эксперименте они находятся в карантине и проходят акклиматизацию в течение 7—14 дней. Во избежание большого разброса оцениваемых показателей необходимо использовать генетически однородных животных, отклонение по массе тела и возрасту которых на момент эксперимента не превышает ± 20 %. Обработке следует подвергать половозрелых самцов и самок. Обычно в эксперименте проводят введение изучаемых веществ в течение 1—5 дней.

5.2. Исследования in vitro

Основными критериями при выборе максимальной концентрации вещества в случае исследований in vitro являются цитотоксичность, растворимость, изменение pH или осмотической концентрации. Цитотоксичность может быть определена в основном эксперименте в вариантах

МУ 1.2.3364—16

с метаболической активацией и без нее с использованием в качестве показателей эффективности клонирования (выживаемости) или относительного общего роста. Полезно определить цитотоксичность и растворимость в предварительном эксперименте. Следует использовать по меньшей мере 4 концентрации. При наличии цитотоксичности концентрации должны быть в диапазоне от максимальной до минимальной по токсичности или до отсутствия токсичности. Шаг между концентрациями составляет от 2 до \ 10. Максимальная концентрация, выбранная на основании цитотоксичности, должна приводить к уровню относительной выживаемости (относительной эффективности клонирования) или относительного общего роста приблизительно 10—20% (но не меньше 10%). Для нецитотоксичных веществ максимальные концентрации должны соответствовать наименьшей, выбранной из 2 мг/мл, 2 мкл/мл или 0,01 М. В случае исследования вещества неизвестного состава, сложных смесей или экстрактов биологических материалов наибольшая исследуемая концентрация при отсутствии цитотоксичности должна быть увеличена (например, до 5 мг/мл или 5 мкл/мл), чтобы повысить концентрации каждого компонента. При проведении бактериальных тестов рекомендуемая максимальная концентрация для растворимых нецитотоксичных веществ составляет 5 мг на чашку или 5 мкл на чашку. Малорастворимые вещества следует тестировать в тех концентрациях, при которых достигается их растворимость в культуральной среде. Преципитат не должен мешать анализу результатов.

6. Методы оценки мутагенности пестицидов

6.1. Мутационный тест на Salmonella typhimurium и Escherichia coli (тест Эймса)

6.1.1. Цель исследования и принцип метода

Данный метод предназначен для выявления способности химических (биологически активных) веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium и Escherichia coli.

Пестициды с выраженной антибактериальной активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно.

Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации или без метаболической активации. После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов и сравнивается с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативно-

13

го контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем).

Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависи-мых индикаторных штаммов.

6.1.2. Процедура тестирования Бактерии

В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella typhimurium: ТА 1535; ТА1537 или ТА97, или ТА97а; ТАЯ8; ТА100; ТА102; Escherichia coli WP2 uvrA или Escherichia coli WP2 uvrA (pKMIOl). В эксперименте используют не менее 5 штаммов.

Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ревертан-тов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.

Для исследования могут быть использованы готовые тестовые наборы.

Потребность аминокислоты для роста следует проверять для каждой замороженной исходной культуры (гистидин для Salmonella typhimurium и триптофан для Escherichia coli). Также должны быть проверены другие фенотипические характеристики: присутствие или отсутствие плазмид /^-фактора для соответствующих штаммов (резистентность к ампициллину у штаммов ТА98_У ТА100 и ТА97а или ТА97, WP2 uvrA и WP2 uvrA {pKMIOl) и резистентность к ампициллину + тетрациклину у штамма ТА 102); присутствие специфических мутаций (^-мутаций у штаммов Salmonella typhimurium по контролю чувствительности к кристаллическому фиолетовому и wvM-мутации у Escherichia coli или wvr^-мутации у Salmonella typhimurium по контролю чувствительности к ультрафиолетовому свету).

Свежие культуры бактерий должны быть выращены до состояния поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы роста (приблизительно 10⁹ клеток на 1 мл). Культуры в поздней стационарной фазе не используются. Необходимо, чтобы культуры, используемые в эксперименте, содержали высокий титр жизнеспособных бактерий. Рекомендуемая температура инкубации: 37 °С.

Метаболическая активация

В качестве экзогенной метаболической активации обычно используется фракция S9 печени крыс, предварительно обработанных арохло-ром 1254 (35 мг/кг, один раз в сутки в течение 5 суток), смесью полихлорированных бифенилов (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за

14

МУ 1.2.3364—16

5 суток до забоя). Постмитохондриальную фракцию обычно используют в диапазоне концентраций от 5 до 30 объемных процентов смеси S9.

Изучаемые концентрации

Максимальная концентрация тестируемого соединения определяется его токсичностью и растворимостью, которые следует определить в предварительном эксперименте. Нерастворимость выявляется как преципитация в конечной смеси в реальных условиях, выявляемая невооруженным глазом. Цитотоксичность можно оценить по снижению числа колоний ревертантов на чашку, отсутствию или уменьшению фонового газона или степени выживаемости обработанных культур. Цитотоксичность вещества может меняться в присутствии системы метаболической активации.

Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная доза может быть в пределах 1 ООО—5 ООО мкг на чашку. Для тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна подавлять рост бактерий не более, чем на 50 %, что определяется либо по уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению роста бактериального газона. В любом случае следует проверять не менее 5 различных доз тестируемого соединения с шагом приблизительно в половину log (V10) между тестируемыми точками для начального эксперимента. Меньшие интервалы могут быть использованы в тех случаях, когда исследуют зависимость концентрация-эффект.

Контроли

В каждом эксперименте обязательно одновременное использование негативного (наполнитель без обработки веществом) и позитивного кон-тролей. В качестве позитивных контролей в случае с метаболической активацией используют 9,10-диметилантрацен, 7,12-диметилбенз[а]ан-трацен, бенз[а]пирен, 2-аминоантрацен, циклофосфамид, моногидрат циклофосфамида, а в качестве позитивных контролей в вариантах без метаболической активации используют азид натрия, 2-нитрофлуарен, 9-аминоакридин, ICR 191, гидропероксид кумена, митомицин С, А^-этил-АА нитро-А^-нитрозогуанидин, 4-нитрохинолин-1-оксид, фурилфурамид (AF2).

В качестве растворителя используются дистиллированная вода или диметилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители, которые не являются цитотоксичными и не обладают мутагенной активностью.

Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тес-терного штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной метаболической активации.

15

ББК51.2

0-93

0-93 Оценка мутагенной активности пестицидов: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016.—49 с.

ISBN 978—5—7508—1495—4

1.    Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (академик РАН, профессор

B.    Н. Ракитский; д.б.н., профессор Ю. А. Ревазова; к.б.н. Н. А. Илюшина; к.б.н. О. В. Егорова; д.м.н., профессор Т. А. Синицкая; д.м.н., профессор Е. Г. Чхвиркия); ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина» (д.м.н., профессор В. С. Журков; д.б.н., профессор Л. П. Сычева); ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В. В. Закусова» (профессор. член-корр. РАН, А. Д. Дурнев, к.б.н. А. К. Жанатаев); ФГБУН «Институт общей генетики им. Н. В. Вавилова» РАН (д.б.н., профессор

C.    К. Абилев).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 4 июля 2016 г. и введены в действие с момента утверждения.

4.    Введены впервые.

ББК51.2

ISBN 978—5—7508—1495—4

© Роспотребнадзор, 2016 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016

МУ 1.2.3364—16

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................4

2.    Нормативные ссылки.............................................................................................5

3.    Термины и определения.........................................................................................6

4.    Оценка мутагенной активности пестицидов........................................................8

4.1.    Описание системы оценки мутагенной активности.....................................9

4.2.    Принципы отбора пестицидов, препаративных форм и их компонентов

для испытания на мутагенную активность..................................................10

5.    Пути введения пестицидов, выбор доз, объекты исследования........................10

5.1.    Исследования in vivo.....................................................................................10

5.2.    Исследования in vitro....................................................................................12

6.    Методы оценки мутагенности пестицидов.........................................................13

6.1.    Мутационный тест на Salmonella typhimurium и Escherichia coli

(тест Эймса)...................................................................................................13

6.2.    Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих.... 18

6.3.    Оценка хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro......22

6.4.    Учет микроядер в клетках млекопитающих in vivo....................................27

6.5.    Учет микроядер в клетках млекопитающих in vitro...................................30

6.6.    Оценка ДНК-повреждающей активности in vivo методом ДНК-комет

в щелочной версии........................................................................................37

6.7.    Оценка ДНК-повреждающей активности in vitro методом ДНК-комет

в щелочной версии........................................................................................43

Заключение................................................................................................................47

Библиографические данные.....................................................................................49

3

МУ 1.2.3364—16

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

4 июля 2016 г.

1.2. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Оценка мутагенной активности пестицидов

Методические указания МУ 1.2.3364—16

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок проведения комплексной оценки мутагенной активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов согласно требованиям отечественных и международных нормативных правовых документов.

Методические указания предназначены для использования при токсиколого-гигиенической оценке пестицидов для установления класса опасности по показателю «мутагенность» и разработке мер по предотвращению их неблагоприятного влияния на здоровье населения и повышению надежности разрабатываемых гигиенических нормативов и регламентов применения пестицидов.

Методы оценки мутагенной активности пестицидов применимы в случаях:

-    регистрации и перерегистрации пестицидов;

-    изменения состава или вида препаративной формы;

-    разработки гигиенических нормативов и регламентов применения;

-    проведения эпидемиологических исследований в регионах с повышенной пестицидной нагрузкой.

Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также научно-исследовательских

4

МУ 1.2.3364—16

организаций, лабораторий и кафедр гигиенического профиля, занимающихся оценкой опасности пестицидов на всех этапах их обращения и гигиеническим нормированием пестицидов в объектах окружающей среды.

2. Нормативные ссылки

2.1.    Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (с изменениями и дополнениями).

2.2.    Федеральный закон от 19 июля 1997 г. № 109-ФЗ «О безопасном обращении с пестицидами и агрохимикатами» (с изменениями и дополнениями).

2.3.    Федеральный закон от 21 июля 2012 г. № 126-ФЗ «О ратификации Протокола присоединения Российской Федерации к Маракешскому соглашению об учреждении Всемирной торговой организации» от 15 апреля 1994 г. с приложениями.

2.4.    Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утвержденные Решением Комиссии Таможенного союза от 28 мая 2010 г. № 299.

2.5.    Постановление Правительства Российской Федерации от 28 сентября 2009 г. № 761 «Об обеспечении гармонизации российских санитарно-эпидемиологических требований, ветеринарно-санитарных и фитосанитарных мер с международными стандартами».

2.6.    Санитарные правила и нормативы СанПиН 12.2584—10 «Гигиенические требования к безопасности процессов испытаний, хранения, перевозки, реализации, применения, обезвреживания и утилизации пестицидов и агрохимикатов, утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 2 марта 2010 г.

2.7.    Приказ Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 10 июля 2007 г. №357 «Об утверждении Порядка государственной регистрации пестицидов и агрохимикатов».

2.8.    Руководство Р 1.2.3156—13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека», утвержденное Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 2013 г.

2.9.    ГОСТ 32376-2013 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки обратных мутаций на бактериях», введенный в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 805-ст.

5

2.10. ГОСТ 32635-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro», введен в действие 01.06.2015.

3. Термины и определения

Аберрации хроматидного типа - структурные нарушения на уровне одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные обмены.

Аберрации хромосомного тина - структурные нарушения на уровне идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты и хромосомные обмены.

Анеуген - любое соединение, которое, взаимодействуя с компонентами цикла деления митотических и мейотических клеток, приводит к анеуплоидии в клетках или организмах.

Анеуплоидия - любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).

Ахроматические пробелы (гепы) - определяемые визуально нарушения целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширины и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.

Длина хвоста - показатель поврежденности ДНК, определяемый расстоянием между концом профиля головы и концом профиля хвоста.

Индекс пролиферации при блоке цитокинеза (СВРГ) - доля клеток второго деления в обработанной популяции относительно контроля без обработки.

Индекс репликации (RI) - доля завершенных циклов клеточного деления в обработанных культурах по отношению к культурам без обработки в течение периода экспозиции и восстановления.

Кластоген - любое соединение, которое вызывает структурные хромосомные аберрации в популяции клеток или организмов.

Комета - структура, формируемая ДНК клетки, лизированной в агарозном геле, под действием электрического поля.

Метод ДНК-комет (гель-электрофорез отдельных клеток) - метод регистрации первичных повреждений ДНК на уровне ДНК отдельных клеток/ядер.

Микроядерный тест - определение частоты клеток с микроядрами и числа микроядер на клетку.

Микроядра - небольшие ДНК-co держащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии

6

МУ 1.2.3364—16

ана- и телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественые микроядра в цитоплазме.

Митотический индекс - отношение числа клеток в метафазе к общему числу клеток в наблюдаемой клеточной популяции; показатель клеточной пролиферации в данной популяции.

Момент хвоста - показатель поврежденности ДНК, определяемый произведением процента ДНК (%ДНК) в хвосте и длины хвоста ДНК-кометы.

Момент хвоста по Оливе - показатель поврежденности ДНК, определяемый произведением %ДНК в хвосте и расстояния между центрами плотности головы и хвоста ДНК-кометы.

Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации типа замены пар оснований в молекуле ДНК. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте исходной мутации, или в другом сайте хромосомы.

Мутагены, индуцирующие мутации типа сдвига рамки считывания - агенты, вызывающие вставку или делению одной или нескольких пар оснований в молекуле ДНК.

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма.

Нормохроматофильный эритроцит - (син. нормохроматофил, НХЭ) зрелый эритроцит, окрашивается в красновато-розовый цвет.

Относительное увеличение количества клеток {RICC) - увеличение числа клеток в опытных культурах относительно увеличения числа клеток в контрольных культурах в процентах, показатель цитотоксичности в методиках, при которых нс используют цитохалазин В.

Относительное удвоение популяции клеток (RPD) - удвоение популяции в опытных культурах относительно удвоения популяции в контрольных культурах в процентах, показатель цитотоксичности в методиках, при которых не используется цитохалазин В.

Полихроматофильный эритроцит - (син. полихроматофил, ПХЭ) незрелый эритроцит, цитоплазма которого вследствие неполного насыщения ее гемоглобином окрашивается одновременно как кислыми, так и основными красителями, приобретая серо-фиолетовый цвет.

Пролиферативный индекс (РГ) - процент делящихся клеток, показатель цитотоксичности в методиках, при которых не используется цитохалазин В.

7

Процентное содержание ДНК в хвосте (%ДНК в хвосте) - показатель поврежденности ДНК, определяемый отношением интенсивности флуоресценции хвоста к общей интенсивности флуоресценции ДНК-кометы в процентах.

Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.

Эндоредупликация - удвоение хромосом в интерфазе, не сопровождающееся митотическим делением. В следующем цикле в ядре могут обнаруживаться диплохромосомы, состоящие из четырех хроматид.

4. Оценка мутагенной активности пестицидов

Применение химических средств защиты растений может быть одной из причин интенсивного роста химического загрязнения окружающей и производственной среды. Проблема оценки степени опасности пестицидов является одной из ключевых проблем при проведении предупредительного и текущего санитарного надзора, при внедрении и дальнейшем применении новых препаратов.

Пестициды различных групп характеризуются рядом особенностей, в том числе высокой биологической активностью, преднамеренностью их внесения в окружающую среду, неизбежностью циркуляции в ней, возможностью контакта широких слоев населения с остаточными количествами пестицидов. Среди неблагоприятных воздействий особое место занимает потенциальная мутагенность действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов. Поэтому важной задачей является предотвращение неблагоприятного мутагенного действия пестицидов на здоровье населения. В связи с этим анализ мутагенной активности пестицидов и их основных метаболитов является обязательной составной частью их токсиколого-гигиенической оценки при установлении класса опасности (СанПиН 1.2.2584—10) и прогнозировании возможных отдаленных эффектов, а также для обеспечения надежности разрабатываемых гигиенических нормативов и регламентов применения пестицидов.

В оценке биологического действия пестицидов большое значение имеют чувствительность, специфичность и доступность методов, с помощью которых можно в довольно короткие сроки изучить мутагенную активность действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их отдельных компонентов.

В соответствии с действующим порядком государственной регистрации пестицидов и агрохимикатов предусмотрена оценка индукции

8

МУ 1.2.3364—16

генных, хромосомных и/или геномных мутаций с помощью методов, соответствующих международным стандартным протоколам. Для определения способности пестицидов индуцировать мутации разных типов необходимо использование комплекса методов, выполняемых на разных тест-объектах.

В методических указаниях впервые представлена гармонизированная с международными требованиями комплексная система проверки генетической активности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов на этапе токсикологических исследований на различных тест-объектах в опытах in vitro и in vivo для установления класса опасности по данному признаку вредности в соответствии с гигиенической классификацией пестицидов и агрохимикатов по степени опасности (СанПиН 1.2.2584—10) и разработки гигиенических нормативов содержания пестицидов в объектах окружающей среды с учетом мутагенности для обеспечения их безопасного обращения.

4.1. Описание системы оценки мутагенной активности

Изучение мутагенности действующих веществ пестицидов, препаративных форм и их компонентов наряду с другими возможными отдаленными последствиями (эмбриотоксичность и тератогенность, репродуктивность, канцерогенность) проводят на этапе токсикологических исследований. Эта работа предусматривает оценку способности пестицидов к индукции мутаций разных типов и делает необходимым использование для оценки мутагенных свойств комплекса методов, выполняемых на разных тест-объектах. Основой создания предлагаемой системы оценки мутагенности является опыт работы отечественных исследователей по тестированию мутагенности пестицидов, накопленный с момента выхода первых отечественных методических рекомендаций, а также существующие в настоящее время международные регламенты проведения экспериментальных работ.

В батарею тестов анализа мутагенности пестицидов и компонентов препаративных форм следует включать методы оценки индукции генных мутаций (тест Эймса), методы оценки цитогенетических повреждений (учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках in vivo или in vitro) и методы оценки повреждений ДНК (метод гель-электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет) in vivo и in vitro).

Все перечисленные методы в рамках каждого изучаемого типа генетических нарушений являются взаимозаменяемыми, что соответствует современным международным требованиям и подходам. В случае проведения эпидемиологических наблюдений в зонах высокой пести-

9